Summary
Vi presenterer en protokoll på hvordan man kan utnytte høy gjennomstrømming cryo-electron tomography å bestemme høy oppløsning in situ strukturer av molekylære maskiner. Protokollen tillater store mengder data som skal behandles, unngår vanlige flaskehalser og reduserer ressurs nedetid, slik at brukeren kan fokusere på viktige biologiske spørsmål.
Introduction
Type III sekresjon systemer (T3SS) er viktige virulens determinants for mange Gram-negative patogener. Den injectisome, også kjent som p-komplekset, er den sentrale T3SS maskinen som er nødvendig for direkte translokasjon av effektor-proteiner fra bakterien i eukaryote vertsceller 1, 2. Den injectisome omfatter en ekstracellulær nål, en basal legeme, og en cytoplasmisk kompleks også kjent som sortering kompleks tre. Tidligere studier har belyst 3-D strukturer av rensede injectisomes fra Salmonella og Shigella, sammen med atomstruktur i større basal kroppsproteiner 4, 5. Nylige in situ strukturer av injectisomes fra Salmonella, Shigella, og Yersinia ble åpenbart av kryo-ET 6 , 7. Imidlertid cytoplasmatiske kompleks, avgjørende for valg effektor og nålanordning har ikke blitt visualisert i disse strukturer.
Cryo-ET er most egnet teknikk for å avbilde molekylære maskiner på nanometer oppløsning innenfor sitt opprinnelige cellulære kontekst (in situ). Likevel er den oppnåelige oppløsningen av kryo-ET begrenset av prøvetykkelse. For å overvinne den ulempen, vi avbildes intakte injectisomes i en ondartet Shigella flexneri stamme som ble genmodifisert til å produsere minicells tynne nok for kryo-ET. En annen begrensning av cryo-ET er følsomheten av prøven for stråling indusert av elektronstrålen, som meget raskt ødelegger informasjon med høy oppløsning i prøven. Som et resultat, er ekstremt lave doser som brukes for individuelle tilt-bilder, slik at en passende dosering kan bli fordelt på hele tilt-serien. Dette reduserer i stor grad signal-til-støy-forhold (SNR) i den endelige rekonstruksjon, noe som gjør det vanskelig å skille de strukturelle trekk av emnet fra den store mengden av støy i tomogram og begrenser oppløsningen som kan oppnås ved cryo- ET. Conventional bildebehandling for eksempel Fourier og real-space filtre, så vel som nedover sampling kan brukes til å øke kontrasten, men på bekostning av å filtrere ut mye av den informasjon med høy oppløsning. Nylig har sub-tomogram midling gjort det mulig å øke den SNR og deretter den endelige oppløsning i noen tilfeller til under nanometer nivåer 8, 9. En mer detaljert analyse av kompleksene er gjort mulig ved beregningsmessig å ekstrahere flere tusen under tomograms innehold de områder av interesse fra den opprinnelige tomograms og deretter samkjøre og gjennomsnitt under tomograms å bestemme in situ komplekse strukturer med høyere SNR og høyere oppløsning. Disse metodene kan integreres med genetiske metoder for å gi enda større innsikt i makromolekyl forsamlinger og deres dynamiske conformations i morsmobil sammenheng.
Generelt titalls eller hundrevis av tusen under tomograms må i gjennomsnitt for å bestemme høy-Oppløsning strukturer in situ. Oppkjøpet av et tilstrekkelig antall tilt-serien nødvendig for å produsere dette stort antall under tomograms blir fort en flaskehals. Den resulterende vippeserien er ofte påvirket av stråleinduserte skift, trinnet tilbakeslag, samt forstørrelse, rotasjon og skew defekter, som må løses for å bringe vippe-serien til innretting før rekonstruksjon. Tilt serien er vanligvis justert av sporingsgull fiducial markører, som er tradisjonelt valgt manuelt gjennom inspeksjon av tilt-serien, forårsaker enda en flaskehals. Mange programvarepakker som er utviklet for automatisk tilt-serie oppkjøp gjennom datastyrte elektronmikroskop 10, 11, 12, tilt-serien justering og gjenoppbygging 13, 14 og sub-tomogram gjennomsnitt 15-18. Ettersom disse pakkene håndtere adskilte operasjoner i arbeidsflyten av cryo-ET, blir det ønskelig å bygge opp et høyere abstraksjonsnivå inn i prosessen for å systematisk effektivisere hele ordningen til en enkelt rørledning. Derfor har vi utviklet en programvare wrapper bibliotek "tomoauto" utviklet for å organisere en rekke av disse pakkene i en enkelt semi-automatisert enhet, noe som åpner for enkel bruker drift samtidig opprettholde fulle konfigurasjon av hver komponent i en sentralisert måte. Biblioteket er open-source, godt dokumentert, kontinuerlig utviklet og fritt tilgjengelig for bruk, skreddersydd utvikling eller ytterligere integrering ved hjelp av en elektronisk fjern kildekode repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Dette high-throughput cryo-ET rørledningen har blitt benyttet for å visualisere intakte injectisomes i S. flexneri minicells. Totalt 1,917 tomograms ble generert ved hjelp av denne metoden, avslører en høy oppløsning in situ strukturen intakt maskin inkludert cytoplasma sortering plattformen bestemmes av sub-tomogram gjennomsnitt 19. Sammen med molekylær modellering av villtype og mutant maskiner, gir vår høy gjennomstrømming rørledning en ny vei for å forstå strukturen og funksjonen til intakt injectisome i den innfødte cellular sammenheng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Power reduction Forberedelse
- For å gjøre S. flexneri minicells, forvandle 1 mL av plasmid pBS58, som konstitutivt uttrykker Escherichia coli celledeling gener ftsQ, ftsA, og ftsZ fra en lav-kopi spectinomycin motstandsdyktig plasmid inn 5 ul elektrokompetente streptomycin bestandig serotype 5a (M90T-Sm) celler ved elektroporering på 2,5 kV for 5 ms i 1 mm kyvetter.
- Oppbevar minicellen prøver ved -80 ° C i 15% glycerol i en 1,5 ml kryogenisk mikrorør. Når det er klart for bruk, skrape omtrent 5 ul av celler fra unthawed mikrorør ved hjelp av en pipette, og suspendere cellene i 4 ml tryptisk soyavekstmedium med spectinomycin tilsatt til 100 pg / ml konsentrasjon. Grow O / N ved 37 ° C.
- Pipetter 2 ml av kulturen fra 1,2 til 200 ml tryptisk soyavekstmedium med spectinomycin igjen tilsatt til 100 ug / ml konsentrasjoner. Vokser ved 37 ° C til sen logaritmisk fase.
- Å berike minicells, sentrifuger200 ml av kulturen fra 1,3 til 1000 xg i 5 min. Hell forsiktig supernatantfraksjonen til et nytt sentrifugerør og sentrifuger ved 20 000 xg i 10 min. Hell forsiktig av og kast supernatant fraksjon og forsiktig blande pellet med den gjenværende væsken ved hjelp av en pipette og overføre omtrent 100 ul av pelleten blandingen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
2. EM Grid Forberedelse
- Plasser en R2 / to holey karbon film 200-mesh kobbernettet karbon siden opp på et objektglass.
MERK: En R2 / 2 200-mesh nett er valgt for å maksimalisere antallet av tilt-serie som kan bli satt til å skaffe seg i en enkelt gitterfirkanten og samtidig støtte prøven og å plassere kanten av det karbonsjikt i feltet for kameraet ved den ønskede forstørrelse. Finere mesh nett og mindre holey karbon film som R1.2 / 1.3 400-mesh kan brukes for prøver fotografert ved høyere forstørrelse; større holey karbon film som R3.5 / 1 200-mesh kan være brukd for prøver avbildes ved lavere forstørrelse eller dersom mikrobilde ikke bør inneholde karbon kanten og holey karbon filmer med større mellomrom, slik som R1 / 4 200-mesh kan benyttes for å hjelpe til med innretting av fasen til området av interesse og beskytte områder fra overeksponering i fokus og sporing rutiner. - Plasser lysbildet på plattformen i en glød utflod enhet.
MERK: Vi bruker en intern anordning i hvilken en anode og plattformen er maskinert inn i en vakuumeksikator, og er drevet av en høyfrekvens-generator. Etter å skape et vakuum, feste den høyfrekvente generator sonde til anoden og kraft på sonden i 1 min til glødeutladning rutenettet. Nødvendig tid til å gløde utslipp rutenettet kan variere fra noen få sekunder til ett minutt. Varierende gløden utslipp tid kan brukes til å diagnostisere problemer med prøve konsentrasjon og nett som vises tørr uten glasslegemet is. - Fjern rutenettet med et sett med tang, og låse tang lukket med en elastisk bog.
- Tilsett 100 ul 10 nm kolloidalt gull løsning på mikrosentrifugerør med minicells fremstilt i 1,4 og bland forsiktig ved å smekke røret med en finger. Med en ny pipette sted 4 pl av blandingen på risten fremstilt i 2.2.
MERK: Kolloidalt gull er tilgjengelig i en rekke størrelser og forsiktighet bør utvises at størrelsen på gull er større enn 5 piksler gitt pikselstørrelse på de mikrografer å bli behandlet på den ervervede forstørrelse, mens du ikke er for stor til å skjule funksjoner av interesse. - Forbered stupe-freeze apparat; fylle den ytre beholderen frysing med flytende nitrogen, og deretter å fylle det indre kammer med flytende etan. Fest tang med rutenettet til stempelstangen og låse stempelet i den hevede stilling.
MERK: Se Iancu et al 20 for en protokoll som beskriver bruk av en kommersiell stupe-fryseapparat.. - Blot rutenettet ved forsiktig å berøre et stykke filterpapir til than slippe av prøven til menisken mellom gitter og filterpapir skiller og den veke på filterpapiret stopper, deretter umiddelbart frigi stempelet, frysing rutenettet. Fjern forsiktig pinsett fra stempelet og plassere rutenettet i et rutenett holderen.
- Klargjør cryo-EM overføre stasjon ved å fylle lasteområdet og absorpsjon pumpe beholder med flytende nitrogen. Når lasteområdet er i flytende nitrogen temperatur sted rutenettet holderen og et mikroskop eksemplar patron i lasteområdet.
- Fjern forsiktig låseringen, som enten er en liten gjenget låsering på tidligere Polara mikroskoper eller en C-clip ring på senere modeller; plassere EM risten inn i kassetten ved hjelp av pinsett og deretter forsiktig feste låseringen tilbake på patronen feste gitteret.
- Ta av flere prøveholderen fra mikroskopet og fest den til overføringsstasjon. Plasser prøven patronen inn i holderen ved hjelp av patron tang end trekke holderen fra lasteområdet og overføre den multiple prøveholderen tilbake til mikroskopet.
MERK: Se Chen et al 21 for en visuell protokoll detaljering 02.01 til 02.09..
3. Høy throughput Automatisert Tilt-serien Collection
- Innsamling av Low-forstørrelse Maps
- Åpne en ny Navigator-vinduet ved å klikke på 'Open' i 'Navigator' meny av SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Finn grid rutene som inneholder akseptable bildeforhold (dvs. tynn is, ingen forurensning, gjenstand for interesse) ved hjelp av fluorescerende skjermen ved lav forstørrelse (~ 2,300X for minicelle prøven).
MERK: [. Valgfritt: Dette trinnet kan automatiseres med SerialEM av montaging hele rutenettet, men det kan være raskere å bare velge noen få områder manuelt] - Juster scenen for å eucentric høyde ved å vippe prøveholderen til 50 ° deretter justerez-høyde inntil xy oversettelse av scenen er minimal mellom de skråstilte og untilted utsikt.
- Flytt til midten av rutenett og klikk 'Legg Stage Pos-knappen i navigatoren vinduet for å lagre den aktuelle scenen posisjon.
- Fortsett trinn 3.1.1-4 ovenfor til alle akseptable grid rutene sceneplassering er lagret.
- Åpne en ny montage MRC-fil ved å klikke på 'Ny montage' i 'Fil-menyen. I Montage Setup Dialog som åpner opp, velg et antall brikker i X og Y som vil tilegne seg hele rutenett (for eksempel 10 x 10 for en standard 200 mesh grid). Bruk en høy binning eksempel 8 og velg "Flytt Stage I stedet for Skiftende Bilde 'og' Hopp sammenhenger brukes til å justere stykker 'radioknapper.
- I Navigator-vinduet klikker du på første etappe posisjon og sette den til å bli kjøpt opp av avmerke 'Acquire "boksen. Gjenta dette for hvert trinn posisjon i Navigator-vinduet.
- Åpne Navigator Acquire Dialog ved å klikke "Acquire på Points" i "Navigator" -menyen. Sjekk den "Acquire kartbildet" og "Rough eucentricity 'boksen og sørge for at alle andre boksene er ukontrollert. Klikk "Fortsett" for å samle en montasje på hvert trinn posisjon.
- Tilt-serien Acquisition
- I Navigator-vinduet velger du en av de oppkjøpte kart og klikk på "Last kart" -knappen.
- I Navigator-vinduet klikker du på "Legg til Points 'knappen og velg punktene i kartet ved å skaffe seg en tilt-serien. Klikk deretter på 'Stopp Legge Points' knappen. Gjenta for hvert kart samlet.
- I Kamera-menyen og velg "Parametere 'og definere parametrene for Focus, Trial, og Record moduser. [Valgfritt:. Dose-fraksjonert data kan angis i parameterne for opptaksmodus]
- Velg et punkt i Navigator-vinduet og sjekke "Tilt-serien9; sjekk boksen. I Tilt-serien Oppsett-vinduet som åpnes velger parametrene ønsket for tilt-serie samlingen. Gjenta for resten av de utvalgte punkter i Navigator-vinduet, men ikke velg kartene.
- I Navigator-menyen velger du igjen den "Acquire på Points". I Navigator Acquire dialogboks velger 'Juster til element', Autofokus "og" Rough eucentricity 'som Foreløpige oppgaver, og velg "Acquire tilt-serien' som den primære oppgaven, og velg" Close kolonne ventiler på slutten for å lukke kolonnen når alt av punktene er samlet. Ved fortsetter en tilt-serien vil bli samlet på hvert punkt i hvert kart.
4. Høy throughput Automatisert Tilt-serien Processing og Reconstruction Bruke Tomoauto
- Korreksjon av Beam-indusert Motion i Dose-fraksjonert data [valgfritt]
MERK: Tomoauto bruker MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) for å fjerne stråle-induserte bevegelse fra dose fraksjonert mikrografer. NOTIONCORR 16 må være installert på systemet.- Med den originale tilt-serien, output loggen fra SerialEM 10 og de enkelte dose fraksjonert bilder tatt i gjeldende arbeidskatalog, i en terminal kjøre kommandoen:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> er navnet på tilt-serien å behandle.
- Med den originale tilt-serien, output loggen fra SerialEM 10 og de enkelte dose fraksjonert bilder tatt i gjeldende arbeidskatalog, i en terminal kjøre kommandoen:
- Justering og Rekonstruksjon av Tilt-serie
MERK: Tomoauto som standard bruker IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) for å håndtere tilt-serien automatiserte avlesnings modell generasjon, innretting, fastsettelse av kontrasten transferfunksjonen (CTF), CTF-korreksjon 23, og gjenoppbygging. Alternativt brukere har muligheten i tomoauto å bruke RAPTOR 24 (inkludert i IMOD) for automatisert fiducial modell generasjon, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) for å bestemme CTF, og tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) for rekonstruksjon eller i en hvilken som helst kombinasjon av programvarepakker etter konfigurasjon. Denne konfigurasjonen samt parametrene tilgjengelig i hver pakke blir håndtert av en global konfigurasjonsfil som kan redigeres for å passe til de verdiene som oftest brukes i en lab mens lokale konfigurasjonsfiler kan også opprettes på detaljer parametrene som brukes for en bestemt prøven, samling angi eller individuell tilt-serien. Alle pakker som ønsker å bli brukt må være installert på systemet.- Med tilt-serien i gjeldende arbeidskatalog, i en terminal kjøre kommandoen
tomoauto --CTF --mode = sluttar <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> er tilt-serien som skal behandles og <fid_diam> er Diameter av fiducial markører i nanometer. Denne kommandoen vil justere og anslå CTF av tilt-serien automatisk. Det er mulig å hoppe over CTF behandling ved å fjerne --CTF alternativ fra kommandoen. - Inspiser justert tilt-serien visuelt for noen skjærende feil i justeringen behandling og inspisere den estimerte CTF ved å utføre kommandoene:
3dmod <filnavn> .ali
submfg <filnavn> _ctfplotter.com
henholdsvis der <filnavn> er navnet på tilt-serien uten suffiks. Kontrollerer også utgangen fra tomoauto kommandoen for å se den midlere restfeil genereres av innretting, noe som er en kvantitativ statistikk for innretting kvalitet. - Gitt en akseptabel justering fortsette behandlingen ved å kjøre kommandoen:
tomoauå --CTF --mode = rekonstruere <filename.st> <fid_diam>
med samme bruker erstatninger som i 4.2.1. Denne kommandoen vil korrigere CTF, slette fiducial markører fra tilt-serien og beregne gjenoppbygging. Igjen CTF behandling kan bli hoppet som i 4.2.1. - [valgfritt] Hvis du vil hoppe visuell inspeksjon trinn og fullt automatisere behandling og gjenoppbygging utføre kommandoen
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [valgfritt] For å bruke en bestemt lokal konfigurasjon, se tomoauto dokumentasjon om hvordan å generere en lokal konfigurasjonsfil, og deretter utføre kommandoen
tomoauto [alternativer] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
der <local_config> er navnet på den lokale confutformning fil.
- Med tilt-serien i gjeldende arbeidskatalog, i en terminal kjøre kommandoen
5. Under tomogram av gjennomsnitt
MERK: Vi bruker i3 pakke 15 (http://www.electrontomography.org/) for å behandle under tomogram gjennomsnitts eksperimenter, men protokollen beskrevet gjelder generelt for de fleste tilgjengelige sub-tomogram averaging programvare packages16to prosess sub-tomogram gjennomsnitts eksperimenter, Men protokollen beskrevet gjelder generelt for de fleste tilgjengelige sub-tomogram averaging programvarepakker 16-18.
- Med den rekonstruerte tomogram i gjeldende arbeidskatalog åpne opp tomogram for partikkelplukking ved å kjøre kommandoen:
tomopick <filnavn> .rec
der <filnavn> er som i 4.2.2. I vinduet som åpner bruke venstre museknapp til å klikke på første basal kroppen og deretter nålespissen å velge en injectisome og bruke opp og ned piltastene for å riff gjennom skiver av tomogram. Velg alle synlige injectisomes på denne måten. Denne lagrer koordinatene i en tekstfil som definerer den lange aksen av konstruksjonen samt estimering to av de tre Euler vinkler som beskriver orienteringen av strukturen. - Beregnings ekstrakt 400 3 vokselver kuber fra tomogram sentrert på midtpunktet av den definerte lange aksen ved å kjøre kommandoen:
klipp resize -CX <x> -C <y> -cz <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<filnavn> .rec <filnavn> _001.mrc
der <x>, <y>, <z> er midtpunktet koordinatene til struktur og <filnavn> er som i 4.2.2. Størrelsen av den ekstraherte kuben bør variere fra strukturen og den forstørrelse som brukes, og bør være store nok til å tilstrekkelig omslutte strukturen av interesse, som for denne prøve er 400 tre voksler. - Down-prøve (bin) under tomogram med en faktor på fire for å redusere beregningstiden for innledende innretting ved å utføre kommandoen:
binvol -b 4 <filnavn> _001.mrc <filnavn> _001.bin4.mrc
der <filnavn> er som i 5.2. - Påfør bestemt Euler vinkler til under tomograms og beregne globale gjennomsnittet for å produsere den første malen ved å kjøre kommandoen.
I3totsum.sh - Rett og klassifisere ned-samplede under tomograms bruker en binær klassifisering maske av cytoplasma området. Utfør sub-tomogram midling i Fourier plass for å minimere de savnede kile gjenstander som er karakteristiske for tomografi. For binning 4 data, vennligst bruk SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Gjenta trinn 5.5 bruker under tomograms ned-samplet med en faktor på to (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") og en gang mer med de opprinnelige data (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøver av minicells S. flexneri ble samlet og behandlet som vist i den skjematiske figur 1 under anvendelse av følgende tomoauto rørledningen detaljert i figur 2. Tilt-serien ble samlet inn ved hjelp SerialEM 10, som gir mulighet for høy gjennomstrømming tilt-serie oppkjøp på punkter utpekt av brukeren på lav forstørrelse montage kart (figur 3). Mikrografer ble samlet inn ved hjelp dose-fraksjonemodus på en direkte påvisning kameraet til å redusere stråleinduserte bevegelser 22 (figur 4). Tomoauto koordinerer bevegelse korreksjon tar en samling av dose fraksjonert mikrografier behandlingen hver med MOTIONCORR 22 og monterer resultatene i en tilt-serien som skal bearbeides videre (Movie 1).
Den mest allmenngjøring av tomoauto er automatisc innretting av en første vippe-serien. Tomoauto komponerer sekvensiell gjennomføring av de nødvendige kommandoer i IMOD 13 til grov justere tilt-serien og generere en innledende fiducial modell spore kolloidale gull partikler i utvalget, som igjen brukes til å generere den endelige justeringen. Nøyaktigheten av denne fiducial modellen er avgjørende for kvaliteten på den rekonstruerte tomogram, og slik at brukeren er i stand til å visuelt inspisere beregnes automatisk fiducial modellen før du fortsetter med rekonstruksjon eller etterpå for å identifisere tilt-serie som skal behandles manuelt. Figur 5 viser to-tilt-serien grovjustert og den bestemte fiducial modellen som genereres av tomoauto. Figurene 5A, C viser untilted bildene og i både fiducial modellen er riktig med modell poeng sentrert på fiducial markører. Figurene 5B, D viser den tilsvarende tilt serie på 50 grader, og mens modellen i figur 5B figur 5D kommet bort fra deres tilsvarende gullmarkører og modellen er ikke egnet for fin justering. Denne feilen kan måles kvantitativt som gjennomsnittlig gjenværende feil mellom sentrum av modellen punktet og den sannsynlige sentrum av gull markør, og tomoauto kan konfigureres til å varsle brukeren når de målte feil overstiger en brukerdefinert terskel for å fremskynde inspeksjon. Tilt-serie som er utilstrekkelig justert automatisk kan deretter justeres manuelt. Vi finner at tomoauto hell justerer rundt 80% -90% av vår samlet tilt-serien (Movie 2).
Etter en tilt-serien har blitt justert, må det bli rekonstruert i den endelige tomogram. Tomoauto har blitt designet slik at brukeren kan bruke IMOD 13 eller tomo3d 26 for å generere den endelige gjenoppbygging. Vi bruker tiden tomo3d å dra nytte av flere funksjoner i moderne multi-core databehandlingsenheter (CPU) for å sterkt redusere gjenoppbyggingen tid. Den endelige tomogram som vist i figur 6, og film 3 er et 3-D volum av den avbildede prøve som kan brukes for cellulær annotering av segmentering, eller sub-tomogram i snitt for å oppnå høyere informasjon av den molekylære maskineri i prøven oppløsning. Under tomogram midlings øker både SNR og reduserer gjenstander produsert av manglende-kile ved å ta gjennomsnittet av de høye nivåer av støy i de enkelte tomograms og utnytte det store antallet under tomograms i en godt fordelt sett av tilfeldige orienteringer med hensyn til den mangler kile for å begrense artefakter og forbedre den endelige løsningen. Den 2.7nm sub-tomogram gjennomsnitt av intakt S. flexneri T3SS er vist i figur 7 som avsettes i EMDB (EMD-2667), noe som viser den store forbedring i stand til med denne teknikken compared til injectisome vises i en enkelt tomogram i figur 6B.
Figur 1. Skjematisk oversikt over high-throughput Cryo-elektron-tomografi. En flytende suspensjon ble raskt frosset på et EM gitter og et sett av tilt-serien er samlet inn av en automatisk datamaskin-styrt elektronmikroskop. De resulterende mikrografer behandles automatisk ved hjelp tomoauto å generere tomogram. Det siste trinnet her er en segmentert S. flexneri minicelle fra en tomogram generert av denne protokollen fra Hu et al. 2 015 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Flytskjema av tomoauto prosessen. En oppsplitting av tomoauto arbeidsflyten viser hvordan data behandles fra en samling av dose fraksjonert mikrografer hele veien til en endelig under tomogram gjennomsnittet. Delprosesskravene symboler detalj de oppgavene som tomoauto koordinater for å behandle innspill ved å kjøre konfigurert riktig programvare. Datasymboler viser utgangs vanligvis ikke brukes av brukeren, mens dokument og multi-dokument symbolene viser utgangs faktisk håndteres av brukeren. Endelig vise symboler viser hvor brukermedvirkning skjer i arbeidsflyten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Batch tilt-serie oppkjøp med SerialEM Navigator. Posisjoner av montage Kartene er lagret som sceneplassering (vist selectipå) i Navigator-vinduet listen vises på venstre side av skjermen, og det kartet vises i buffer vinduet sammen med de valgte punktene merket numerisk med et rødt kryss lagt til kartet for oppkjøpet. Anskaffelses punkter er oppført av etiketten i Navigator-vinduet og kan settes til å skaffe seg ved hjelp av "Tilt-serien" boksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effekt av motion-korreksjon på dose fraksjonert data. (A) Viser et untilted og ukorrigert mikrograf, og bevegelsen korrigert bilde (behandles av MOTIONCORR) er vist i (B), blir kontrasten litt forbedret etter korrigering. Forbedring kan sees mer tilsynelatende ved å se på Fourier TRANSForm av mikrograf før (C) og etter (D) bevegelse korreksjon. Bilder EH viser den samme informasjon, men med en mikrograf vippet 60 grader, hvor kontrasten er redusert, og Thon ringer synlig i C og D er ikke lenger synlige ved høy tilt. Scale bar 250 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Gode og dårlige resultater av tomoauto automatiserte tilt-serien justering. (A) En untilted omtrent på linje mikrografi og fiducial modellen produseres automatisk ved hjelp tomoauto. (B) Den bestemte fiducial modell på 50 grader tilt. Modellen passer fortsatt godt og er sentrert på de aktuelle fiducial markører. (C, D) (A, B) henholdsvis zoomet inn på eske området. Denne vippe-serien ble justert med en midlere restfeil på 1,06 piksler. (E) En untilted mikrograf og avlesningsmodell fra en annen vippe-serien og (F) i serie på 50 grader tilt. Her ser vi at modellen har mistet oversikten over flere fiducial markører (vist i rødt) og dette er representativt for en dårlig automatisert sporing. (G, H) viser modellen i (E, F) henholdsvis zoomet inn på eske området. Dette tilt-serien ble justert med en gjennomsnittlig gjenværende feil fra 3,51 piksler, og måtte bli behandlet av manuell justering av serien. (A) Scale bar 500 nm (C) Scale bar 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
![Figur 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figur 6. Tomogram genereres automatisk av tomoauto. (A) Dette viser en projeksjon av syv stykker fra sentrum av gjenoppbyggingen av tilt-serien som vises i figur 4A. Scale bar 250 nm. (B) A zoomet i lys av eske området (A) viser en intakt injectisome. Scale bar 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Under tomogram gjennomsnitt intakt S. flexneri type III sekresjon system. (A) Central bit av 2,7 nm under tomogram gjennomsnitt av intakt S. flexneri T3SS fra EMDB (EMD-2 667). (B) Full projeksjon langsX-aksen av volumet. (C) Isosurface gjengivelse av volumet ses på en kontur av terskel 130 i IMOD. Scale bar 5 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: Animasjon av unaligned tilt-serien (Høyreklikk for å laste ned). Denne animasjonen går gjennom tilt-serien som opprinnelig innsamlet av SerialEM. Translasjonsforskning skift er lett identifiseres ved ujevn sti av individuelle fiducial markører fra bilde til bilde, og disse skift sammen med mindre merkbare defekter må rettes opp før den tilt-serien kan rekonstrueres.
![Movie 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Movie 2: Animasjon av justert tilt-serien (Høyreklikk for å laste ned). Denne animasjonen går gjennom de samme mikrografer som vises i filmen 1 etter automatisert justering av tomoauto. De uberegnelige stier fiducial markører nå følge en glatt bane gjennom tilt-serien, og tilt-aksen er lagt vertikalt i forhold til betrakteren.
Movie 3:. Animasjon av rekonstruerte tilt-serien (Høyreklikk for å laste ned) Denne animasjonen går gjennom tomogram vist i Figur 6 generert etter automatiserte rekonstruksjon av tilt-serien som vises i filmen 2 by tomoauto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The high-throughput metoden beskrevet her gjorde oss i stand til å behandle 1917 cryo tilt-serien og produserer over 4500 under tomograms av intakt S. flexneri injectisome 19. De innsamlede data førte til detaljert karakterisering av in situ injectisome, inkludert cytoplasmatiske sortering kompleks. Fremgangsmåten ble også anvendt for å visualisere flere mutante celler med spesifikk delesjon av antatte proteinkomponenter, som bidro til å klargjøre sammensetningen av sorterings plattformen i injectisome. Vår fremgangsmåte nye veier for å undersøke struktur-funksjon relasjonen for injectisome. Som et resultat av dette ble den nye duket for videre disseksjon av mekanismene bak T3SS-mediert sekresjon og patogenesen.
Protokollen presenteres her beskriver høy gjennomstrømming cryo-ET av intakt S. flexneri, men er anvendelig for ethvert prosjekt egnet for kryo-ET. Denne metoden har vært brukt i strukturer;ral karakterisering av flagell motor av Borrelia burgdorferi 27, infeksjon av E. coli minicells ved bakteriofag T7 og 28, chemoreceptor matriser i E. coli 29. Ved å lette samlingen av massive sett, er det mulig å screene flere mutanter samt bilde et stort antall betingelser som tillater slutninger av dynamiske prosesser som maskinsammenstillingen 27, og fremdriften av fag-infeksjon 28. Ved å samle flere programvarepakker og åpner for full kontroll over behandlingen henrettelse, brukerne er i stand til å tilpasse ulike kombinasjoner av pakker for optimale resultater. Chen et al. 21 tidligere utgitt en lignende protokoll som beskriver samle inn data ved hjelp av programvarepakken Leginon 12 og automat tilt-serien behandling ved hjelp IMOD 13 og RAPTOR 24. Den nåværende protokoll utfyller denne metoden detaljering en alternativ metode til å collecting og bearbeiding av data samtidig som viser hvor mye teknologi og prosedyre har avansert, drevet av økt fokus på høy oppløsning gjennom sub-tomogram midling, med dose fraksjonert data, automatisert CTF estimering og korrigering, og mer robuste automatiserte justeringsrutiner innenfor IMOD 13. Mens den forrige protokollen går inn visuelle detaljer med vekt på datainnsamling, fokuserer denne metoden på detaljene i behandling av de innsamlede dataene.
Høy throughput metoder tillate massive datainnsamlingen som maksimerer bruk av mikroskop og dataressurser, mens begrense mengden av kjedelige bruksanvisningen intervensjoner som forsinke prosjektet og fungere som en stor flaskehals. Wrapper bibliotek tomoauto har blitt designet for å tillate full konfigurasjon av alle parametre som brukes i hver pakke på en enkel og sentralisert måte. Når en passende konfigurasjon er fastsatt, er det da lett å bruke innstillingene på hele dataset. Et flertall av tilt-serien kan behandles med akseptable resultater (figur 4A), mens en mindre undergruppe er nødvendig for å behandles manuelt. Disse tilt-serien er vanligvis mindre ideelle oppkjøp plaget av overdreven bildeforskyvning, dårlig kontrast, eller mangel på tilstrekkelige fiducial markører som fører til at automatisert fiducial sporing rutine til å mislykkes (4B). For å oppnå best mulige tomograms, må omfattende omsorg tas på hver avgjørende skritt fra prøveopparbeidelse, image oppkjøpet, til bildebehandling.
Den videre utviklingen i høy gjennomstrømming cryo-ET som automatisert under tomogram utvinning av mal matching og integrering av moderne sub-tomogram averaging programvarepakker som Dynamo i eksisterende arbeidsflyt rørledninger som tomoauto blir nå undersøkt. Den nylige advent av ny generasjon direkte påvisning enhets kameraer har gjort store forbedringer i økende tilt-serien SNR og muliggjør more konsistent CTF bestemmelse på grunn av den høyere effektivitet av detektoren. Bruken av ny full gull grid-typer kan redusere tilt-serien samling defekter, bedre suksessraten for automatisert tilt-serien prosessering og rekonstruksjon med mindre behov for manuell inngripen 30. Slutt med den nå utbredte bruk av dataklynger og grafiske prosessorer (GPUer) til parallelize og fremskynde store datasett foredling, utvikling av rørledninger som kan benytte disse systemene vil snart forhåpentligvis kunne forkorte kjøretiden fra dager til timer, og gir brukerne likevel enda mindre nedetid i mellom eksperiment design og meningsfull analyse av data samtidig øke datasettet størrelse og oppnå høyere oppløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. William Margolin for kommentarer. Vi er takknemlige for støtten på SerialEM fra legene. David Mastronarde og Chen Xu. DM, BH og JL ble støttet av Grant R01AI087946 fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, Grants R01GM110243 og R01GM107629 fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), og Grant AU-1714 fra Welch Foundation. Den direkte elektrondetektor ble finansiert av National Institutes of Health Award S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
