Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Published: January 30, 2016 doi: 10.3791/53608
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

Introduction

III מערכות סוג ההפרשה (T3SS) הן גורמי אלימות חיוניים לפתוגנים גראם שלילי רבים. Injectisome, הידוע גם במתחם המחט, הוא המכונה T3SS המרכזית הנדרשת לטרנסלוקציה הישירה של חלבוני מפעיל מהחיידק לתאי מארח אוקריוטים 1, 2. Injectisome כולל מחט תאית, גוף בסיסי, ומורכב cytoplasmic גם ידוע כמורכב מיון 3. מחקרים קודמים הובהרו מבני 3-D של injectisomes המטוהר מסלמונלה וShigella, יחד עם המבנים האטומיים של חלבוני גוף בסיסיים גדולים 4, 5. אחרונים במבנים באתרו של injectisomes מסלמונלה, Shigella, וYersinia נחשפו על ידי cryo-ET 6 , 7. עם זאת, מורכב cytoplasmic, חיוני לבחירת מפעיל והרכבת מחט, לא דמיינו במבנים אלה.

קריו ET הוא most טכניקה מתאימה להדמיה מולקולרית מכונות ברזולוציה ננומטר בתוך הקשרה המקורי הסלולרי (באתר). עם זאת, החלטת השגה על ידי cryo-ET מוגבל על ידי עובי דגימה. כדי להתגבר על החסרון, שצלמנו injectisomes שלם במתח flexneri ארסי Shigella שמהונדס גנטי כדי לייצר minicells רזה מספיק cryo-ET. מגבלה נוספת של cryo-ET היא הרגישות של המדגם לקרינה הנגרמת על ידי קרן האלקטרונים, שהורס את המידע ברזולוציה הגבוהה במדגם מהר מאוד. כתוצאה מכך, במינונים נמוכים מאוד משמשים להטיה-תמונות בודדות, כך שמינון מתאים יכול להיות מופץ בקרב ההטיה-הסדרה המלאה. זה מוריד את יחס אות לרעש (SNR) בשחזור הגמר, מה שהופך את זה קשה להבחין תכונות המבניות של הנושא מהכמות הגדולה של רעש בtomogram ומגביל את הרזולוציה שיכול להיות מושגת על ידי הוצאה מחדר הקפאה מאוד ET. Conventiעיבוד תמונת onal כגון פורייה ומסננים אמיתיים-חלל כמו גם את הדגימה ניתן להשתמש כדי להגביר את הניגודיות, אבל על חשבון סינון הרבה של המידע ברזולוציה הגבוהה. לאחרונה, מיצוע תת-tomogram איפשר להגדיל באופן משמעותי את יחס האות לרעש ולאחר מכן ההחלטה הסופית במקרים מסוימים לרמות תת-ננומטר 8, 9. ניתוח מפורט יותר של מתחמים מתאפשר על ידי המחשוב חילוץ אלפי תת-tomograms מכיל תחומי העניין מtomograms המקורי ולאחר מכן יישור וממוצע תת-tomograms לקבוע במבנים מורכבים אתר עם ​​יחס אות לרעש גבוה יותר ורזולוציה גבוהה יותר. ניתן לשלב שיטות אלה עם גישות גנטיות לספק תובנות גדולות עוד יותר למכלולי macromolecular והתצורות הדינמיות שלהם בהקשר הסלולרי המקומי.

באופן כללי, עשרות או אפילו מאות אלף תת-tomograms צריכים להיות בממוצע על מנת לקבוע גבוהמבני -resolution באתר. הרכישה של מספר מספיק הטיה-סדרה של דרושה כדי לייצר מספר רב של תת-tomograms הופך לצוואר בקבוק במהירות. הטיה-הסדרה וכתוצאה מכך מושפעת לעתים שינוי מושרה קרן, תגובה חריפה שלב, כמו גם הגדלה, סיבוב והטית פגמים, שיש לפתור כדי להביא את ההטיה-הסדרה ליישור לפני השחזור. סדרת ההטיה מיושרת בדרך כלל על ידי סמני מעקב זהב fiducial, אשר נבחרו באופן מסורתי באופן ידני באמצעות בדיקה של ההטיה-הסדרה, וגרמו עוד צוואר בקבוק. חבילות תוכנה רבות פותחו עבור רכישת הטיה-סדרה אוטומטית באמצעות מיקרוסקופים מבוקרים מחשב אלקטרונים 10, 11, 12, יישור הטיה-סדרה ושחזור 13, 14 ותת-tomogram ממוצע 15-18. חבילות אלה להתמודד עם פעולות בדידות בזרימת העבודה של cryo-ET, הוא הופך להיות רצוי לבנות רמה גבוהה יותר של הפשטה בתהליך לSystematically לייעל את כל התכנית לצינור אחד. לכן, פיתחנו ספריית עטיפת תוכנה "tomoauto" שנועדה לארגן מספר החבילות אלה ליחידה חצי אוטומטי יחידה, המאפשר למבצע משתמש פשוט, תוך שמירה על תצורה מלאה של כל רכיב באופן ריכוזי. הספרייה היא קוד פתוח, מתועד היטב, שפותח ללא הרף וזמין באופן חופשי לשימוש, פיתוח מותאם או אינטגרציה נוספת באמצעות מאגר קוד מקור מרוחק מקוון (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

צינור cryo-ET תפוקה גבוהה זה נוצל כדי להמחיש injectisomes שלם בס minicells flexneri. סך של 1,917 tomograms נוצרו בשיטה זו, חושף ברזולוציה גבוהה במבנה אתר של המכונה ללא פגע כולל פלטפורמת מיון cytoplasmic נקבעה על ידי משנה tomogram ממוצע 19. יחד עם הדמיה מולקולרית של wild-type ומטרמכונות utant, צינור התפוקה גבוהה שלנו מספקת דרך חדשה להבין את המבנה ותפקוד של injectisome שלם בהקשר הסלולרי המקומי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת Minicell

  1. כדי להפוך ס minicells flexneri, להפוך 1 μl של פלסמיד pBS58, המבטא constitutively גני חלוקת התא הקולי Escherichia ftsQ, ftsA, וftsZ מנמוך עותק spectinomycin עמיד פלסמיד לתוך 5 μl electrocompetent סטרפטומיצין עמיד 5a סרוטיפ (M90T-SM) תאים על ידי electroporation 2.5 קילו וולט עבור 5 אלפיות שניים בcuvettes 1 מ"מ.
  2. דגימות minicell החנות ב -80 ° C בגליצרול 15% בmicrotube קריוגני 1.5 מיליליטר. כשמוכנים לשימוש, לגרד כ 5 μl של תאים מmicrotube הופשר באמצעות קצה פיפטה ולהשעות את התאים 4 מיליליטר מרק סויה tryptic עם spectinomycin הוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז. לגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס.
  3. פיפטה 2 מיליליטר של התרבות ממרק סויה 1.2 לtryptic 200 מיליליטר עם spectinomycin הוסיף שוב ל -100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לשלב מאוחר יומן.
  4. כדי להעשיר את minicells, צנטריפוגה200 מיליליטר של התרבות מ1.3 XG ב 1000 במשך 5 דקות. יוצק בזהירות את חלק supernatant לתוך צינור צנטריפוגות חדש וצנטריפוגות ב 20,000 XG במשך 10 דקות. יוצק בזהירות ותשאיר חלק supernatant, ולערבב בעדינות את הכדור עם הנוזל שנותר באמצעות קצה פיפטה ולהעביר כ -100 μl של תערובת גלולה לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.

2. EM הכנת רשת

  1. מניחים בצד פחמן רשת נחושת 200-רשת סרט פחמן מחורר R2 / 2 עד בשקופית זכוכית.
    הערה: / 2 רשת 200-רשת R2 נבחרה על מנת למקסם את מספר ההטיה סדרה-שניתן להגדיר לרכוש בכיכר רשת אחת ועדיין תומך בדגימה והצבת הקצה של סרט פחמן בתחום של המצלמה של בהגדלה הרצויה. רשתות פיינר רשת וסרטים קטנים יותר המחוררת פחמן כגון R1.2 / 1.3 400-רשת יכולה לשמש לדגימות הדמיה בהגדלה גבוהה יותר; סרטים גדולים המחוררת פחמן כגון R3.5 / 1 200 רשת יכולה להיות שימושד עבור דגימות צילם בהגדלה נמוכה או אם מיקרוסקופ לא יכיל קצה פחמן וסרטי פחמן מחוררים עם מרווח גדול יותר כגון R1 / 4 200-רשת יכול לשמש כדי לסייע עם יישור השלב לאזור של עניין והגנת אזורים מ חשיפת יתר בהתמקדות ושגרת מעקב.
  2. מניחים את השקף על הפלטפורמה במכשיר הפרשות זוהרת.
    הערה: אנו משתמשים במכשיר בבית שבו האנודה ופלטפורמה כבר במכונה לייבוש ואקום, והוא מופעל על ידי גנרטור בתדירות גבוהה. לאחר יצירת ואקום, לצרף את מחולל הבדיקה בתדירות גבוהה להאנודה והכוח על הבדיקה דקות 1 לזהור לפרוק את הרשת. הזמן הדרוש לזוהר פריקת הרשת יכולה לנוע בין כמה שניות עד דקה. שינוי זמן הפרשות זוהרת יכול לשמש כדי לאבחן בעיות בריכוז דגימה ורשתות המופיעות יבש ללא קרח זגוגית.
  3. הסר את הרשת עם סט של מלקחיים, ולנעול את המלקחיים סגרו עם ב אלסטיו.
  4. להוסיף 10 פתרון זהב colloidal ננומטר לצינור microcentrifuge עם minicells הערוך 1.4 100 μl ומערבבים בעדינות על ידי מצליף את הצינור עם אצבע. עם 4 מקום פיפטה μl חדש של התערובת על הרשת מוכנה ב 2.2.
    הערה: זהב קולואיד הוא זמין במגוון של גדלים ויש להיזהר שהגודל של הזהב הוא יותר מ -5 פיקסלים בהתחשב בגודל פיקסל של micrographs להיות מעובד בהגדלת רכש, בעוד שלא היה גדול מדי לתכונות מעורפלות של עניין.
  5. הכן את מנגנון הצעד-הקפאה; למלא את מיכל ההקפאה החיצוני עם חנקן נוזלי ולאחר מכן למלא את התא הפנימי עם אתאן הנוזלי. צרף את המלקחיים עם הרשת למוט הבוכנה ולנעול את מוט הבוכנה למצב המורם.
    הערה: ראה ינקו ואח '20 לפרוטוקול המתאר את השימוש במנגנון צניחה-הקפאה מסחרית..
  6. למחוק את הרשת על ידי הנגיעה בזהירות פיסת נייר סינון כדי לאהוא שחרר של מדגם עד המניסקוס בין מפריד רשת ונייר סינון והפתילה על נייר המסנן מפסיק, ואז לשחרר באופן מיידי את מוט הבוכנה, הקפאת הרשת. מוציאים בזהירות את המלקחיים ממוט הבוכנה ולמקם את הרשת לבעל רשת.
  7. הכן את תחנת מעבר cryo-EM ידי מילוי מיכל משאבת אזור הטעינה וקליטה עם חנקן נוזלי. ברגע שאזור הטעינה הוא במקום טמפרטורת חנקן נוזלי בעל הרשת ומחסנית דגימת מיקרוסקופ באזור הטעינה.
  8. מוציא בזהירות את טבעת הנעילה, אשר היא או טבעת נעילת הברגה קטנה על מיקרוסקופי Polara מוקדם או טבעת קליפ בסגנון C על מודלים מאוחר יותר; הנח את רשת EM לתוך המחסנית באמצעות מלקחיים ולאחר מכן בעדינות לצרף את טבעת הנעילה בחזרה אל מחסנית אבטחת הרשת.
  9. הסר את בעל דגימה מרובה ממיקרוסקופ ולצרף אותו לתחנת המעבר. הנח את מחסנית הדגימה לתוך מחזיק באמצעות מלקחיים מחסניתd לחזור בעל מאזור הטעינה ולהעביר את בעל דגימה מרובה חזרה למיקרוסקופ.
    הערה: ראה חן et al 21 לפרוטוקול חזותי המפרט 2.1-2.9..

אוסף הטיה-סדרה אוטומטית 3. תפוקה גבוהה

  1. אוסף של מפות נמוכה הגדלה
    1. פתח חלון Navigator חדש באמצעות לחיצה על 'פתח' בתפריט 'Navigator "של SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
    2. מצא את ריבועי רשת המכילים תנאי הדמיה מקובלים (כלומר, קרח דק, אין זיהום, נושא הריבית) באמצעות מסך הניאון בהגדלה נמוכה (~ 2,300X לדגימת minicell).
      הערה: [אופציונאלי:. יכול להיות אוטומטי צעד זה עם SerialEM ידי montaging כל הרשת, אבל זה יכול להיות מהיר יותר פשוט לבחור כמה אזורים ידני]
    3. התאם את השלב לגובה eucentric ידי הטיית בעל הדגימה עד 50 ° לאחר מכן להתאיםZ-הגובה עד תרגום XY של השלב הוא מינימאלי בין הנופים המוטה וuntilted.
    4. לעבור למרכז כיכר הרשת ולחץ על הכפתור 'הוסף שלב ממוצע' בחלון הניווט כדי לאחסן את מיקום השלב הנוכחי.
    5. המשך צעדים 3.1.1-4 מעל עד שכל עמדות שלב ריבועי רשת המקובלות נשמרו.
    6. פתיחת קובץ MRC מונטאז 'חדש באמצעות לחיצה על' מונטאז 'החדש' בתפריט 'הקובץ'. בהגדרת Montage שיח שנפתחת, בחר מספר החתיכות בX ו- Y שתרכושנה את כל כיכר הרשת (לדוגמא, 10 x 10 לרשת 200 רשת סטנדרטית). השתמש binning גבוה כגון 8 ובחר את "הזז שלב במקום העברת תמונה 'ו' דלג מתאמים משמשים כדי ליישר חתיכות" כפתורי רדיו.
    7. בחלון Navigator לחץ עמדת השלב הראשונה ולהגדיר אותו יירכש על ידי סימון התיבה 'רוכש את'. חזור על פעולה זו עבור כל עמדת שלב בחלון Navigator.
    8. פתח את Navigator לרכוש שיח באמצעות לחיצה על 'רוכשים בנקודות' בתפריט 'Navigator ". בדוק את 'התמונה רוכשת את המפה' ותיבת סימון 'eucentricity קשוח "ולוודא שכל תיבות הסימון אחרות שלא נבדק. לחץ על 'המשך' כדי לאסוף מונטאז 'בכל עמדת שלב.
  2. רכישת הטיה-סדרה
    1. בחלון Navigator בחר באחת מהמפות שנרכשו ולחץ על הכפתור 'טען המפה'.
    2. בחלון Navigator לחץ נקודות 'הוסף נקודות "כפתור ובחר במפה שבה לרכישת הטיה-סדרה. לאחר מכן לחץ על "להפסיק להוסיף נקודות" כפתור. חזור על פעולה עבור כל מפה שנאסף.
    3. בתפריט המצלמה בחר 'פרמטרים' ולהגדיר את הפרמטרים למצבי פוקוס, ניסיון, והשיא. [אופציונאלי:.-מופרדת מנה יכולים להיות מוגדרים נתונים בפרמטרים למצב הקלטה]
    4. בחר נקודה בחלון הניווט ולבדוק את הסדרה-Tilt '9; תיבת סימון. בחלון הדו-שיח הגדרת ההטיה הסדרה-שנפתח בחרו בפרמטרים רצויים לאוסף הטיה-הסדרה. חזור לשאר נקודות שנבחרו בחלון Navigator, אך לא יבחר המפות.
    5. בתפריט הניווט בחר שוב 'רוכשים בנקודות ". בנווט רוכשים הדו-שיח לבחור "ליישר מחדש לפריט ', מיקוד אוטומטי' ו 'eucentricity קשוח" כמשימות ראשוניות, ובחר' סדרת הטיה לרכוש "כמשימה העיקרית, ובחר 'שסתומים עמודה לסגור בסוף' כדי לסגור את הטור כאשר כל מהנקודות שנאספו. על הליך הטיה-סדרה ייאסף בכל נקודה בכל מפה.

עיבוד הטיה-סדרה אוטומטית 4. תפוקה גבוהה ושיקום באמצעות Tomoauto

  1. תיקון של תנועה מושרה קרן בנתונים מופרדים במינון [אופציונאלי]
    הערה: Tomoauto משתמשת MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htמיליליטר) כדי להסיר תנועה מושרה קרן מmicrographs-מופרד מינון. NOTIONCORR 16 חייבים להיות מותקנים במערכת.
    1. עם ההטיה-הסדרה המקורית, יומן הפלט מSerialEM 10 ותמונות מינון מופרד בודדות כל בספריית העבודה הנוכחית, במסוף לבצע את הפקודה:
      dose_fractioned_to_stack <filename.st>
      <Filename.st> הוא שמו של ההטיה הסדרה לעבד.
  2. יישור ושיקום הטיה-סדרה
    הערה: Tomoauto כברירת מחדל משתמש 13 IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/) כדי להתמודד עם דור הטיה-סדרה אוטומטית מודל fiducial, יישור, נחישות של פונקצית ההעברה לעומת זאת, CTF-תיקון 23, (CTF) ו שִׁחזוּר. לחלופין יש למשתמשים את האפשרות בtomoauto להשתמש 24 RAPTOR (כלולה בIMOD) לדור אוטומטי fiducial מודל, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) כדי לקבוע את CTF, וtomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) לשיקום או בכל שילוב של חבילות תוכנה על ידי תְצוּרָה. תצורה זו, כמו גם את הפרמטרים זמינה בכל חבילה מתבצעת על ידי קובץ תצורה גלובלי שניתן לערוך כדי להתאים את הערכים הנפוצים ביותר במעבדה בעת גם ניתן ליצור קבצי תצורה מקומיים לפרמטרים המשמשים לפירוט דגימה ספציפית, אוסף להגדיר או הטיה-סדרה בודדת. כל החבילות שרוצות לשמש חייבת להיות מותקנות במערכת.
    1. עם ההטיה-הסדרה בספריית העבודה הנוכחית, במסוף לבצע את הפקודה
      tomoauto --CTF --mode = ליישר <filename.st> <fid_diam>
      <Filename.st> היא ההטיה-הסדרה להיות מעובד ו< fid_diam> הוא diameter של סמני fiducial בננומטרים. פקודה זו תהיה ליישר ולהעריך את CTF של ההטיה-הסדרה באופן אוטומטי. אפשר לדלג על עיבוד CTF על ידי הסרת אפשרות --CTF מהפקודה.
    2. בדוק את ההטיה-הסדרה מיושרת חזותי לטעויות בולטות בעיבוד היישור ולבדוק המוערך CTF על ידי ביצוע הפקודות:
      3dmod <שם הקובץ> .ali
      submfg <שם הקובץ> _ctfplotter.com
      בהתאמה, כאשר <שם קובץ> הוא שמו של ההטיה-הסדרה בלי סיומת. כמו כן, בדוק את הפלט של פקודת tomoauto לראות את שגיאת השייר הממוצעת שנוצרה על ידי היישור, שבו הוא נתון כמותי של איכות יישור.
    3. בהתחשב יישור מקובל להמשיך עיבוד על ידי ביצוע הפקודה:
      tomoauל--CTF --mode = לשחזר <filename.st> <fid_diam>
      עם אותו המשתמש כמו בהחלפות 4.2.1. פקודה זו תתקן CTF, למחוק את סמני fiducial מההטיה-הסדרה ולחשב את השחזור. שוב עיבוד CTF ניתן לדלג כמו ב4.2.1.
    4. [אופציונאלי] כדי לדלג על שלב הבדיקה ויזואלית ולהפוך באופן מלא לעיבוד ושחזור לבצע את הפקודה
      tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam>
    5. [אופציונאלי] כדי להשתמש בתצורה מקומית ספציפית, עיין בתיעוד tomoauto על איך ליצור קובץ הגדרות מקומי, ולאחר מכן לבצע את הפקודה
      tomoauto [אפשרויות] ס <local_config> <filename.st> <fid_diam>
      כאשר <local_config> הוא שמו של conf המקומיקובץ iguration.

מיצוע 5. תת-tomogram

הערה: אנו משתמשים בחבילת i3 15 (http://www.electrontomography.org/) לעבד ניסויי מיצוע תת-tomogram, אולם הפרוטוקול מתואר חל בדרך כלל ברוב ניסויי מיצוע תת-tomogram תהליך packages16to תוכנת מיצוע תת-tomogram זמין, עם זאת הפרוטוקול מתואר חל בדרך כלל ברוב חבילות תוכנת מיצוע תת-tomogram זמין 16-18.

  1. עם tomogram המשוחזר בספריית העבודה הנוכחית לפתוח את tomogram לקטיף חלקיקים שהרצת הפקודה:
    tomopick .rec <שם הקובץ>
    כאשר <שם קובץ> הוא כמו ב4.2.2. בחלון שנפתח להשתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי ללחוץ על ראשון גוף הבסיסי ולאחר מכן את קצה המחט כדי לבחור injectisome ולהשתמש בחץ-מפתחות למעלה ולמטה כדי ריף דרך פרוסות tomograM. בחר את כל injectisomes הגלוי באופן זה. זה מאחסן את הקואורדינטות בקובץ טקסט המגדירות את הציר של המבנה הארוך, כמו גם הערכה שתיים משלושת זוויות אוילר המתארים את הנטייה של המבנה.
  2. תמצית המחשוב 400 3 קוביות voxel מtomogram מרוכזות בנקודת האמצע של ציר זמן שהוגדר על ידי ביצוע הפקודה:
    קליפ שינוי גודל -cx <x> -cy <y> -cz <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
    <שם קובץ> .rec _001.mrc <שם הקובץ>
    כאשר <x>, <y>, <z> הן קואורדינטות נקודת האמצע של המבנה ו< שם הקובץ> הוא כמו ב4.2.2. הגודל של הקובייה שחולצה צריך להשתנות לפי המבנה והגדלת שימוש, וצריך להיות גדול מספיק כדי להקיף את המבנה של עניין, אשר למדגם זה הוא 400 3 voxels כראוי.
  3. תת-tomogram בפקטור של ארבעה כדי לצמצם את זמן חישוב ליישור ראשוני על ידי ביצוע הפקודה (סל) למטה מדגם:
    binvol -B 4 <שם הקובץ> _001.mrc _001.bin4.mrc <שם הקובץ>
    כאשר <שם קובץ> הוא כמו ב5.2.
  4. החל אוילר נקבע זוויות למשנה tomograms ולחשב את הממוצע העולמי לייצר התבנית הראשונית שהרצת הפקודה.
    I3totsum.sh
  5. יישר ולסווג תת-tomograms למטה נדגמו באמצעות מסכת סיווג בינארי של אזור cytoplasmic. לבצע מיצוע תת-tomogram בחלל פורייה כדי למזער את חפצי טריז חסר מאפיין של טומוגרפיה. לbinning 4 נתונים, אנא השתמש SAMPFACT = "4 4 4".
    i3mramsacls.sh
  6. תת-tomograms באמצעות חזור על שלב 5.5 מטה-נדגמו על ידי גורם משני (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") ופעם נוספת עם נתונים המקוריים (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
    i3mramsacls.sh

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמאות של minicells ס flexneri נאסף ומעובד כהראה באיור סכמטי 1 באמצעות tomoauto הבא הצינור מפורט באיור 2. הטיה-סדרה נאספו באמצעות 10 SerialEM, המאפשר לרכישת הטיה-סדרת תפוקה גבוהה בנקודות שנקבעו על ידי המשתמש במפות מונטאז נמוך הגדלה (איור 3). Micrographs נאסף באמצעות מצב מינון חלוקה על מצלמה מכשיר ישיר איתור להפחית מושרה קרן תנועת 22 (איור 4). Tomoauto מרכז תיקון תנועה לוקח אוסף של micrographs מינון מופרד עיבוד כל אחד עם 22 MOTIONCORR ומרכיב את התוצאות להטיה-סדרה להיות מעובד (סרט 1) נוספת.

היישום הכללי ביותר של tomoauto הוא האוטומציהיישור ג של הטיה סדרה ראשונית. Tomoauto מלחין ביצוע רציף של פקודות הכרחיות ב -13 IMOD ליישר גס ההטיה-הסדרה וליצור מודל fiducial ראשוני מעקב חלקיקי colloidal זהב במדגם, אשר בתורו השתמש כדי ליצור את היישור הסופי. הדיוק של מודל fiducial זה הוא חיוני לאיכות tomogram המשוחזר, וכך המשתמש יכול לבדוק חזותי מודל fiducial מחושב באופן אוטומטי לפני שתמשיך עם שחזור או לאחר מכן להטיה-סדרה שצריך להיות מעובד באופן ידני לזהות. איור 5 מראה שתי הטיה-סדרה גסה-מזדהות ומודל fiducial הנחוש כמו שנוצר על ידי tomoauto. איורים 5A, C להראות תמונות untilted ובשני מודל fiducial נכון עם נקודות מודל מרוכזות על סמני fiducial. איורים 5, D להראות מקביל tilt- סדרה ב 50 מעלות ואילו המודל באיור 5 באיור 5D סטו מסמני הזהב המקבילים שלהם והמודל אינו מתאים ליישור קנס. שגיאה זו ניתן למדוד כמותית כטעות שייר הממוצעת בין המרכז של נקודת המודל והמרכז הצפוי של סמן הזהב, וtomoauto יכול להיות מוגדר כדי להתריע בפני המשתמש כאשר השגיאה נמדדה עולה על סף המוגדרים על ידי משתמש כדי לזרז בדיקה. הטיה-סדרה המספיק מיושרות באופן אוטומטי ולאחר מכן יכולה להיות מתואמת באופן ידני. אנו מוצאים כי tomoauto מיישר בהצלחה כ -80% -90% ההטיה-הסדרה שנאספה (סרט 2) של.

לאחר הטיה-סדרה כבר מיושרת בהצלחה, זה חייב להיות משוחזר לtomogram הסופי. Tomoauto תוכנן כך שהמשתמש יכול להשתמש 13 IMOD או tomo3d 26 על מנת ליצור את השחזור הסופי. אנו משתמשים כעת לאomo3d לנצל כמה תכונות ביחידות מרובות ליבות מודרניות עיבוד מחשב (CPUs) כדי לצמצם את זמן השחזור מאוד. Tomogram הסופי כפי שמוצג באיור 6 וסרט 3 הוא 3-D נפח של המדגם צילם כי אז יכול לשמש לביאור סלולארי על ידי פילוח, או תת-tomogram ממוצע להשיג מידע ברזולוציה גבוה יותר של המכונות מולקולריות בתוך המדגם. תת-tomogram עליות מיצוע שני SNR ומקטין את החפצים המיוצרים על ידי חסר-הטריז ידי מיצוע של הרמות גבוהות של רעש בtomograms הפרט וניצול תת-tomograms המספר הגדול בסט מופץ גם של אוריינטציות אקראיות ביחס ל חסר טריז להגביל חפצים ולשפר את הרזולוציה הסופית. הממוצע תת-tomogram 2.7nm של ס 'שלם flexneri T3SS מוצג באיור 7 כהופקד בEMDB (EMD-2,667), אשר מציג את השיפור הגדול מסוגל עם עמיתים בטכניקה זוmpared לinjectisome מוצג בtomogram יחיד באיור 6.

איור 1
איור 1. סקירה סכמטי של טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה. השעיה נוזל קפוא במהירות ברשת EM וסט הטיה-סדרה של נאסף על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים מבוקר מחשב אוטומטי. Micrographs כתוצאה מכך הם מעובדים באופן אוטומטי באמצעות tomoauto ליצור tomogram. השלב האחרון הוא כאן ס מפולח minicell flexneri מtomogram שנוצר על ידי פרוטוקול זה מהו et al. 2,015 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תרשים זרימה של תהליך tomoauto. פירוט של העבודה tomoauto מראה כיצד הנתונים מעובדים מאוסף של micrographs מינון מופרד כל הדרך אל ממוצע תת-tomogram סופי. סימנים תת-תהליך פירוט המשימות שtomoauto קואורדינטות לעיבוד קלט על ידי הפעלת התוכנה המתאימה המוגדרת. סימנים הנתונים מראים פלט בדרך כלל לא בשימוש על ידי המשתמש, ואילו סימנים מסמך ומסמך מרובה של להראות את הפלט טיפל בפועל על ידי המשתמש. להציג לבסוף סימנים מראים שבו התערבות של משתמש מתרחשת בזרימת העבודה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
selecti רכישת איור 3. אצווה הטיה-סדרה עם SerialEM Navigator. פוזיציות של מפות מונטאז מאוחסנים כעמדות שלב (מוצגב) ברשימת נווט החלון מוצגת בצד השמאל של המסך, והמפה טעונה כעת מוצג בחלון החיץ יחד עם הנקודות נבחרות שכותרתו מבחינה מספרית עם צלב אדום הוסיף למפה לרכישה. נקודות רכישה מפורטות בתווית בחלון הניווט וניתן להגדיר לרכוש באמצעות תיבת הסימון "סדרת הטיה". אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. השפעה של תנועה-תיקון בנתונים מופרדים מינון. (א) מראה מיקרוסקופ untilted ולא תוקן, והדימוי תיקן תנועה (מעובד על ידי MOTIONCORR) מוצג ב( ב '), לעומת זאת הוא השתפר מעט לאחר תיקון. שיפור ניתן לראות יותר ככל הנראה על ידי מסתכל על transf פורייהORM של מיקרוסקופ לפני (ג) ולאחר תיקון (ד ') תנועה. תמונות EH להראות את אותו המידע, אבל עם מיקרוסקופ המוטה ב -60 מעלות, שבו הניגוד מצטמצם וטבעות Thon גלויות בC ו- D הם כבר לא נראה לעין בהטיה גבוהה. בר סולם 250 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. תוצאות טובות ורעות של יישור הטיה-סדרת tomoauto האוטומטית. מודל fiducial הנחוש בהטית 50 מעלות מיקרוסקופ מיושר בערך untilted () והמודל fiducial מיוצר באופן אוטומטי באמצעות tomoauto. (ב). המודל עדיין משתלב היטב, והוא מרוכז בסמני fiducial המתאימים. (C, D) ב( A, B) בהתאמה, זינק באזור התאגרף. הטיה-סדרה זו מיושרת עם שגיאת שייר ממוצעת של 1.06 פיקסלים. (E) מיקרוסקופ untilted ומודל fiducial מאחר הטיה-סדרה ו( F) הסדרה בהטית 50 מעלות. כאן אנו רואים מודל שאיבד את המסלול של כמה סמני fiducial (מוצג באדום) ואת זה הוא נציג של מעקב אוטומטי רע. (G, H) מציג את המודל ב( E, F) בהתאמה, זינקה באזור התאגרף. הטיה-סדרה זו מיושרת עם שגיאת שייר ממוצעת של 3.51 פיקסלים ונאלצה להיות מעובד על ידי יישור ידני של הסדרה. בר סולם () 500 ננומטר ננומטר בר 50 (ג) בקנה מידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6 איור 6. Tomogram שנוצר באופן אוטומטי על ידי tomoauto. (א) זו מציגה הקרנה של שבע פרוסות ממרכז השיקום של ההטיה הסדרה מוצגת באיור 4 א. בר סולם 250 ננומטר. (ב) תקריב במבט של האזור התאגרף ב() בו מוצגות injectisome שלמה. בר סולם 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
ממוצע 7. תת-tomogram איור של ס 'שלם מערכת הפרשת הסוג השלישית flexneri. הפרוסה מרכזית של ממוצע משנה tomogram 2.7 ננומטר של ס 'שלם () הקרנה מלאה flexneri T3SS מEMDB (EMD-2,667). (ב) יחדציר ה- X של הנפח. (ג) טיוח Isosurface של הנפח צפו בסף גובה של 130 בIMOD. בר סולם 5 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט 1
סרט 1: אנימציה של הטיה סדרת בלתי-תלויה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). אנימציה זה עוברת בהטיה-הסדרה כתחילה נאספה על ידי SerialEM. משמרות Translational מזוהות בקלות על ידי הנתיב יציב של סמנים בודדים fiducial מתמונה לתמונה, ומשמרות אלה יחד עם פגמים פחות מורגשות חייבים להיות מתוקנים לפני ההטיה-הסדרה ניתן לשחזר.

סרט 2 סרט 2: אנימציה של הטיה סדרה מיושרת (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). אנימציה זה עובר באותו micrographs מוצג בסרט 1 לאחר יישור אוטומטי על ידי tomoauto. הנתיבים יציבים של סמני fiducial עכשיו אחרי מסלול חלק באמצעות ההטיה-הסדרה, ולהטות הציר מיושר אנכי ביחס לצופה.

סרט 3
סרט 3:. אנימציה של הטיה סדרה משוחזרת (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד) אנימציה זה עובר tomogram מוצג בשחזור אוטומטי לאחר איור 6 שנוצר מההטיה-הסדרה המוצגות בסרט 2 בtomoauto y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת התפוקה גבוהה המתוארות כאן אפשרה לנו להטות סדרת 1,917 cryo לעבד ולייצר מעל 4,500 תת-tomograms של ס 'שלם flexneri injectisome 19. הנתונים שנאספו הובילו לאפיון מפורט של בinjectisome אתר, לרבות cytoplasmic מיון מורכב. השיטה נוצלה גם כדי להמחיש כמה תאים שעברו מוטציה עם מחיקה ספציפית של רכיבי חלבון משוערים, שסייעו להבהיר את ההרכב של פלטפורמת המיון של injectisome. השיטה שלנו סיפקה אפיקים חדשים כדי לחקור את יחסי מבנה-תפקוד של injectisome. כתוצאה מכך, השלב החדש נקבע לנתיחה נוספת של מנגנוני הפרשה בתיווך T3SS ופתוגנזה.

הפרוטוקול המובא כאן מתאר תפוקה גבוהה cryo-ET של ס 'שלם flexneri, אבל חל על כל פרויקט מתאים לcryo-ET. שיטה זו נעשתה שימוש בstructuאפיון RAL של מנוע flagellar של 27 burgdorferi Borrelia, הזיהום של א ' minicells coli על ידי T7 bacteriophage 28, ומערכי chemoreceptor בE. coli 29. על ידי הקלת האוסף של מערכי נתונים מסיביים, ניתן להקרין מוטציות מרובות, כמו גם תמונה מספר רב של תנאים המאפשרים הסקת מסקנות של תהליכים דינמיים כגון הרכבה מכונה 27 והתקדמות של זיהום הפאג 28. על ידי איסוף חבילות תוכנה רבות ומאפשרים שליטה מלאה על ביצוע עיבוד, משתמשים יכולים להתאים אישית את שילובים שונים של חבילות לתוצאות אופטימליות. חן et al. 21 שפורסם בעבר בפרוטוקול דומה המתאר איסוף נתונים באמצעות חבילת תוכנת 12 Leginon ואוטומציה עיבוד הטיה-סדרה באמצעות 13 IMOD וRAPTOR 24. הפרוטוקול הנוכחי משלים בשיטה זו מפרטת שיטה חלופית לשיתוףנתונים llecting ועיבוד בזמן גם מראים עד כמה הטכנולוגיה וההליך מתקדמת, המונעות על ידי ההתמקדות המוגברת ברזולוציה גבוהה באמצעות מיצוע תת-tomogram, עם נתונים מינון מופרד, הערכת CTF אוטומטית ותיקון, ושגרה יישור אוטומטי חזקים יותר בתוך 13 IMOD. בעוד הפרוטוקול הקודם נכנס לפרטים חזותיים עם דגש על איסוף הנתונים, שיטה זו מתמקדת בפרטים של עיבוד הנתונים שנאספו.

שיטות תפוקה גבוהה מאפשרות איסוף נתונים מסיבי כי למקסם את השימוש במשאבי המחשב ומיקרוסקופ, תוך הגבלת הסכום של התערבויות מדריך למשתמש מייגע שלהאט את הפרויקט ולפעול כצוואר בקבוק עיקרי. Tomoauto ספריית המעטפת תוכנן כדי לאפשר תצורה מלאה של כל הפרמטרים המשמשים בכל חבילת תוכנה באופן פשוט וריכוזי. ברגע שתצורה מתאימה נקבעה, אז זה קל ליישום ההגדרות לכל דataset. רוב ההטיה-הסדרה יכולה להיות מעובד עם תוצאות מתקבלות על הדעת (איור 4 א), ואילו נדרש משנה קטין להיות מעובד באופן ידני. הטיה-סדרה אלה הן בדרך כלל רכישות פחות אידיאליים סובלות ממשמרת מוגזמת תמונה, לעומת זאת עני, או חוסר סמני fiducial מספיק שגורם לשגרת מעקב fiducial האוטומטית להיכשל (איור 4). כדי להשיג את tomograms הטוב ביותר האפשרי, טיפול נרחב יש לנקוט בכל צעד מכריע מהכנת מדגם, רכישת תמונה, לעיבוד תמונה.

עכשיו התפתחויות נוספות בתפוקה גבוהה cryo-ET כגון חילוץ אוטומטי תת-tomogram ידי התאמת תבנית והאינטגרציה של חבילות תוכנת מיצוע תת-tomogram המודרניות כגון דינמו לתוך צינורות זרימת עבודה קיימות כמו tomoauto נחקרות. ההופעה האחרונה של מצלמות מכשיר איתור ישיר מדור החדש הפכה שיפורים משמעותיים בהגדלת יחס אות לרעש הטיה-סדרה ומאפשר מורדואר נחישות CTF עקבי בשל היעילות גבוהה יותר של הגלאי. השימוש ברשת-סוגים חדשים זהב מלא עשויה להפחית פגמי אוסף הטיה-סדרה, שיפור אחוזי ההצלחה לעיבוד הטיה-סדרה אוטומטית ושחזור עם פחות צורך בהתערבות ידנית 30. לבסוף עם השימוש בכל מקום עכשיו של אשכולות מחשב ויחידות עיבוד גרפיים (GPU) למקבל ולהאיץ את עיבוד נתונים גדול, פיתוח של צינורות שיכולים לנצל מערכות אלה בקרוב אני מקווה שתוכל לקצר את זמן ביצוע מימים לשעות, מספק למשתמשים עדיין אפילו פחות זמן השבתה שבבין עיצוב ניסוי וניתוח נתונים משמעותי ועדיין הגדלת גודל בסיס הנתונים והשיגו רזולוציות גבוהות יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר ויליאם מרגולין להערות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה בSerialEM מבני הזוג. דוד Mastronarde וחן שו. DM, BH וJL נתמכו על ידי גרנט R01AI087946 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מענקי R01GM110243 וR01GM107629 מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (NIGMS), וגרנט AU-1,714 מהקרן וולש. גלאי האלקטרונים הישירים מומנו על ידי המכון הלאומי לבריאות בפרס S10OD016279.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Tyrptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092
Spectinomycin Sigma-Aldrich S0692
Electroporation Apparatus Bio-rad 165-2100
1 mm Cuvette BTX 45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube Thermoscientific 5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube Sigma-Aldrich Z336769
Holey Carbon Grids Quantifoil
(Electron Microscopy Sciences)		 Q2100CR2 R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device In-House Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator Sigma-Aldrich Z119016  Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator Electro-Technic Products BD-10A Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps Dumont
(Electron Microscopy Sciences)		 72705-D Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold Aurion BSA 10nm
Filter Paper Whatman #2
Ethane  Matheson Tri-Gas UN1035
Nitrogen Matheson Tri-Gas UN1977
Plunger Device In-House Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box Electron Microscopy Sciences 71166-30
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai Polara F30
(300 KeV)
Direct Detection Device Camera Gatan K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software SerialEM http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software MOTIONCORR http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software IMOD http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software IMOD Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0
(Usable in tomoauto)
CTF Determination Software IMOD Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
(Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software tomo3d https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software tomoauto https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software i3 http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software i3 Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
  2. Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
  3. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  4. Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
  5. Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
  6. Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
  7. Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
  8. Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  9. Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
  10. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  11. Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
  12. Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
  13. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  14. Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
  15. Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
  16. Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
  17. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
  18. Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
  19. Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
  20. Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
  21. Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
  22. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  23. Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
  24. Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
  25. Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
  26. Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
  27. Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
  28. Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
  29. Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
  30. Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 107, cryotomography אלקטרון. הפתוגן חיידקים minicell הפרשת חלבון injectisome מכונות מולקולריות ניתוח תמונת תפוקה גבוהה
באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using … More

Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. J. Vis. Exp. (107), e53608, doi:10.3791/53608 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter