Summary
Vi presenterar ett protokoll om hur man använder hög genomströmning Cryo-elektron tomografi att bestämma hög upplösning in situ strukturer av molekylära maskiner. Protokollet tillåter stora mängder data som ska behandlas, undviker vanliga flaskhalsar och minskar resursdriftstopp, så att användaren kan fokusera på viktiga biologiska frågor.
Introduction
Typ III-sekretionssystem (T3SS) är viktiga virulensdeterminanter för många gramnegativa patogener. Den injectisome, även känd som nålen komplexa, är den centrala T3SS maskinkod som erfordras för direkt translokation av effektorproteiner från bakterien i eukaryota värdceller 1, 2. Den injectisome innefattar en extracellulär nål, en basal kropp och en cytoplasmisk komplex också känd som sorterings komplex 3. Tidigare studier har klar 3-D strukturer av renade injectisomes från Salmonella och Shigella, tillsammans med atom strukturer av stora basala kroppsproteiner 4, 5. Senaste in situ strukturer av injectisomes från Salmonella, Shigella och Yersinia avslöjades av Cryo-ET 6 7. Den cytoplasmatiska komplexa, viktigt för effektor urval och nålenhet, inte har visualiseras i dessa strukturer.
Cryo-ET är most lämplig teknik för att avbilda molekylära maskineriet på nanometerupplösning inom dess naturliga cellulära sammanhang (in situ). Ändå är uppnåeliga upplösningen av Cryo-ET begränsas av provtjocklek. För att övervinna nackdelen, avbildas vi intakta injectisomes i en virulent Shigella flexneri stam som var genetiskt modifierad att producera miniceller tunna nog för Cryo-ET. En annan begränsning hos kryo-ET är känsligheten hos provet för strålningen som induceras av elektronstrålen, vilket mycket snabbt förstör den högupplösta informationen i provet. Som ett resultat, är extremt låga doser som används för enskilda tilt-bilder så att en lämplig dos kan fördelas mellan full tilt-serien. Detta sänker kraftigt signal-brusförhållande (SNR) i den slutliga återuppbyggnaden, vilket gör det svårt att skilja de strukturella drag i ämnet från den stora mängden brus i tomogram och begränsar den resolution som kan åstadkommas genom cryo- ET. ConventiOnal bildbehandling såsom Fourier-och verkliga rymdfilter samt ned provtagning kan användas för att öka kontrasten, men på bekostnad av att filtrera bort mycket av informationen med hög upplösning. Nyligen har under tomogram genomsnitt gjort det möjligt att kraftigt öka SNR och därefter den slutliga resolutionen i vissa fall till sub-nanometer nivå 8, 9. En mer detaljerad analys av komplex möjliggörs genom beräknings extrahera tusentals under tomogram innehåller intresseområden från de ursprungliga tomogram och sedan inriktnings och genomsnitt under tomogram att avgöra in situ komplexa strukturer med högre SNR och högre upplösning. Dessa metoder kan integreras med genetiska metoder för att ge ännu större insikt i makromolekylära församlingar och deras dynamiska konformationer i den nativa cellulära sammanhanget.
I allmänhet, tiotals eller hundratals tusen under tomogram måste genomsnitt för att fastställa höga-resolution strukturer in situ. Förvärvet av ett tillräckligt antal tilt-serien som behövs för att producera denna mängd under tomogram blir snabbt en flaskhals. Den resulterande tilt-serien ofta drabbas av balk inducerad skift, scen motreaktion, liksom förstoring, rotation och skeva brister, som måste lösas för att få tilt-serien i linje före återuppbyggnad. Lutnings serien typiskt linje med spårning guld referensmarkörer, som traditionellt väljs manuellt genom inspektion av tilt-serien, som orsakar ytterligare en flaskhals. Många programvarupaket har utvecklats för automatiserad tilt-serien förvärv genom datorstyrda elektronmikroskop 10, 11, 12, tilt-serien anpassning och återuppbyggnad 13, 14 och sub-tomogram genomsnitt 15-18. Eftersom dessa paket hanterar diskreta verksamhet i arbetsflödet för Cryo-ET, blir det önskvärt att bygga en högre abstraktionsnivå i processen till systemaiskt effektivisera hela systemet i en enda pipeline. Därför har vi utvecklat en programvara omslag bibliotek "tomoauto" för att organisera ett antal av dessa paket till en enda halvautomatisk enhet, vilket möjliggör enkelt användargränssnitt drift medan fullständig konfiguration av varje komponent upprätthålla ett centraliserat sätt. Biblioteket är öppen källkod, väl dokumenterade, utvecklas kontinuerligt och fritt tillgängliga för användning, skräddarsydd utveckling eller ytterligare integration med hjälp av en online fjärrkällkoden slutförvar (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Denna hög genomströmning Cryo-ET rörledningen har använts för att visualisera intakta injectisomes i S. flexneri miniceller. Totalt 1.917 tomogram genererades med användning av denna metod, avslöjar en hög upplösning in situ struktur intakt maskin innefattar den cytoplasmatiska sorterings plattformen bestäms av under tomogram averaging 19. Tillsammans med molekylär modellering av vild-typ och mutant maskiner, ger vår hög genomströmning pipeline en ny väg för att förstå strukturen och funktionen hos den intakta injectisome i det ursprungliga cellulära sammanhanget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Minicell Framställning
- För att göra S. flexneri miniceller, transformera 1 l av plasmiden pBS58, som konstitutivt uttrycker Escherichia coli-cell division gener ftsQ, ftsA och ftsZ från en låg-kopia spektinomycin-resistent plasmid i fem pl elektrokompetent streptomycin-resistent serotyp 5a (M90T-Sm) celler genom elektroporation vid 2,5 kV under 5 ms i 1 mm kyvetter.
- Förvara Minicell proverna vid -80 ° C i 15% glycerol i en 1,5 ml kryogenisk mikrorör. När du är klar för användning, skrapa cirka 5 pl av celler från unthawed mikrorör med hjälp av en pipett spets och suspendera cellerna i 4 ml tryptisk sojabuljong med spektinomycin sattes till 100 mikrogram / ml koncentration. Grow O / N vid 37 ° C.
- Pipettera 2 ml av kulturen från 1,2 till 200 ml tryptisk sojabuljong med spektinomycin åter lades till 100 | ig / ml koncentrationer. Odla vid 37 ° C till sen log-fas.
- För att berika miniceller, centrifug200 ml av kulturen från 1,3 vid 1000 xg under 5 min. Häll försiktigt supernatantfraktionen till ett nytt centrifugrör och centrifugera vid 20 tusen xg under 10 min. Häll försiktigt av och kassera supernatanten fraktionen och blanda försiktigt pelleten med den återstående vätskan med användning av en pipettspets och överföra ungefär 100 pl av pelleten blandningen till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
2. EM Grid förberedelse
- Placera en R2 / 2 holey kolfilm 200-mesh koppargaller kol sidan upp på ett objektglas.
NOTERA: En R2 / 2 200-mesh grid är vald för att maximera antalet lutnings-serier som kan ställas in för att förvärva i en enda ruta, medan fortfarande stöder provet och placera kanten av kolfilmen på området för kamerans vid den önskade förstoringen. Finare mesh nät och mindre holey kol film såsom R1.2 / 1,3 400 mesh kan användas för prover avbildas vid högre förstoring; större holey kol filmer som R3.5 / 1 200-nät kan användasd för prover avbildas vid lägre förstoring eller om mikroskop inte bör innehålla kol kanten och holey kolfilmer med större mellanrum som R1 / 4 200 mesh kan användas för att underlätta med inriktning på scenen till området av intresse och skydda områden från överexponering att fokusera och spårning rutiner. - Placera bilden på plattformen i en glimurladdning enhet.
OBS: Vi använder ett internt anordning i vilken en anod och plattformen har bearbetats i en vakuumtorkapparat och drivs av en högfrekvensgenerator. Efter att skapa ett vakuum, fäst högfrekvensgeneratorn sond till anoden och kraft på sonden för en min för att glimurladdning gallret. Den tid som behövs för att glimurladdning gallret kan variera från några sekunder till en minut. Varierande tid glimurladdningen kan användas för att diagnostisera problem med provkoncentration och galler som visas torr utan glaskroppen is. - Ta bort gallret med en uppsättning av tång, och lås pincetten avslutades med en elastisk boch.
- Tillsätt 100 ni 10 nm kolloidalt guld lösning på mikrocentrifugrör med miniceller framställda i 1,4 och blanda genom att försiktigt ställa röret med ett finger. Med en ny pipett plats 4 pl av blandningen på nätet som framställts i 2.2.
OBS: Kolloidalt guld finns i olika storlekar och försiktighet bör iakttas så att storleken på guld är större än 5 pixlar med tanke på pixelstorlek på mikrofotografierna som ska behandlas vid den förvärvade förstoring utan att vara för stor för att obskyra funktioner av intresse. - Förbered steget frysapparaten; fylla den yttre frysning behållare med flytande kväve och sedan fylla den inre kammaren med flytande etan. Fäst tången med gallret till kolvstången och låsa kolvstången i den upplyftade positionen.
OBS: Se Iancu m.fl. 20 för ett protokoll som beskriver användningen av en kommersiell dopp-frysapparat.. - Blot gallret genom att försiktigt röra en bit filterpapper till tHan släpper av provet tills menisken mellan galler och filterpapper separerar och uppsugning på filterpapper stannar sedan omedelbart släppa kolvstången, frysning nätet. Försiktigt bort tången från kolvstången och placera gallret i ett rutnät hållare.
- Förbered Cryo-EM överföringsstation genom att fylla lastområdet och absorption pump behållare med flytande kväve. När lastytan är flytande kväve temperatur plats gallerhållare och ett mikroskop provpatron i lastutrymmet.
- Försiktigt bort låsringen, som antingen är en liten gängad låsring på tidigare Polara mikroskop eller en C-stil klämringen på senare modeller; Placera EM rutnätet i kassetten med hjälp av pincett och sedan försiktigt sätt tillbaka låsringen tillbaka till patronen säkra nätet.
- Ta bort flera provhållaren från mikroskopet och bifoga det till överföringsstationen. Placera provet patronen i hållaren med hjälp av patron pincett end dra hållaren från lastningsområdet och överföra flera provhållare tillbaka till mikroskop.
OBS: Se et al Chen 21 för en visuell protokoll detaljer 2,1-2,9..
3. hög kapacitet Automatiserad Tilt-serien Collection
- Insamling av Maps lågförstorande
- Öppna ett nytt Navigator fönster genom att klicka på "Öppna" i "Navigator" meny med SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Hitta rutor som innehåller godtagbara avbildningsbetingelser (dvs, tunn is, ingen förorening, föremål för intresse) med fluorescerande skärmen lågförstorande (~ 2,300X för Minicell provet).
OBS: [Tillval:. Detta steg kan automatiseras med SerialEM genom montaging hela nätet, men kan det gå snabbare att bara välja ut några områden manuellt] - Ställ scenen till eucentric höjd genom att luta provhållaren till 50 ° och justeraz-höjd tills xy översättningen av scenen är minimal mellan de lutande och icke vridna vyer.
- Flytta till mitten av ruta och klicka på "Lägg till Stage Pos" knappen i Navigator fönstret för att lagra den aktuella scenen positionen.
- Upprepa steg 3.1.1-4 ovan tills alla acceptabla rutor scenlägen har sparats.
- Öppna ett nytt montage MRC-fil genom att klicka på "Ny montage" i menyn "File". I Montage Setup Dialog som öppnar upp, välja ut ett antal bitar i X och Y som kommer att förvärva hela ruta (t.ex. 10 x 10 för en standard 200 mesh grid). Använd en hög binning såsom 8 och välj "Flytta scenen i stället för Skifta Bild" och "Skip korrelationer som används för att rikta in pieces" radioknappar.
- I Navigator-fönstret klickar du på första etappen läget och ställ in den förvärvas genom att markera "Acquire" kryssrutan. Upprepa detta för varje etapp position i Navigator-fönstret.
- Öppna Navigator Acquire Dialog genom att klicka på "Hämta vid punkter" i "Navigator-menyn. Ta en titt på "Acquire kartbilden" och "Rough eucentricity kryssrutan och se till att alla andra kryssrutor är avmarkerade. Klicka på "Fortsätt" för att samla in ett montage i varje skede läge.
- Tilt-serien Förvärv
- I Navigator fönstret väljer ett av de förvärvade kartor och klicka på "Load kartan" -knappen.
- I Navigator-fönstret klickar du på "Lägg till Points" knappen och välj punkter på kartan där för att få en tilt-serien. Klicka sedan på "Stop Lägga Points" -knappen. Upprepa för varje karta samlas.
- På menyn Kamera väljer "Parametrar" och definiera parametrarna för Focus, Trial och Record lägena. [Valfritt:. Dos-fraktion uppgifter kan anges i parametrarna för inspelningsläget]
- Välj en punkt i Navigator fönstret och kontrollera "Tilt-serien9; kryssrutan. I dialogrutan Utskrifts fönstret Tilt-serien som öppnas väljer du de parametrar som önskas för tilt serien samling. Upprepa för resten av de utvalda punkter i Navigator-fönstret, men markerar inte kartorna.
- I Navigator-menyn igen välj "förvärva Points". I Navigator Acquire dialogrutan välja "Rikta punkt", autofokus "och" Rough eucentricity "som förarbeten, och välj" Hämta tilt-serien "som den primära uppgiften och välj" Stäng kolonnventilerna i slutet "för att stänga kolonnen när alla av de punkter har samlats in. Vid fortsätter en tilt-serien kommer att samlas vid varje punkt i varje karta.
4. hög kapacitet Automatiserad Tilt-serien Bearbetning och återuppbyggnad Använda Tomoauto
- Korrigering av Beam-inducerad Motion i Dos-fraktione uppgifter [frivilligt]
Anmärkning Tomoauto använder MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) för att avlägsna balk inducerad rörelse från dos-fraktionermikrofotografier. NOTIONCORR 16 måste vara installerat på datorn.- Med den ursprungliga tilt-serien, utgångsloggen från SerialEM 10 och de individuella dos fraktion bilder alla i den aktuella arbetskatalogen, i en terminal kör kommandot:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> är namnet på tilt-serien att bearbeta.
- Med den ursprungliga tilt-serien, utgångsloggen från SerialEM 10 och de individuella dos fraktion bilder alla i den aktuella arbetskatalogen, i en terminal kör kommandot:
- Anpassning och återuppbyggnad av Tilt-serien
OBS: Tomoauto som standard använder IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) för att hantera tilt-serien automatiserade förankrings modell generation, anpassning, bestämning av kontrastöverföringsfunktionen (CTF), CTF-korrigering 23, och rekonstruktion. Alternativt kan användare har möjlighet i tomoauto att använda RAPTOR 24 (ingår i imod) för automatiserad förankrings modell generation, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) för att bestämma CTF, och tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) för återuppbyggnad eller i någon kombination av programvarupaket från konfiguration. Denna konfiguration samt de parametrar som finns i varje förpackning hanteras av en global konfigurationsfil som kan redigeras för att passa de värden som oftast används i ett labb medan lokala konfigurationsfiler även kan skapas för att detalj parametrar som används för ett visst prov, samling ställa in eller individuell tilt-serien. Alla paket som vill ska användas måste vara installerat på datorn.- Med tilt serien i den aktuella arbetskatalogen, i en terminal kör kommandot
tomoauto --CTF --mode = align <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> är lutningen-serie som ska bearbetas och <fid_diam> är Diameter av de referensmarkörer i nanometer. Detta kommando kommer att anpassa och uppskatta CTF av tilt serien automatiskt. Det är möjligt att hoppa CTF behandling genom att ta bort --CTF alternativ från kommando. - Inspektera inriktade tilt-serien visuellt för några uppenbara fel i inriktnings bearbetning och inspektera den uppskattade CTF genom att köra kommandona:
3dmod <filnamn> .ali
submfg <filnamn> _ctfplotter.com
respektive, där <filnamn> är namnet på tilt-serien utan suffix. Kontrollera även utdata från kommandot tomoauto att se den genomsnittliga kvarstående fel som genereras av inriktningen, vilket är en kvantitativ statistik anpassningen kvalitet. - Med tanke på en godtagbar anpassning vidare bearbetning genom att köra kommandot:
tomoautill --CTF --mode = rekonstruera <filename.st> <fid_diam>
med samma användar ersättningar som i 4.2.1. Detta kommando kommer att korrigera CTF, radera referensmarkörer från tilt-serien och beräkna återuppbyggnaden. Återigen CTF behandling kan hoppas över som i 4.2.1. - [valfritt] För att hoppa över visuell inspektion steget och helt automatisera bearbetning och rekonstruktion utföra kommandot
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [valfritt] För att använda en specifik lokal konfiguration finns i tomoauto dokumentation om hur man skapar en lokal konfigurationsfil, och sedan köra kommandot
tomoauto [alternativ] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
där <local_config> är namnet på den lokala configuration fil.
- Med tilt serien i den aktuella arbetskatalogen, i en terminal kör kommandot
5. Under tomogram Snittar
OBS: Vi använder i3 paketet 15 (http://www.electrontomography.org/) för att behandla under tomogram Snittar experiment, men det protokoll som beskrivits gäller generellt för de flesta tillgängliga sub-tomogram medelvärdes programvara packages16to process sub-tomogram medelvärdes experiment men det protokoll som beskrivs gäller generellt för de flesta tillgängliga sub-tomogram medelvärdesprogramvarupaket 16-18.
- Med den rekonstruerade tomogram i den aktuella arbetskatalogen öppna upp tomogram för partikel plockning genom att köra kommandot:
tomopick <filnamn> .rec
där <filnamn> är som i 4.2.2. I fönstret som öppnas använder vänster musknapp för att klicka på först den basala kroppen och sedan nålspetsen att välja en injectisome och använd upp och ner piltangenterna för att Riff genom skivor av tomogram. Välj alla synliga injectisomes på detta sätt. Detta lagrar koordinaterna i en textfil som definierar den långa axeln hos strukturen samt uppskatta två av de tre Eulervinkel beskriver orienteringen av strukturen. - Beräknings extrakt 400 3 voxel kuber från tomogram centrerad vid mittpunkten av den definierade längdaxel genom att köra kommandot:
klipp storleks -CX <x> -CY <y> -CZ <z> -IX 400 -iy 400 -iz 400
<filnamn> .rec <filnamn> _001.mrc
där <x>, <y>, <z> är mittpunkten koordinaterna för strukturen och <filnamn> är som i 4.2.2. Storleken på den extraherade kuben bör variera beroende på strukturen och förstoringen som används och bör vara tillräckligt stort för att på lämpligt sätt innesluta strukturen av intresse, som för detta prov är 400 3 voxlar. - Down-prov (bin) under tomogram med en faktor av fyra att minska beräkningstiden för initial inriktning genom att köra kommandot:
binvol -b 4 <filnamn> _001.mrc <filnamn> _001.bin4.mrc
där <filnamn> är som i 5.2. - Applicera bestämd Euler vinklar till under tomogram och beräkna det globala genomsnittet för att producera den ursprungliga mallen genom att köra kommandot.
I3totsum.sh - Rikta och klassificera under tomogram ner i urvalet med hjälp av en binär klassificering mask av den cytoplasmatiska området. Utför sub-tomogram genomsnitt i Fourier utrymme för att minimera de saknade kil artefakter karakteristiska för tomografi. För binning 4-data, använd SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Upprepa steg 5.5 använder under tomogram ner samplas med en faktor två (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") och ytterligare en gång med de ursprungliga data (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prover av miniceller S. flexneri uppsamlades och bearbetades såsom visat i den schematiska fig 1 med användning tomoauto följa rörledningen i detalj i figur 2. Tilt-serien samlades med hjälp av SerialEM 10, vilket möjliggör hög genomströmning tilt-serien förvärv vid punkter som utsetts av användaren på låg förstoring montage kartor (Figur 3). Mikrofotografier uppsamlades med användning av dos-fraktioneläge på en direktdetekteringsanordning kamera för att minska strålens rörelse orsakad 22 (figur 4). Tomoauto samordnar rörelse korrigering med en samling av dos-fraktion mikrografier bearbetning vardera MOTIONCORR 22 och monterar resultaten i en lutning-serie som ska bearbetas (Film 1) vidare.
Den mest generella tillämpning av tomoauto är abonnemangsc inriktning av en initial lutning-serien. Tomoauto komponerar sekventiell exekvering av de nödvändiga kommandon i imod 13 till grovt anpassa tilt-serien och generera en första förankrings modell spåra koUoidala guldpartiklar i provet, som i sin tur används för att generera den slutliga justeringen. Riktigheten i denna förankrings modell är avgörande för kvaliteten på det rekonstruerade tomogram, och så att användaren kan visuellt inspektera automatiskt beräknade förankrings modell innan du fortsätter med ombyggnad eller efteråt för att identifiera tilt-serien som ska behandlas manuellt. Figur 5 visar två tilt-serien grov linje och den fastställda förankrings modellen som genereras av tomoauto. Figurerna 5A, C visar det icke vridna bilder och i både förankrings modellen är korrekt med modellpunkter centrerade på referensmarkörer. Figurerna 5B, D visar motsvarande tilt- serie på 50 grader och medan modellen i figur 5B figur 5D avvikit från deras motsvarande guldmarkörer och modellen är inte lämplig för fina inriktning. Detta fel kan mätas kvantitativt som den genomsnittliga kvarstående fel mellan centrum av modellpunkt och den sannolika centrum av guldmarkören och tomoauto kan konfigureras för att varna användaren när den uppmätta felet överskrider en användardefinierad tröskel för att påskynda inspektion. Tilt-serie som är otillräckligt inriktade automatiskt kan sedan anpassas manuellt. Vi finner att tomoauto anpassar framgångsrikt cirka 80% -90% av vår samlade tilt-serien (film 2).
Efter en tilt-serien har framgångsrikt anpassats, måste rekonstrueras i den slutliga tomogram. Tomoauto har utformats så att användaren får använda IMOD 13 eller tomo3d 26 för att generera den slutliga rekonstruktionen. Vi använder för närvarande tomo3d att dra nytta av flera funktioner i moderna multi-core datorbehandlingsenheter (CPU) för att kraftigt minska återuppbyggnadstiden. Den slutliga tomogram som visas i figur 6 och Movie 3 är en 3-D volymen av den avbildade provet som sedan kan användas för cellulär anteckning genom delning eller sub-tomogram genomsnitt att få högre informations av den molekylära maskiner i prov upplösning. Sub-tomogram medelvärdes ökar både SNR och minskar artefakter som produceras av de saknade-kilen genom att ta medelvärdet de höga bullernivåer i enskilda tomogram och utnyttja det stora antalet under tomogram i en väl fördelad uppsättning av slumpmässiga orienteringar i förhållande till saknade kil för att begränsa artefakter och förbättra den slutliga resolutionen. Den 2.7nm under tomogram genomsnitt av den intakta S. flexneri T3SS visas i Figur 7 som deponeras i EMDB (EMD-2667), vilket visar den stora förbättringen i stånd med detta samarbete teknikmpared till injectisome visas i en enda tomogram i figur 6B.
Figur 1. Schematisk översikt av hög genomströmning Cryo-elektron tomografi. En flytande suspension fryses snabbt på ett EM rutnät och en uppsättning lutnings-serien uppsamlas genom ett automatiserat datorstyrt elektronmikroskop. De resulterande mikrografer bearbetas automatiskt med tomoauto att generera tomogram. Det sista steget här är en segmenterad S. flexneri Minicell från en tomogram som genereras av detta protokoll från Hu et al. 2015 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Flödesschema för tomoauto process. En uppdelning av tomoauto arbetsflöde visar hur data behandlas från en samling av dos-fraktionmikrofotografier hela vägen till en slutlig under tomogram genomsnittet. Delprocess symboler detalj de uppgifter som tomoauto koordinater för att bearbeta indata genom att köra konfigurerade lämplig mjukvara. Data symboler visar utgång i allmänhet inte används av användaren, medan dokument och multi-dokument symboler visar produktionen faktiskt hanteras av användaren. Slutligen visa symboler visar var användaren ingripande sker i arbetsflödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Batch tilt-serien förvärv med SerialEM Navigator. Positioner för montage kartor lagras som scenlägen (visas selectipå) i fönstret listan Navigator visas på vänster sida av skärmen, och för närvarande är laddad karta visas i buffertfönstret tillsammans med de valda punkterna märkta numeriskt med ett rött kryss läggs till kartan för förvärv. Förvärvs punkter listas med etikett i Navigator fönstret och kan ställas in för att få med kryssrutan "Tilt-serien". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekt av rörelse korrigering dos-fraktion data. (A) visar en icke vridna och okorrigerat mikrofotografi, och rörelse korrigerade bilden (bearbetas av MOTIONCORR) visas i (B), är kontrasten förbättrades något efter korrigering. Förbättring kan ses uppenbarligen genom att titta på Fourier transform av mikrofoto före (C) och efter (D) rörelse korrigering. Bilder EH visar samma information, men med ett mikro lutar i 60 grader, där kontrasten minskat och Thon ringar syns i C och D är inte längre syns vid hög lutning. Skala bar 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Goda och dåliga resultat av tomoauto automatiserade tilt-serien inriktning. (A) En icke vridna ungefär i linje mikrofotografi och de referensmodellen produceras automatiskt med tomoauto. (B) Den bestämda förankrings modellen på 50 grader tilt. Modellen passar fortfarande väl och är centrerad på lämpliga referensmarkörer. (C, D) (A, B) respektive, zoomas in på den inramade området. Denna lutning-serien i linje med en genomsnittlig restfel av 1,06 pixlar. (E) En icke vridna mikrofotografi och referenspunkternas modell från en annan lutning-serien och (F) serien på 50 grader tilt. Här ser vi att modellen har förlorat kontakten med flera referensmarkörer (visas i rött) och detta är representativt för en dålig automatiserad spårning. (G, H) Visar modellen i (E, F) respektive, zoomas in på den inramade området. Denna lutning-serien i linje med en genomsnittlig restfel av 3.51 pixlar och måste behandlas genom manuell justering av serien. (A) Skala bar 500 nm (C) Skala bar 50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
![Figur 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figur 6. tomogram genereras automatiskt av tomoauto. (A) Detta visar en projektion av sju skivor från mitten av återuppbyggnaden av tilt serien visas i figur 4A. Skala bar 250 nm. (B) en inzoomad med tanke på den inramade området i (A) visar en intakt injectisome. Skala bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Under tomogram genomsnitt intakt S. flexneri typ III-sekretionssystemet. (A) Central bit av 2,7 nm sub-tomogram genomsnitt av den intakta S. flexneri T3SS från EMDB (EMD-2667). (B) Full projektion längsX-axeln av volymen. (C) isosurface rendering av volymen tittade vid en kontur tröskelvärde på 130 i imod. Skala bar 5 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Animation av icke-justerade tilt-serien (Högerklicka för att ladda ner). Denna animation går genom tilt-serien som ursprungligen samlats in av SerialEM. Translationella förändringar är lätt identifieras genom oberäkneligt väg individuella referensmarkörer från bilden till bilden, och dessa förändringar tillsammans med mindre märkbara brister måste åtgärdas innan lutningen-serien kan rekonstrueras.
![Movie 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Film 2: Animation av linje tilt-serien (Högerklicka för att ladda ner). Denna animation går genom samma mikrofotografier som visas i filmen 1 efter automatisk justering av tomoauto. De oregelbundna vägar referensmarkörer följer nu en slät bana genom tilt serien, och lutnings-axeln är inriktad vertikalt i förhållande till betraktaren.
Movie 3:. Animation av rekonstruerade tilt-serien (Högerklicka för att ladda ner) Denna animation går genom tomogram som visas i figur 6 genereras efter automatiserad rekonstruktion av tilt serien visas i filmen 2by tomoauto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den höga genomströmning metod som beskrivs här möjligt för oss att bearbeta 1917 Cryo tilt-serien och producera mer än 4500 under tomogram av intakta S. flexneri injectisome 19. De insamlade uppgifterna ledde till detaljerad beskrivning av in situ injectisome, inklusive cytoplasma sorterings komplexet. Metoden användes också för att visualisera flera mutantceller med specifik deletion av förmodade proteinkomponenter, som hjälpte belysa sammansättningen av sorterings plattformen av injectisome. Vår metod gav nya vägar för att undersöka struktur och funktion förhållandet mellan injectisome. Som ett resultat, var den nya etappen inställd för ytterligare dissektion av mekanismerna bakom T3SS-medierad sekretion och patogenes.
Protokollet presenteras här beskriver hög genomströmning Cryo-ET av intakt S. flexneri, men är tillämplig på alla projekt som lämpar sig för Cryo-ET. Denna metod har använts i structural karakterisering av flagellära motor Borrelia burgdorferi 27 infektion av E. coli miniceller från bakteriofag T7 28, och chemoreceptor arrayer i E. coli 29. Genom att underlätta insamlingen av massiva datamängder, är det möjligt att screena flera mutanter samt bilden ett stort antal villkor som tillåter slutsatser av dynamiska processer såsom maskinenheten 27 och utvecklingen av faginfektion 28. Genom att samla flera programvarupaket och möjliggör full kontroll över exekveringsbearbetning, användare har möjlighet att skräddarsy olika kombinationer av paket för optimalt resultat. Chen m.fl.. 21 tidigare publicerade en liknande protokoll beskriver samla data med hjälp av programpaketet Leginon 12 och automatisera tilt-serien bearbetning med IMOD 13 och RAPTOR 24. Den nuvarande protokollet kompletterar denna metod i detalj en alternativ metod för att samarbetallecting och bearbeta data samtidigt visar hur mycket teknik och förfarandet har avancerat, drivet av den ökade fokuseringen på hög upplösning genom sub-tomogram genomsnitt, med dos-fraktione data, automatiserad CTF uppskattning och korrigering, och mer robusta automatiserade inriktnings rutiner inom IMOD 13. Medan det tidigare protokollet går in visuella detaljer med tonvikt på insamling av data, fokuseras i denna metod på detaljerna i behandling av insamlade data.
Hög genomströmning metoder möjliggör massiv datainsamling som maximerar användningen av mikroskop och datorresurser, samtidigt som man begränsar mängden tråkiga instruktionsbok insatser som sakta ner projektet och fungerar som en stor flaskhals. Omslaget bibliotek tomoauto har utformats för att tillåta fullständig konfiguration av alla parametrar som används i varje mjukvarupaket på ett enkelt och centraliserat sätt. Så snart en lämplig utformning har fastställts, är det då lätt att applicera inställningarna för hela dataset. En majoritet av lutningen-serien kan bearbetas med godtagbara resultat (Figur 4A), medan en mindre delmängd krävs att bearbetas manuellt. Dessa tilt-serien är oftast mindre ideala förvärv plågas av överdriven bild skift, dålig kontrast, eller brist på tillräckliga referensmarkörer som orsakar den automatiska förankringsspårnings rutin misslyckas (Figur 4B). För att få bästa möjliga tomogram måste omfattande vård tas vid varje avgörande steg från provpreparering, bildtagning, bildbehandling.
Den fortsatta utvecklingen i hög genomströmning Cryo-ET såsom automatiserade under tomogram extraktion med mall matchning och integration av moderna under tomogram medelvärdesmjukvarupaket som Dynamo i befintliga arbetsflöden rörledningar som tomoauto nu utreds. Den senaste tillkomsten av nya generationens direkta detekteringsanordning kameror har gjort stora förbättringar för att öka tilt-serien SNR och möjliggör more konsekvent CTF bestämning på grund av högre effektivitet i detektorn. Användningen av ny fullt guld grid-typer kan minska tilt-serien insamling defekter, förbättra andelen framgångsrika för automatisk tilt-serien bearbetning och rekonstruktion med mindre behov av manuell hantering 30. Slutligen med den numera allestädes närvarande användning av datorkluster och grafiska behandlingsenheter (GPU) för att parallellisera och påskynda stora dataset bearbetning, utveckling av rörledningar som kan utnyttja dessa system kommer snart förhoppningsvis att kunna förkorta exekveringstiden från dagar till timmar, vilket ger användarna fortfarande ännu mindre driftstopp mellan experiment konstruktion och meningsfull analys av data samtidigt öka dataset storlek och uppnå högre upplösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr William Margolin för kommentarer. Vi är tacksamma för stödet på SerialEM från Drs. David Mastronarde och Chen Xu. DM, BH och JL stöddes av Grant R01AI087946 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar, Grants R01GM110243 och R01GM107629 från National Institute of General medicinska vetenskaper (NIGMS), och Grant AU-1714 från Welch Foundation. Den direkta elektrondetektor har finansierats av National Institutes of Health Award S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
