Summary
Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.
Introduction
Tip III salgılama sistemleri (T3SS), birçok Gram-negatif patojenlere için gerekli hastalık oluşturma etkenleridir. Ayrıca, iğne kompleksi olarak bilinen injectisome, ökaryotik konakçı hücreler 1, 2 içine bakteri efektör protein doğrudan translokasyon için gerekli olan santral T3SS makinesidir. Injectisome hücre dışı bir iğne, bir taban gövde ve sitoplazmik bir kompleksi içerir, bilinen sıralama kompleks 3 olarak. Daha önceki çalışmalar, önemli bir bazal vücut proteinleri 4, 5 atom yapılarla birlikte, Salmonella ve Shigella saflaştırılmış injectisomes 3-D yapılar ortaya çıkarmıştır. Salmonella, Shigella ve Yersinia gelen injectisomes in situ yapıları son-ET kriyo 6 ile ortaya çıkarılmıştır , 7. Bununla birlikte, efektör seçimi ve iğne düzeneğinin için gerekli sitoplazmik kompleks, bu yapılarda görselleştirilmiştir edilmemiştir.
Cryo-ET mos olduğunu(in situ) doğal hücresel kapsamında nanometre çözünürlükte moleküler makineleri görüntüleme için uygun tekniği t. Bununla birlikte, kriyo-ET ile elde çözünürlük numune kalınlığı ile sınırlandırılmıştır. Dezavantajı aşmak için, genetik olarak cryo-ET için yeterince ince minicells üretmek için modifiye edilmiş bir öldürücü Shigella flexneri zorlanma sağlam injectisomes görüntülenmiş. Cryo-ET diğer kısıtlılığı çok hızlı bir şekilde numunede yüksek çözünürlüklü bilgi yok elektron demeti, tarafından uyarılan radyasyona örnek hassasiyetidir. Uygun bir doz, tam eğme serisi arasında dağıtılmasını ve böylece bir sonucu olarak, son derece düşük dozlar ayrı ayrı eğim görüntüler için kullanılır. Bu büyük ölçüde zor tomografisinde gürültü büyük miktarda konunun yapısal özelliklerini farklılaştırmak için hale getirir ve kriyo- elde edilebilir çözünürlüğü sınırlar son yeniden sinyal-gürültü oranı (SNR), düşürür ET. ConventiBöyle Fourier ve gerçek uzay filtreleri olarak yanı sıra örnekleme aşağı Önal görüntü işleme kontrastı artırmak için kullanılan, ancak yüksek çözünürlüklü bilgilerin çoğunu filtreleyerek pahasına yapılabilir. Son zamanlarda, bir alt tomogram ortalama mümkün ölçüde SNR artırmak ve alt nanometre seviyelerinin 8, 9, bazı durumlarda, daha sonra nihai çözünürlük yaptı. Kompleksleri daha ayrıntılı bir analizi, mümkün olmaktadır hesaplama ihtiva eden alt-tomografi binlerce ekstraksiyonuyla hizalayarak ve alt tomogram ortalama özgün tomografi ve ilgi alanları daha SNR ve daha yüksek çözünürlüğe sahip yerinde kompleks yapılara belirlemek için. Bu yöntemler makromoleküler meclisleri ve yerel hücresel bağlamda dinamik konformasyonlarına ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlamak için genetik yaklaşımlar ile entegre edilebilir.
Genel olarak, on ya da bin alt tomografi hatta yüzlerce yüksek belirlemek için ortalama gerekenin situ -resolution yapılar. Tilt-serisi yeterli sayıda edinimi alt tomogram bu sayıda hızlı bir darboğaz haline üretmek için gerekli. Elde edilen eğim serisi genellikle yeniden önce hizaya tilt-serisi getirmek için çözülmesi gereken ışın kaynaklı kayma, sahne tepki yanı sıra büyütme, rotasyon ve çarpık kusurları, etkilenir. Tilt serisi genellikle başka darboğaz neden geleneksel el tilt-serisinin denetim yoluyla seçilen izleme altın referans belirteçler, tarafından hizalanmış. Birçok yazılım paketleri 11, 12, tilt serisi uyum ve yeniden 13, 14 ve alt tomogram 15-18 ortalama bilgisayar kontrollü elektron mikroskopları 10 aracılığıyla otomatik eğim serisi edinimi için geliştirilmiştir. Bu paketler cryo-ET iş akışında ayrı operasyonlar ele gibi, Systema'nın sürecin içine daha yüksek bir soyutlama düzeyini oluşturmak için arzu olurola- rak tek bir boru hattı içine tüm düzeni düzene. Bu nedenle, biz merkezi bir şekilde her bir bileşenin tam yapılandırmasını korurken basit kullanıcı işlemi için izin veren bir tek yarı otomatik birimine bu paketlerin bir dizi düzenlemek için tasarlanmış "tomoauto" bir yazılım sarıcı kütüphane geliştirdi. Kütüphane bir online uzaktan kaynak kod depo (http://github.com/DustinMorado/tomoauto) vasıtasıyla açık kaynak, kuyu, belgelenmiş sürekli geliştirilen ve kullanıma serbestçe kullanılabilir, özel kalkınma ya da daha fazla bütünleşmesidir.
Bu yüksek verimli cryo-ET boru S. sağlam injectisomes görselleştirmek için kullanılmıştır flexneri minicells. 1917 tomografi toplam alt tomogram 19 ortalaması alınarak saptanması sitoplazmik sıralama platformu içeren sağlam makinenin in situ yapısında yüksek çözünürlük göstererek, bu yöntem kullanılarak elde edilmiştir. Birlikte yabani tip ve m moleküler modelleme ileutant makineleri, bizim yüksek verimli boru hattı doğal hücresel bağlamda bozulmamış injectisome yapısını ve işlevini anlamak için yeni bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Minicell Hazırlık
- S. yapmak flexneri minicells, yapısal olarak spektinomisin dayanıklı plazmid, 5 | il elektro Streptomisin dayanıklı serotip 5a (M90T-Sm) elektroporasyon ile hücrelere düşük kopya Escherichia coli hücre bölünmesi genleri ftsQ, ftsA ve ftsZ ifade plazmidi pBS58, 1 ul dönüşümü 1 mm küvetler 5 ms için 2.5 kV.
- 1.5 ml kriyojenik mikrotüp% 15 gliserol içinde -80 ° C'de mağazanın Minicell örnekleri. Kullanılmak üzere, 4 ml hücreleri bir pipet kullanarak unthawed mikrotüpünden hücrelerin yaklaşık 5 ul kazıyın ve askıya hazır olduğunda spectinomycin ile triptik soy broth / ml konsantrasyonu 100 ug ekledi. 37 ° C 'de O / N büyütün.
- Pipet daha 100 ug / ml konsantrasyonlara eklenmiştir spectinomycin 1.2 200 içine mi triptik soya suyu kültür 2 mi. Eski kütük fazı 37 ° C'de büyür.
- Minicells, santrifüj zenginleştirmek5 dakika boyunca 1000 x g'de 1.3 ile kültür 200 mi. Dikkatle 10 dakika boyunca 20.000 x g'de yeni bir santrifüj tüpüne ve santrifüj içine süpernatan fraksiyonu dökün. Dikkatlice dökün ve süpernatan fraksiyonu atmak ve hafifçe bir pipet kullanılarak geri kalan sıvı ile pelet karıştırın ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne topak karışımı, yaklaşık olarak 100 ul aktarma.
2. EM Izgara Hazırlık
- Bir bardak slayt R2 / 2 holey karbon film 200 örgü bakır ızgara karbon tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
NOT: R2 / 2 200 ızgaralı hala numune desteklemek ve kamera alanında karbon film kenarına yerleştirerek, tek bir ızgara meydanında elde etmek için ayarlanabilir eğim-serisi sayısını arttırmak için seçilir İstediğiniz büyütme. Daha ince ağlar ızgaraları ve R1.2 gibi daha küçük Delikli C film / 1,3 400 gözenekli yüksek büyütmede görüntülü örnekler için de kullanılabilir; Böyle R3.5 gibi büyük holey karbon filmler / 1 200 örgü kullanmak olabilirörnekleri d düşük büyütmede görüntülü ya mikrografı örneğin R1 ile daha büyük bir mesafe ile C-kenar ve Delikli C filmleri içermez gerekir / 4 200 gözenekli ilgi alanına aşamasını hizalayarak ve gelen alanların korunması ile yardım için kullanılabilir aşırı maruz kalma rutinleri odaklama ve izleme. - Bir kızdırma deşarj cihazında platformda slayt yerleştirin.
NOT: bir anod ve platform, bir vakum desikatörde içine makine ile işlenir ve yüksek frekanslı bir jeneratör tarafından güçlendirilmiş olan bir içi cihazı kullanın. Bir vakum oluşturduktan sonra, ızgara taburcu kızdırma 1 dakika süreyle prob üzerindeki anot ve güç yüksek frekans jeneratörü probu takın. Gerekli zaman ızgara bir dakika için birkaç saniye arasında olabilir deşarj kızdırma. Kızdırma deşarj süresi değişen numune konsantrasyonu ve hiçbir vitreus buz ile kuru görünen ızgaraları ile ilgili sorunları teşhis etmek için kullanılabilir. - Forseps bir dizi ile ızgara kaldırın ve forseps elastik b kapalı kilitve.
- 1.4 hazırlanan minicells ile mikrosantrifüj tüp 10 nm koloidal altın çözeltisinin 100 ul ekleyin ve hafifçe parmağınızla tüp hafifçe vurarak karıştırın. 2.2 hazırlanan ızgara üzerine karışımın yeni pipet yer 4 ul.
Not: kolloidal altın boyutları ve bakım çeşitli mevcuttur altın büyüklüğü, elde edilen büyütülmüş işlenecek mikrograflar piksel boyutu göz önüne alındığında daha büyük 5 piksel olduğuna dikkat edilmelidir belirsiz özellikler için çok büyük olmamakla birlikte ilgi. - Dalma-friz aparatı hazırlayın; sıvı nitrojen ile dış donma kabın doldurulması ve daha sonra sıvı etan iç bölmeyi doldurun. Dalgıç çubuğa ızgara ile forseps takın ve yükseltilmiş pozisyona piston çubuğunu kilitleyin.
NOT: Daha Iancu ve ark 20 ticari bir dalma-donma cihazının kullanımını anlatan bir protokol için.. - Dikkatli t filtre kağıdı bir parçasına dokunarak ızgara Bloto da hemen ızgara dondurma, dalgıç çubuk bırakın, ızgara ve filtre kağıdı ayrıldığı ve durur filtre kağıdı üzerinde esneklik arasındaki menisküs kadar örnek bırakın. Dikkatle dalgıç çubuk forseps çıkarın ve ızgara tutucu içine ızgara yerleştirin.
- Sıvı azot ile yükleme alanı ve emme pompası kabı doldurarak cryo-EM transfer istasyonu hazırlayın. Yükleme alanı grid tutucu ve yükleme alanında bir mikroskop numune kartuş sıvı azot sıcaklığı yerinde olduğunu bir kez.
- Dikkatle önceki Polara mikroskopları veya sonraki modellerde bir C tarzı klip halkası üzerinde küçük bir yivli kilit halkası ya olan kilit halkasını, kaldırmak; forseps kullanarak kartuş içine EM ızgara yerleştirin ve yavaşça ızgara güvence kartuş üzerine geri kilit halkasını takın.
- Mikroskop birden numune tutucu çıkarın ve aktarma istasyonuna takın. Kartuş forseps bir kullanarak tutucu içine numune kartuşunu yerleştirinyükleme alanından tutucu geri ve mikroskop geri çoklu numune tutucu transferi d.
NOT: Chen ve diğ. 21 2.1-2.9 ayrıntılı görsel protokol için bkz.
3. Yüksek verim Otomatik Tilt-serisi Koleksiyonu
- Düşük büyütme Haritalar Koleksiyonu
- SerialEM 10 'Navigator' menüsünden 'Aç' tıklayarak yeni Navigator penceresi açın (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Kabul edilebilir görüntüleme koşulları içermesi ızgara kareler bul (yani, ince buz, hiçbir kirlilik, ilgi konusu), düşük büyütme floresan ekranı kullanarak (~ 2,300X Minicell numune için).
NOT: [Opsiyonel:. Bu adım, tüm ızgara montaging tarafından SerialEM ile otomatik hale getirilebilir, ancak sadece elle birkaç alanları seçmek için daha hızlı olabilir] - Daha sonra ayarlamak 50 ° numune tutucu eğerek eucentric yüksekliğe ayarlayın sahnesahnenin xy çeviri kadar z-boy eğik ve untilted görünümler arasında düzeydedir.
- Izgara meydanın ortasına taşıyın ve Gelinen aşamada pozisyonunu saklamak için Navigator penceresinde 'Ekle Sahne Pos' düğmesine tıklayın.
- Tüm kabul edilebilir ızgara kareler sahne pozisyonları kaydedildi kadar yukarıdaki adımları 3.1.1-4 devam edin.
- 'Dosya' menüsünden 'Yeni montaj' tıklayarak yeni montaj MRC dosyasını açın. Açılır Montaj Kurulum Dialog, tüm ızgara kare (standart 200 meş ızgara örneğin, 10 x 10) kazanacaklardır X ve Y parçalarının bir numara seçin. 'Yerine Görüntü Kaydırma ve Sahne Taşı' ve radyo düğmeleri "parçalar hizalamak için kullanılan korelasyonlar atla '8 gibi yüksek bir binning kullanın ve seçin.
- Navigator penceresinde ilk aşama konumunu tıklayın ve 'Edinme' onay kutusunu işaretleyerek elde edilecek ayarlayın. Navigator penceresinde her aşamasında pozisyon için bu işlemi tekrarlayın.
- Navigator 'Navigator' menüsünden 'Noktalarında Edinme' tıklayarak Dialog Edinme açın. 'Edinme harita görüntüsünü' ve 'Kaba eucentricity' onay kutusunu işaretleyin ve diğer tüm onay kutularını işaretli olduğundan emin olun. Her aşama pozisyonunda bir montaj toplamak için 'Devam' düğmesini tıklayın.
- Tilt-serisi Edinme
- Navigator penceresinde edinilen haritalardan birini seçin ve 'Load haritası' düğmesine tıklayın.
- Navigator penceresinde bir tilt serisi elde etmek için hangi harita düğmesini 'Puanları Ekle' seçeneğini noktaları tıklatın. Ardından düğmeye 'Puanları ekleme Dur' tıklayın. Toplanan her harita için tekrarlayın.
- Kamera menüsünde 'parametreleri' seçin ve Odak, Deneme ve Kayıt modları için parametreleri tanımlayın. [Opsiyonel:. Veri Kayıt modu için parametreleri belirtilebilir Doz fraksiyone]
- Navigator penceresinde bir nokta seçin ve 'Tilt-Serisi kontrol9; onay kutusunu işaretleyin. Parametrelerini seçmek açılır Tilt-Serisi Ayarı iletişim penceresinde tilt serisi koleksiyonu için istenen. Navigator penceresinde seçilen noktaların geri kalanı için yineleyin, ancak haritalar seçmeyin.
- Navigator menüsünde yine 'Noktalarında Edinme' seçeneğini seçin. Navigator iletişim seçmek 'öğeye yeniden hizalayın' Otofokus 've' Kaba eucentricity Edinme 'Ön görevler gibi, ve' tilt serisi Edinme 'Birincil görev olarak, ve' zaman tüm sütunu kapatmak için 'ucunda Kapat kolon vanaları Puan toplanmıştır. Bir tilt serisi geçmeden üzerine her haritada her noktada tahsil edilecektir.
4. Yüksek verim Otomatik Tilt-serisi İşleme ve İmar Tomoauto kullanma
- Doz-fraksiyone verilerin Işın kaynaklı Hareket Düzeltme [isteğe bağlı]
NOT: Tomoauto MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht kullanırml) doz fraksiyone mikrografiklerinden ışın kaynaklı hareket kaldırın. NOTIONCORR 16 sisteminizde yüklü olması gerekmektedir.- Komutu çalıştırmak bir terminal orijinal tilt-serisi, geçerli çalışma dizini SerialEM 10 den çıktı günlüğüne ve bireysel doz fraksiyonlara görüntüler tüm With:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> işlemek için tilt-serisinin adıdır.
- Komutu çalıştırmak bir terminal orijinal tilt-serisi, geçerli çalışma dizini SerialEM 10 den çıktı günlüğüne ve bireysel doz fraksiyonlara görüntüler tüm With:
- Tilt-serisi Uyum ve İmar
NOT: Varsayılan olarak Tomoauto tilt serisi otomatik referans modeli oluşturma, hizalama, kontrast transfer fonksiyonu (CTF), CTF-düzeltme 23 belirlenmesini işlemek için (http://bio3d.colorado.edu/imod/) iMod 13 kullanır ve rekonstrüksiyon. Alternatif kullanıcıların otomatik referans modeli nesil, CTF için (iMod dahil) RAPTOR 24 kullanımı tomoauto seçeneği varFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) CTF belirlemek ve tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) yeniden inşası için veya yazılım paketleri herhangi bir kombinasyonu tarafından yapılandırması. Her pakette mevcuttur Bu yapılandırma yanı sıra parametreler yerel yapılandırma dosyaları da belirli bir numune için kullanılan detay parametreleri, toplama oluşturulabilir ise en yaygın bir laboratuarda kullanılan değerleri uygun düzenlenebilir Global bir yapılandırma dosyası tarafından ele alınır ayarlamak veya bireysel tilt serisi. Kullanılacak isteyen tüm paketler sisteminizde yüklü olması gerekmektedir.- Geçerli çalışma dizininde tilt-serisi ile, bir terminalde komutu çalıştırmak
tomoauto --CTF --mode = hizalamak <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> işlenecek eğim-serisi ve <fid_diam> diame olduğununanometre fiducial belirteçlerin ter. Bu komut hizalamak ve otomatik eğim serisi CTF tahmin eder. Bu komut --CTF seçeneği kaldırarak CTF işleme atlamak mümkündür. - Hizalama işleme herhangi göze batan hataları görsel hizalanmış tilt-serisi kontrol edin ve komutlarla tahmin CTF inceleyin:
3dmod <filename> .ali
submfg <filename> _ctfplotter.com
sırasıyla burada <filename> eki olmadan tilt-serisinin adıdır. Ayrıca hizalama kalitesinin kantitatif istatistik uyum, tarafından üretilen ortalama kalıntı hatayı görmek için tomoauto komutunun çıktısını kontrol edin. - Kabul edilebilir bir hizalama Verilen komutu çalıştırarak işleme devam edin:
tomoauiçin --CTF --mode = yeniden Yapılandırma <filename.st> <fid_diam>
4.2.1'deki aynı kullanıcı ikameleri ile. Bu komut, CTF düzeltmek tilt-serisi fiducial işaretleri silmek ve yeniden hesaplamak. Yine CTF işleme 4.2.1 gibi atlanabilir. - [isteğe bağlı] görsel denetim adımı atlayın ve tamamen işleme ve yeniden komutu yürütmek otomatikleştirmek için
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [isteğe bağlı] bir yerel yapılandırma dosyası oluşturmak için nasıl tomoauto belgelerine bakın Belirli bir yerel yapılandırmasını kullanın ve sonra komutu çalıştırmak için
tomoauto [seçenekler] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
burada <local_config> yerel conf adıdıriguration dosyası.
- Geçerli çalışma dizininde tilt-serisi ile, bir terminalde komutu çalıştırmak
5. Alt tomogram Ortalaması
NOT: 15 (http://www.electrontomography.org/) alt tomogram ortalama deneyleri işlemek için, ancak protokol açıklanan i3 paketini kullanmak en uygun alt tomogram ortalama yazılımı packages16to süreci alt tomogram ortalama deneyler genellikle geçerlidir, Ancak protokol çoğu mevcut alt tomogram ortalama yazılım paketleri 16-18 genellikle geçerlidir nitelendirdi.
- Geçerli çalışma dizininde yeniden tomografi ile komutu çalıştırarak parçacık toplama için tomogram açmak:
tomopick <filename> REC
<filename> 4.2.2 gibidir. Bir injectisome seçin ve tomogra dilimleri ile riff için yukarı ve aşağı ok tuşlarını kullanmak için öncelikle bazal vücut ve ardından iğne ucu tıklayın sol fare düğmesini kullanın Açılan penceredem. Bu şekilde tüm görünür injectisomes seçin. Bu yapının uzun ekseni tanımlayan yanı sıra üç Euler iki yapının yönünü anlatan açıları tahmin bir metin dosyasında koordinatları saklar. - Hesaplama extract komutunu yürüterek tanımlanan uzun ekseninin orta noktası merkezli tomografi 400 3 voksel küpleri:
klibi yeniden boyutlandırmak Cx <x> -cy <y> -CZ <z> -ix 400 -iy 400 -IZ 400
<filename> REC <filename> _001.mrc
Burada <x>, <y>, <z> yapının orta koordinatları ve <filename> 4.2.2 gibidir. Ekstre küp boyutu yapısı ve kullanılan büyütme göre değişebilir gerektiğini ve yeterince bu örnek için 400 3 vokselden olan ilgi yapısını içine kadar büyük olmalıdır. - Aşağı numune (bin) komutu yürüterek ilk hizalama için hesaplama süresini azaltmak için dört bir faktör tarafından alt tomogram:
binvol -b 4 <filename> _001.mrc <filename> _001.bin4.mrc
<filename> 5.2 olduğu gibi. - Belirlenen Euler alt tomogram için açıları uygulayın ve komutu yürüterek ilk şablonu üretmek için küresel ortalama hesaplamak.
I3totsum.sh - Hizalayın ve sitoplazmik alan ikili bir sınıflandırma maskesi kullanarak aşağı örneklenmiş alt tomogram sınıflandırır. Tomografi karakteristik eksik kama eserler en aza indirmek için Fourier uzayında alt tomogram ortalamasının gerçekleştirin. 4 veri binning için SAMPFACT = "4 4 4" kullanın lütfen.
i3mramsacls.sh - Adımı yineleyin 5.5 kullanıyorsanız alt tomografi iki (SAMPFACT = & çarpanı ile aşağı-örneklenmiş# 34; 2 2 2 ") ve bir kez daha orijinal veri ile (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Minicells S. numuneleri flexneri toplandı ve Şekil 2'de ayrıntılı olarak boru hattı, aşağıdaki tomoauto kullanılarak şeması, Şekil 1 'de gösterdiği gibi işlenmiştir. Tilt-serisi düşük büyütmeli montaj haritalar üzerinde kullanıcı tarafından belirlenen noktalarda yüksek verimlilik tilt serisi edinimi için izin veren SerialEM 10, (Şekil 3) kullanılarak toplanmıştır. Mikrograflar ışın kaynaklı hareket 22 (Şekil 4) azaltmak için doğrudan algılama cihazı kamera üzerinde doz fraksiyon modu kullanılarak toplanmıştır. Tomoauto MOTIONCORR 22 her işlem doz fraksiyone mikrograflar bir koleksiyon alarak hareket düzeltme koordine ve bir tilt-dizi haline sonuçları ayrıca (Film 1) işlenecek toplanır.
Tomoauto en genel uygulama servi olduğunuilk tilt serisi c hizalama. Tomoauto kaba tilt serisi hizalayın ve son hizalama oluşturmak için kullanılan sırayla vardır örnekteki koloidal altın parçacıkları, izleme bir başlangıç referans modeli oluşturmak için iMod 13 gerekli komutların sıralı yürütülmesini oluşturmaktadır. Bu referans modelin doğruluğu yeniden tomografisinde kalitesi önemlidir ve böylece kullanıcı görsel elle işleme tabi tutulmalıdır tilt-serisi tanımlamak için sonradan yeniden geçmeden önce ya da otomatik olarak hesaplanır referans modeli incelemek mümkün. 5 gösterileri Şekil İki eğim serisi kaba hizalanmış ve tomoauto tarafından oluşturulan. Belirlenen referans modeli 5A, C untilted görüntüleri göstermek ve yanlılık modelde hem fiducial belirteçler merkezli modelin puanla doğrudur Şekil. 5B Figures, karşılık gelen tilt göstermek D Şekil 5B modeli 50 derece ve süre serisi Şekil 5D birkaç örnek noktaları (kırmızı) bunlara karşılık gelen altın belirteçleri sapmış ve model ince uyum için uygun değildir var. Bu hata modeli noktasının merkezi ve altın marker muhtemel merkezi arasındaki ortalama kalıntı hata olarak kantitatif olarak ölçülebilir ve tomoauto ölçülen hata denetimi hızlandırmak için kullanıcı tanımlı bir eşiği aştığında kullanıcıyı uyarmak için yapılandırılabilir. Yetersiz otomatik olarak hizalanır Tilt-serisi daha sonra elle hizalanmış edilebilir. Biz tomoauto başarıyla yaklaşık 80% bizim toplanan tilt-serisi (Film 2) -90% hizalar bulabilirsiniz.
Bir tilt serisi başarıyla hizalanmış edildikten sonra, nihai tomografi içine yeniden inşa edilmelidir. Kullanıcı iMod 13 kullanmak veya nihai yeniden oluşturmak için 26 tomo3d böylece Tomoauto tasarlanmıştır. Şu anda t kullanınomo3d ölçüde yeniden süresini azaltmak için modern çok çekirdekli bilgisayar işlem birimi (CPU) çeşitli özelliklerinden yararlanmak için. Şekil 6 ve Film 3 'de gösterildiği gibi nihai bölütleme tomogram daha sonra hücresel açıklama, veya örnek içindeki moleküler makine yüksek çözünürlük bilgileri elde etmek için ortalama alt tomografi için kullanılabilir görüntülü numunenin bir 3-D birimdir. Alt tomogram ortalama artışlar SNR ve her ikisi de tek tek tomografi gürültü, yüksek seviyelerde ortalamayla ve ilgili rastgele yönlerde iyi olarak dağıtık büyük numaralı alt tomogram kullanılarak eksik-kama tarafından üretilen eşya azalır kama eksik eserler sınırlamak ve son çözünürlüğü artırmak için. Bozulmamış S. 2.7nm alt tomogram ortalama Bu teknik, co kapasitesine sahip büyük bir gelişme gösterir EMDB (Merck,-2.667), içinde depolandığı gibi flexneri T3SS Şekil 7 'de gösterilmiştirŞekil 6B'de, tek tomografi görüntülenen injectisome için mpared.
Şekil 1. yüksek verimlilik cryo-elektron tomografisi şematik bakış. Bir sıvı süspansiyon hızla bir EM ızgara ve tilt-serisi bir dizi dondurulur otomatik bilgisayar kontrollü elektron mikroskobu ile toplanır. Ortaya çıkan mikrografları tomogram oluşturmak için tomoauto kullanarak otomatik olarak işlenir. Burada son adım bir parçalı S. olduğunu Hu ve ark., 2015 15 den bu protokol tarafından oluşturulan bir tomografi gelen flexneri Minicell. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil tomoauto sürecinin 2. Akış Şeması. Tomoauto iş akışının bir arıza verileri tüm yol son alt tomogram ortalama doz fraksiyone mikrograflar bir koleksiyon nasıl işlendiğini gösterir. Alt işlem sembolleri detay yapılandırılmış uygun yazılımı çalıştırarak giriş işlemek için koordinatları tomoauto görevler. Belge ve çoklu belge sembolleri aslında kullanıcı tarafından işlenen çıkış gösterirken Veri sembolleri, genellikle kullanıcı tarafından kullanılmaz çıkış gösteriyor. Sonunda kullanıcı müdahalesi iş akışında meydana geldiği sembolleri göstermek görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SerialEM Navigator ile Şekil 3. Toplu tilt serisi edinimi. Aşama pozisyonlarında olarak depolanır montaj haritaların Pozisyonlar (gösterilen selectiEkranın sol tarafında gösterilen Navigator penceresi listesinde, şu anda yüklü olan haritanın olarak) üzerinde alımı için haritaya eklendi kırmızı bir çarpı ile işaretlenmiş sayısal seçilen noktaları ile birlikte tampon penceresinde görüntülenir. Toplama noktaları Navigator penceresinde etiket ile listelenir ve. "Tilt dizisi" onay kutusunu kullanarak elde etmek için ayarlanabilir, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil doza kısımlara veri hareket düzeltmesi 4. etkisi. (A) untilted ve düzeltilmemiş mikrografını gösterir ve (MOTIONCORR tarafından işlenen) hareket düzeltilmiş görüntü (B) 'de gösterilen, kontrast biraz düzeltme sonrası artırıldı. İyileştirme Fourier transf bakarak daha görünüşte görülebilirmikrograftaki ve orm (C) öncesi ve (D) hareket düzeltmesinden sonra. Görüntüler EH aynı bilgiyi gösterir ama kontrast azalır ve C ve D görünür Thon halkalar 60 derecelik, eğik bir mikrograftaki ile artık yüksek hızıyla görebilir. Ölçek çubuğu 250 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil tomoauto otomatik eğim serisi uyum 5. İyi ve kötü sonuçlar. (A) Bir untilted kabaca hizalanmış mikrograf ve otomatik tomoauto kullanılarak üretilen referans modeli. (B) 50 derece eğim de belirlenen referans modeli. Modeli hala iyi uyuyor ve uygun fiducial belirteçler üzerinde odaklanmaktadır. (C, D) (A, B), gösterir. Bu eğim serisi 1.06 piksel ortalama kalıntı hata ile uyumlu edildi. (E) Başka bir tilt-serisi ve 50 derece hızıyla (F) serisi bir untilted mikrograf ve referans modeli. İşte biz bu modeli (kırmızı ile gösterilen) birçok referans belirteçlerin izini kaybetti görmek ve bu kötü bir otomatik izleme temsilcisidir. (G, H) kutulu alanda yakınlaştırma sırasıyla (E, F), modeli gösterir. Bu eğim serisi 3.51 piksel ortalama kalıntı hata ile uyumlu ve serinin manuel hizalama tarafından işlenecek vardı. (A) Ölçek çubuğunu 500 nm (C) Ölçek çubuğu 50 nm. Büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakam.
![Şekil 6,]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Şekil 6. Tomogram tomoauto tarafından otomatik olarak oluşturulur. (A) Bu Şekil 4A görüntülenen tilt-serisinin yeniden merkezinden yedi dilim bir projeksiyon görüntüler. Ölçek çubuğu 250 nm olarak ölçülmüştür. (B) (A) 'daki kutulu alanının görüntüsü yakınlaştırılmış sağlam bir injectisome görüntülendiği. Ölçek çubuğu 100 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bozulmamış S. Şekil 7. Alt tomogram ortalama flexneri Tip III sekresyon sistemi. (A) bozulmamış S. 2.7 nm alt tomogram ortalamasının Merkez dilim EMDB (EMD-2667) adlı flexneri T3SS. (B) Tam projeksiyon boyuncahacim X-ekseni. (C) iMod içinde 130 kontur eşiğinde inceledi hacmi Isosurface render. Ölçek çubuğu 5 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1: Animasyon hizalanmamış tilt-serisi (Sağ indirmek için tıklayın). Bu animasyon başlangıçta SerialEM tarafından toplanan tilt-serisi geçiyor. Translational kaymalar kolaylıkla az fark kusurları yeniden inşa edilebilir tilt-serisi önce düzeltilmesi gereken birlikte bireysel referans görüntüden görüntüye belirteçleri ve bu kaymaların düzensiz yolu ile tanımlanır.
![Film 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Film 2:. Hizalanmış tilt-serisi Canlandırma (Sağ indirmek için tıklayın) Bu animasyon tomoauto tarafından otomatik hizalama sonrasında Film 1 görüntülenen aynı mikrograflar geçiyor. Fiducial belirteçlerin düzensiz yollar artık tilt-dizi düzgün bir yörünge takip ve tilt ekseni izleyiciye göre dikey hizalanmış.
Film 3:. Animasyon yeniden tilt-serisi (Sağ indirmek için tıklayın) Bu animasyon film 2 b görüntülenen tilt-serisi Şekil 6 üretilen sonra otomatik yeniden gösterilen tomografi geçiyory tomoauto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yüksek verim yöntemi 1917 cryo tilt-serisi işlemek ve bozulmamış S. 4500 üzerinde alt tomogram üretmek için etkin flexneri 19 injectisome. Toplanan veriler kompleksi sıralama sitoplazmik dahil in situ injectisome içinde detaylı karakterizasyonu, yol açtı. Yöntem ayrıca injectisome sıralama platformun bileşimi aydınlatmak yardımcı varsayılan protein bileşenlerinin belirli bir silinmesi, birkaç mutant hücreleri görselleştirmek için kullanılmıştır. Bizim yöntemi injectisome yapı-fonksiyon ilişkisini araştırmak için yeni yollar sağladı. Bunun bir sonucu olarak, yeni bir aşama T3SS aracılı sekresyon ve patogenezi yatan mekanizmaların daha diseksiyon için ayarlandı.
Burada sunulan protokol bozulmamış S. yüksek verimlilik cryo-ET açıklar flexneri, ancak cryo-ET için uygun herhangi bir proje için geçerlidir. Bu yöntem, birleşik yapılarda kullanılmıştırBorrelia 27 flagellar motorun ral karakterizasyonu, E. enfeksiyonu E. bakteriyofaj T7 28 tarafından coli minicells ve kemoreseptör dizileri coli 29. Büyük veri setleri toplanmasını kolaylaştırmak ile, birden çok mutant da görüntü gibi makine montaj 27 ve faj enfeksiyonu 28 ilerleme olarak dinamik süreçlerin çıkarımlar izin veren koşullar çok sayıda taranması mümkündür. Birden yazılım paketlerini toplama ve işleme yürütme üzerinde tam kontrol sağlayan, kullanıcıların en iyi sonuçlar için paketlerin farklı kombinasyonları özelleştirmek mümkün. Ve ark., 21 Chen daha önce tilt serisi iMod 13 kullanılarak işleme ve RAPTOR 24 Leginon 12 yazılım paketi kullanarak ve otomatize veri toplama açıklayan benzer bir protokol yayınlamıştır. Geçerli protokol işbirliği için alternatif bir yöntem ayrıntılarıyla bu yöntemi tamamlarllecting ve işleme verileri de teknoloji ve prosedür doz fraksiyonlara veriler, otomatik CTF tahmini ve düzeltme ve içinde daha sağlam otomatik hizalama rutinleri ile, gelişmiş alt tomogram ortalama alma yoluyla yüksek çözünürlükte artan odak tarafından tahrik ne kadar gösterirken iMod 13. Bir önceki protokol veri toplama üzerinde durularak, görsel detaylara gider iken, bu yöntem toplanan verilerin işlenmesi ayrıntılar üzerinde duruluyor.
Önemli bir darboğaz olarak proje ve hareket yavaşlatmak sıkıcı kullanım kılavuzu müdahaleler miktarını sınırlandırarak yüksek verimlilik yöntemleri, mikroskop ve bilgisayar kaynaklarının kullanımını maksimize büyük veri toplama için izin verir. Sarıcı kütüphane tomoauto basit ve merkezi bir şekilde her yazılım paketinde kullanılan tüm parametrelerin tam yapılandırmasını sağlamak için dizayn edilmiştir. Uygun bir yapılandırma belirlendikten sonra, bütün d ayarları uygulamak için daha sonra kolayataset. Küçük bir alt grubu manuel işleme tabi için gerekli iken eğme serisi büyük bir çoğunluğu, kabul edilebilir sonuçlar elde (Şekil 4A) ile işlenebilir. Bu eğim serisi genellikle aşırı görüntü kayması, kötü kontrast veya başarısız otomatik referans izleme rutin neden yeterli referans belirteçlerin eksikliği (Şekil 4B) boğulmuş daha az ideal satın almalar vardır. Mümkün olan en iyi tomogram elde etmek için, geniş bakım görüntü işleme numune hazırlama, görüntü elde etme, her kritik adımda alınmalıdır.
Bu tür otomatik alt tomogram şablon eşleştirme ile ekstraksiyon ve tomoauto gibi mevcut iş akışı boru hatları bu tür Dynamo gibi modern alt tomogram ortalama yazılım paketlerinin entegrasyonu gibi yüksek verimlilik cryo-ET daha ileri gelişmeler artık araştırılmaktadır. Yeni nesil doğrudan algılama cihazı kameraların son gelişi eğim serisi SNR artan ve mor sağlayan önemli iyileştirmeler yaptınedeniyle dedektörün yüksek verimlilik e tutarlı CTF belirlenmesi. Yeni tam altın ızgara tiplerinin kullanımı manuel müdahale 30 daha az ihtiyaç ile otomatik eğim serisi işleme ve yeniden inşası için başarı oranını artırmak, tilt serisi toplama kusurları azaltabilir. Sonunda bilgisayar kümeleri ve grafik işlem birimleri (GPU'lar) şimdi her yerde kullanımı ile kullanıcılara sunmak, parallelize ve büyük veri kümesi işleme, yakında umarım saat günlerden yürütme süresini kısaltmak mümkün olacak bu sistemlerin yararlanabilirler boru hatları gelişimini hızlandırmak için Hala deney tasarımı ve anlamlı veri analizinde arasında daha az kesinti hala kümesi boyutunu artırarak ve yüksek çözünürlüklerde elde ederken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.
Acknowledgments
Biz yorumlar için Dr. William Margolin teşekkür ederim. Biz Dr dan SerialEM üzerinde destek için müteşekkiriz. David Mastronarde ve Chen Xu. DM, BH ve JL Welch Vakfı Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIGMS) den Hibeler R01GM110243 ve R01GM107629 ve Grant AU-1714 Grant R01AI087946 tarafından desteklendi. Doğrudan elektron dedektörü Sağlık Ödülü S10OD016279 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
