Summary
我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。
Introduction
III型分泌系（T3SS）多くのグラム陰性病原体に不可欠な病原性決定因子です。また、針複合体として知られているinjectisomeは、真核生物の宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の直接転座1、2に必要な中央T3SS機である。injectisomeが外針、基礎体温、また既知の細胞質複合体を含みますソート複雑な3など。以前の研究では、主要な基礎体タンパク質4、5の原子構造とともに、 サルモネラ菌や赤痢菌から精製injectisomesの3次元構造を解明した。 サルモネラ 、 赤痢菌 、およびエルシニアからinjectisomesのその場構造の最近の -ETクライオ6によって明らかにされました7。しかし、エフェクターの選択と針アセンブリのための本質的な細胞質複合体は、それらの構造において可視化されていません。
クライオETはモスです（ その場で ）その本来の細胞のコンテキスト内でナノメートルの分解能で分子機構を画像化するための適切な技術をtは。それにもかかわらず、クライオETによって達成可能な解像度は、試験片の厚さによって制限されます。欠点を克服するために、我々は遺伝的に凍結ETのために十分に薄いミニ細胞を産生するように改変された病原性赤痢菌株でそのままinjectisomesを画像化しました。クライオETの他の制限は、非常に迅速に、サンプル中の高解像度の情報を破棄し、電子ビームによって誘起される放射線に対する試料の感受性です。適切な用量は、完全傾斜シリーズ間で分散することができるように、その結果、非常に低い用量は、個々の傾斜画像に使用されます。これは、非常に困難なことは断層像のノイズの大量から被写体の構造的特徴を区別することを可能にすると冷凍のことで達成できる解像度を制限し、最終的な再構成における信号対雑音比（SNR）を低下させますET。 Conventiこのようなフーリエ変換し、実空間フィルタなど、ならびにダウンサンプリングonal画像処理、コントラストを高めるために使用されるが、高解像度の情報の多くをフィルタリングを犠牲にすることができます。最近、副断層像の平均を大幅にサブナノメートルレベル8,9にSNR、その後いくつかのケースでは、最終的な解像度を増加させることが可能となった。複合体のより詳細な分析は、計算含むサブ断層像の数千を抽出することによって可能となりますより高いSNRと高分解能でその場複雑な構造で決定するために、サブ断層像を位置合わせし、平均化し、元の断層像からの関心のある分野。これらの方法は、高分子集合体とネイティブ細胞環境での動的なコンフォメーションにさらに大きな洞察を提供するために、遺伝的アプローチと統合することができます。
一般的には、数十または数千のサブ断層像の何百もの高い決定するために平均化される必要がありますその場での -resolution構造。サブ断層像のこの大量生産するために必要なチルト系列の十分な数の取得が迅速にボトルネックとなります。その結果、チルトシリーズは、多くの場合、再構成の前に整列するようにチルトシリーズをもたらすために解決しなければならないビーム誘起シフト、ステージバックラッシュだけでなく、拡大、回転、スキュー欠陥の影響を受けています。チルトシリーズは、一般的に、伝統的にまだ別のボトルネックを引き起こし、チルトシリーズの検査によって手動で選択されている金基準マーカを、追跡することによって整列されます。多くのソフトウェアパッケージは、コンピュータ制御の電子顕微鏡10を介して自動化された傾斜シリーズ取得のために開発された11,12、傾斜シリーズのアライメントおよび再建13、14及びサブ断層像は、15-18を平均化されています。これらのパッケージは、クライオETのワークフローの個別の操作を処理するように、システムAのプロセスに抽象度の高いを構築することが望ましくなりますtically単一のパイプラインに全体のスキームを効率化します。したがって、我々は集中的に各コンポーネントの完全な設定を維持しながら、簡単なユーザ操作を可能にする、単一の半自動化されたユニットにこれらのパッケージの数を整理するために設計されたソフトウェアのラッパー・ライブラリー」tomoauto」を開発しました。ライブラリは、オープンソースは、よくオンラインリモートソースコードリポジトリ（http://github.com/DustinMorado/tomoauto）によって開発やさらなる統合を合わせて、継続的に開発され、使用のために自由に利用できる、文書化されています。
この高スループットクライオETパイプラインは 、Sにおける無傷injectisomesを可視化するために利用されていますフレクスナーミニセル。 1917断層像の合計は、サブ断層像19を平均することによって決定した細胞質ソーティングプラットフォームを含むインタクト機の現場構造における高分解能を明らかに、この方法を使用して生成されました。一緒に野生型およびMの分子モデリングとutantマシンは、当社の高スループットパイプラインは、ネイティブの細胞状況にそのままinjectisomeの構造と機能を理解するための新しい道を提供します。
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Protocol
1.ミニ細胞の準備
- S.を作成するにはフレクスナーミニ細胞は、構成的にスペクチノマイシン耐性プラスミド5μlのエレクトロストレプトマイシン耐性血清型5aの（M90T-SM）、エレクトロポレーションによって細胞に低コピーから大腸菌細胞分裂遺伝子ftsQ、ftsA、とのFtsZを発現するプラスミドpBS58、1μlのを変換します1ミリメートルのキュベット中で5ミリ秒のために2.5 kVの時。
- 1.5ミリリットル極低温マイクロチューブ中で15％グリセロール中で-80℃で保存するミニ細胞のサンプル。スペクチノマイシンとするとき使用するための準備ができて、ピペットチップを使用して解凍していないマイクロチューブからの細胞の約5μLをこすりし、4ミリリットル中に細胞を懸濁トリプシン大豆ブロスを、100μg/ mlの濃度に加えました。 37℃でO / Nを成長させます。
- ピペット再び100μg/ mlの濃度になるように追加されたスペクチノマイシンと1.2 200ミリリットルにトリプシン大豆ブロスからの培養の2ミリリットル。後期対数期に37℃で成長します。
- ミニセル、遠心分離機を豊かにします5分1,000×gで1.3からの培養の200ミリリットル。慎重に10分間20,000×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に上清画分を注ぎます。慎重にオフ注ぎ、上清画分を廃棄し、静かにピペットチップを使用して残りの液体とペレットを混合し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにペレット混合物の約100μlのを転送します。
2. EMグリッドの準備
- スライドガラス上にR2 / 2穴あきカーボン膜200メッシュ銅グリッドの炭素側を上に置きます。
注：R2 / 2 200メッシュのグリッドは、依然として試料を支持し、カメラの視野内に炭素膜の端部を配置しながら、単一のグリッド正方形で取得するように設定することができ、チルト系列の数を最大化するように選択されます所望の倍率で。細かいグリッドは、メッシュや、R1.2 / 1.3 400メッシュのような小さい穴あきカーボンフィルムは、より高い倍率で撮像されたサンプルのために使用することができます。このようR3.5のような大きな穴あき炭素膜/ 1 200メッシュを使用することができますサンプルについてのdは低倍率で撮像または顕微鏡写真は、R1のようなより大きな間隔を有する炭素エッジとホーリーカーボン膜を含むべきではない場合は、/ 4、200メッシュの関心領域にステージを揃えるから地域を保護を支援するために使用することができます露出オーバーのルーチンをフォーカス及びトラッキングインチ - グロー放電装置におけるプラットフォーム上でスライドを置きます。
注：私たちは、陽極とプラットフォームは、真空デシケーター内に機械加工されており、高周波発生器によって供給されている社内のデバイスを使用しています。真空を作成した後、グリッドをグロー放電する1分間のプローブのアノードと電源に高周波発生器のプローブを接続します。グリッドをグロー放電に必要な時間は数秒から分の範囲とすることができます。グロー放電時間を変化させることのないガラス質氷で乾燥現れる検体濃度およびグリッドの問題を診断するために使用することができます。 - ピンセットのセットでグリッドを削除し、鉗子が弾性Bで閉鎖ロックそして。
- 1.4で製造したミニ細胞をマイクロ遠心チューブに10nmの金コロイド溶液100μlを加え、穏やかに指でチューブをフリックすることによって混合します。 2.2で製造したグリッド上の混合物の新しいピペット場所4μlの。
注：金コロイドは、サイズやケアの様々な利用可能ですが不明瞭な機能には大きすぎるものではないが、金の大きさは、取得した倍率で処理される顕微鏡写真のピクセルサイズ与えられた5ピクセル以上であることに注意しなければなりません興味を持っている。 - プランジ凍結装置を準備します。液体窒素で凍結外側の容器を満たす、次に液体エタンと内側室を埋めます。プランジャロッドにグリッドに鉗子を接続し、上昇位置にプランジャロッドをロックします。
注：商業プランジ凍結装置の使用を記載するプロトコルにイアンクら 20を参照してください。 - 注意深くtに濾紙片に触れることによって、グリッドをブロット彼はその後すぐにグリッドを凍結、プランジャロッドを解放し、グリッドとろ紙分離して停止したろ紙上に吸い上げ間のメニスカスまでサンプルのドロップします。慎重にプランジャロッドから鉗子を除去し、グリッドホルダーにグリッドを配置します。
- 液体窒素でローディングエリアと吸収ポンプ容器に充填することによりクライオEM転送ステーションを準備します。ローディングエリア一旦液体窒素温度の場所でグリッドホルダとローディングエリアにおける顕微鏡標本カートリッジです。
- 慎重以前Polara顕微鏡以降のモデルでは、Cスタイルのクリップリング上の小さなネジ付きロックリングのいずれかであるロックリングを取り外します。鉗子を使用してカートリッジへのEMグリッドを配置し、静かにグリッドを確保カートリッジに戻ってロックリングを再接続します。
- 顕微鏡からの複数の試料ホルダーを外し、搬送ステーションに接続します。カートリッジ鉗子使用してホルダーに試料カートリッジを置きますローディングエリアからホルダーを撤回し、顕微鏡に戻って、複数の試料ホルダーを転送dは。
注：Chenら21 2.1から2.9の詳細を視覚的プロトコルを参照してください。
3.ハイスループット自動チルトシリーズコレクション
- 低倍率マップのコレクション
- SerialEM 10の「ナビゲータ」メニュー（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM）の「開く」をクリックして、新しいNavigatorウィンドウを開きます。
- 許容可能な撮像条件が含まれているグリッドの正方形を探す（ すなわち、薄い氷、無汚染、関心の対象）は、低倍率で蛍光スクリーンを使用して（〜2,300Xミニ細胞標本用）。
注：[ オプション：このステップは、グリッド全体をモンタージュによってSerialEMで自動化することができます、しかし、それは単に手動でいくつかの領域を選択するために、高速になります。] - その後、調整し50℃に試料ホルダーを傾けることによってユーセントリックの高さにステージを調整しますステージのxy翻訳までZ高さは、傾斜と非傾斜ビュー間の最小です。
- グリッドの正方形の中央に移動し、現在のステージ位置を保存するためにナビゲータウィンドウで「追加ステージ順位」ボタンをクリックします。
- すべての許容可能なグリッドの正方形のステージ位置が保存されるまで、上記の手順3.1.1-4を続行します。
- 「ファイル」メニューの「新しいモンタージュ」をクリックして、新しいモンタージュMRCファイルを開きます。開くモンタージュ設定ダイアログでは、全グリッドの正方形（標準200メッシュグリッドのための例えば、10×10）を取得しますXとYにおけるピースの数を選択します。このような8の高ビニングを使用し、「画像をシフトさせる代わりにステージを移動して「ラジオボタン」の作品整列させるために使用相関スキップ」を選択します。
- ナビゲータウィンドウで最初のステージの位置をクリックして、「獲得」のチェックボックスをチェックして取得するように設定します。ナビゲータウィンドウの各ステージ位置のためにこれを繰り返します。
- ナビゲーターは、「ナビゲータ」メニューの「ポイントで取得」をクリックしてダイアログを取得開きます。 「獲得マップ画像」と「ラフeucentricity」チェックボックスをチェックし、他のすべてのチェックボックスがオフであることを確認してください。各ステージ位置でのモンタージュを収集するために、「進む」をクリックします。
- チルトシリーズの取得
- ナビゲータウィンドウで獲得したマップのいずれかを選択し、「ロードマップ」ボタンをクリックします。
- ナビゲータウィンドウでチルトシリーズの取得をする時にマップ内のボタン「ポイントの追加」を選択しポイントをクリックします。その後、ボタン「ポイントの追加の停止」をクリックします。収集された各マップの繰り返し。
- カメラメニューで「パラメータ」を選択し、フォーカス、裁判、および録音モードのパラメータを定義します。 [ オプション：用量分画したデータは、記録モードのパラメータで指定することができます。]
- ナビゲータウィンドウでポイントを選択し、「チルトシリーズをチェック9;チェックボックスをオンにします。チルトシリーズのコレクションのために必要なパラメータを選択し開きチルトシリーズの設定]ダイアログウィンドウで。 Navigatorウィンドウで選択されたポイントの残りのために繰り返しますが、マップを選択しないでください。
- ナビゲーターメニューで再び「ポイントで取得」を選択します。ナビゲータでダイアログを取得選択し、オートフォーカス」を項目に再調整 ''と 'ラフeucentricityの予備的作業として、選択し「ときにすべての列を閉じるには「チルトシリーズの取得」プライマリタスクとして、および選択'末端に閉じる列バルブを点の収集されました。チルトシリーズを進むと、各マップの各ポイントで収集されます。
Tomoautoを使用4.ハイスループット自動チルトシリーズの処理と復興
- 線量分画データでビーム誘起運動の補正[オプション]
注：TomoautoがMOTIONCORR 22を使用しています （http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htミリリットル）、用量分画し顕微鏡写真からビーム誘起運動を削除します。 NOTIONCORR 16は、システムにインストールする必要があります。- オリジナルのチルトシリーズとSerialEM 10およびすべての現在の作業ディレクトリ内の個々の用量分画した画像から、出力ログ、端末内のコマンドを実行します。
<filename.st> dose_fractioned_to_stack
<filename.st>プロセスにチルト系列の名前です。
- オリジナルのチルトシリーズとSerialEM 10およびすべての現在の作業ディレクトリ内の個々の用量分画した画像から、出力ログ、端末内のコマンドを実行します。
- チルトシリーズのアライメント・復興
注：デフォルトでTomoautoチルトシリーズの自動化基準モデル生成、配置、コントラスト伝達関数（CTF）、CTF補正23、の決意を処理するために（http://bio3d.colorado.edu/imod/）IMOD 13を使用し、再建。あるいは、ユーザーは、自動化された基準モデル生成、CTFのために（IMODに含まれる）RAPTOR 24を使用するには tomoautoでオプションを持っていますCTFを決定するFIND4 25（http://grigoriefflab.janelia.org/ctf）、および再構成のためかによるソフトウェアパッケージの任意の組み合わせで（https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d）26 tomo3d設定。各パッケージで利用可能なこの構成だけでなく、パラメータは、ローカル設定ファイルは、特定の検体に使用する詳細パラメータ、コレクションに作成することができる一方で、最も一般的に研究室で使用される値に合わせて編集することができ、グローバルコンフィギュレーション・ファイルによって処理されますセットまたは個々のチルトシリーズ。使用することを希望するすべてのパッケージがシステムにインストールする必要があります。- 現在の作業ディレクトリにチルトシリーズでは、ターミナルでコマンドを実行
tomoauto --CTF --mode =揃える<filename.st> <fid_diam>
<filename.st>チルトシリーズが処理されると<fid_diam>はディアメですナノメートル単位の基準マーカーのター。このコマンドは、自動的にチルトシリーズのCTFを揃えると推定されます。これは、コマンドからの--CTFオプションを除去することによって、CTF処理をスキップすることが可能です。 - アライメント処理の任意の明白なエラーを視覚的に整列チルトシリーズを検査し、コマンドを実行することにより、推定CTFを調べます：
3dmod <ファイル名> .ali
submfg <ファイル名> _ctfplotter.com
それぞれ、 ここで、< ファイル名>は接尾辞なしチルトシリーズの名前です。また、アライメント品質の定量的統計で整列によって生成された平均残留誤差を、見るためにtomoautoコマンドの出力を確認してください。 - 許容可能なアライメント与えられたコマンドを実行して処理を続行します：
tomoau--CTF --mode =に<filename.st> <fid_diam>再構築
4.2.1と同様に、ユーザ置換を伴います。このコマンドは、CTFを修正チルトシリーズの基準マーカーが消去され、再構築を計算します。ここでもCTF処理は4.2.1のように省略することができます。 - 目視検査手順をスキップし、完全にコマンドを実行し、処理し、再構築を自動化するには、[オプション]
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [オプション]ローカル設定ファイルを生成する方法についてtomoautoのドキュメントを参照して、特定のローカル構成を使用して、コマンドを実行するには
tomoauto [オプション] -L <LOCAL_CONFIG> <filename.st> <fid_diam>
ここで、<LOCAL_CONFIG>は、ローカルのconfの名前です。igurationファイル。
- 現在の作業ディレクトリにチルトシリーズでは、ターミナルでコマンドを実行
5.サブ断層アベレージ
注：我々は、サブ断層像の平均化実験を処理するために（http://www.electrontomography.org/）i3のパッケージ 15 を使用し 、しかし、プロトコルは説明最も利用可能なサブ断層平均ソフトウェアpackages16toプロセスサブ断層像の平均化実験、一般的に適用され、しかし、このプロトコルは、ほとんどの利用可能なサブ断層の平均化ソフトウェアパッケージ16-18に、一般的に適用される説明しました。
- 現在の作業ディレクトリに復元された断層像でコマンドを実行することによって粒子ピッキングのための断層像を開きます：
tomopick <ファイル名> .rec
ここで、<ファイル名>は4.2.2のようになります。 injectisomeを選択し、tomograのスライスを通してリフには、上下矢印キーを使用して最初の基礎体温、その後、針の先端を上にクリックし、マウスの左ボタンを使用して表示されるウィンドウでメートル。このようにすべての可視injectisomesを選択します。これは、テキストファイル内の座標は構造物の長軸を定義するだけでなく、構造体の向きを記述3オイラー角の2を推定格納します。 - 計算上のコマンドを実行して定義された長軸の中点を中心とする断層像から400 3ボクセルの立方体を抽出します。
クリップサイズ変更-CX <X> -cy <Y> -cz <Z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<ファイル名> .rec <ファイル名> _001.mrc
ここで、<x>は、<y>を、<Z>構造の中点座標があり、<ファイル名>は4.2.2のようになります。抽出された立方体の大きさは、構造によって変化すべきであると倍率が使用され、適切にこのサンプルの400 3ボクセルで関心のある構造を、同封するのに十分な大きさでなければなりません。 - ダウンサンプル（ビン）コマンドを実行することにより、初期位置合わせのための計算時間を削減する4倍サブ断層。
binvol -b 4 <ファイル名> _001.mrc <ファイル名> _001.bin4.mrc
ここで、<ファイル名>は5.2のようになります。 - 決定オイラーサブ断層像に角度適用し、コマンドを実行することにより、初期テンプレートを生成するために世界の平均を計算します。
I3totsum.sh - 合わせて、細胞質領域のバイナリ分類マスクを使用して、ダウンサンプリングされたサブ断層像を分類します。断層の特徴欠落しているウェッジアーティファクトを最小限にするために、フーリエ空間でサブ断層像の平均化を実行します。 4データをビニングするために、SAMPFACT = "4 4 4」を使用してください。
i3mramsacls.sh - ダウンサンプリング係数2でサブ断層像を使って手順を繰り返し5.5（= SAMPFACT＆＃34; 2 2 2」）ともう一度、元のデータと（SAMPFACT = "1 1 1」）。
i3mramsacls.sh
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Representative Results
ミニ細胞Sのサンプルフレクスナーを回収し、 図2に詳述され、パイプラインを使用して、次のtomoauto概略図を図1に示したように処理しました。 傾斜シリーズは、低倍率のモンタージュマップ上でユーザにより指定されたポイントでの高スループット傾斜シリーズ取得を可能SerialEM 10（ 図3）を用いて収集しました。顕微鏡写真は、ビーム誘起運動22（ 図4）を低減するために直接検出素子カメラに対する用量分画モードを使用して収集しました。 TomoautoはMOTIONCORR 22、さらに（動画1）を処理することがチルトシリーズに結果を組み立てて、それぞれの処理用量分画した顕微鏡写真のコレクションを取って動き補正を調整します。
tomoautoの最も一般的なアプリケーションはautomatiです初期の傾きシリーズのc整列。 Tomoautoは粗く傾斜シリーズを合わせ、最終的なアラインメントを生成するために使用する順番にある試料中の金コロイド粒子を、追跡初期基準モデルを生成するために、IMOD 13で必要なコマンドの連続実行を構成します。この基準モデルの精度は、再構成断層像の品質に不可欠であり、ユーザが視覚的に手動で処理されるべきであるチルトシリーズを識別するために、その後再建を進めるか前に自動的に計算された基準モデルを検査することが可能である。 図5に示す図 2傾斜シリーズ粗整列及びtomoautoによって生成されるように決定基準モデル図5A、Cは非傾斜画像を表示し、基準モデルは、基準マーカを中心モデル点で正しい両方における（b）、Dは tilt-対応示して図5（b）のモデル50度で、しばらくシリーズ図5（d）にはいくつかのモデル・ポイント（赤）は、それらに対応する金のマーカーから外れており、モデルはファインアライメントには適していません。このエラーは、モデル点の中心と金マーカーの可能性の中心間の平均残差として定量的に測定することができ、tomoauto測定エラー検査を促進するために、ユーザ定義のしきい値を超えた場合にユーザに警告するように構成することができます。不十分自動的に整列されている傾斜シリーズは、手動で整列させることができます。 tomoautoが正常に当社の収集チルトシリーズ（動画2）の約80％-90％を揃えていることを私たちを見つけます。
傾斜シリーズが正常に整列された後、最終的な断層像に再構成されなければなりません。ユーザは、IMOD 13または最後の再構成を生成するために、26 tomo3dを使用することができるようにTomoautoに設計されています。我々は現在、トンを使用omo3d大幅再構成時間を短縮するために現代のマルチコアコンピュータ処理装置（CPU）のいくつかの機能を活用します。 図6 ムービー3に示すように、最終的な断層像は、その後、セグメンテーションによる細胞注釈、または試料内の分子機構のより高い解像度の情報を取得するために平均化サブ断層像のために使用することができる画像形成されたサンプルの3次元ボリュームです。サブ断層像平均増加SNRとの両方が、個々の断層像のノイズの高レベルを平均し、に関してランダム方位のよく分散型セットでの多数サブ断層像を利用することにより、欠落したウェッジによって生成アーティファクトを減少させます成果物を制限し、最終的な解決を改善するためにくさびを逃します。そのままSの 2.7nmサブ断層像の平均この技術の共同でできる大改良を示すEMDB（EMD-2667）、に寄託としてフレクスナー T3SS を図7に示されています図6Bの単一断層像に表示injectisomeにmpared。
高スループット低温電子断層撮影法の図1概略図。液体懸濁液は急速にEMグリッド上で凍結され、チルト系列のセットは、自動化されたコンピュータ制御の電子顕微鏡によって収集されます。結果の顕微鏡写真は、断層画像を生成するtomoautoを使用して自動的に処理されます。ここでの最後のステップは、セグメントSです。胡らから、このプロトコルによって生成された断層像からフレクスナーミニセル。2015 15。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
tomoautoプロセスの図2のフローチャート。tomoautoワークフローの内訳は、データがすべての方法最後のサブ断層像の平均への線量分画顕微鏡写真のコレクションからどのように処理されるかを示しています。サブプロセスのシンボルの詳細設定され、適切なソフトウェアを実行して、入力を処理する座標をtomoauto作業。ドキュメント及びマルチドキュメントシンボルが実際にユーザが取り扱う出力を示しているが、データシンボルは、出力は、一般に、ユーザが使用していない示します。最後に、シンボルは、ユーザーの介入がワークフローで発生した場所を示す表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SerialEMナビゲータ図3.バッチチルトシリーズの取得。ステージ位置として記憶されているモンタージュマップの位置（図示のSelectI）にナビゲータウィンドウの一覧の画面の左側に示され、現在ロードされてマップを取得するためのマップに追加赤い十字で数値的にラベルされた選択されたポイントと一緒にバッファ・ウィンドウに表示されます。獲得ポイントは、Navigatorウィンドウにラベルでリストされ、「チルトシリーズ」チェックボックスを使用して取得するように設定することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
用量分画したデータに対して動き補正の図4.効果。 （A）は非傾斜し、補正顕微鏡写真を示し、（MOTIONCORRによって処理）、動き補正された画像は、（B）に示される、コントラスト補正後の少し改善されます。改善は、フーリエTRANSFを見ることでより明らかに見ることができます顕微鏡写真のORM（C）の前に、および（D）は、動き補正後。画像はEH同じ情報を示していないが、コントラストが低下し、CとDに表示トーンリングされた60度、で傾斜顕微鏡写真でもはや高傾斜で見ることができます。スケールバーは250nm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図tomoauto自動チルトシリーズのアライメントの5良い面と悪い結果。 （A）非傾斜おおよそ整列顕微鏡写真とtomoautoを使用して自動的に生成された基準モデル。（B）50度の傾きの判定基準モデル。このモデルはまだよくフィットし、適切な基準マーカーの中央に配置されます。（C、D） （A、B）でモデルを表示します。このチルトシリーズは、1.06画素の平均残差に合わせた。（E）他のチルトシリーズと50度の傾斜で（F）シリーズから非傾斜顕微鏡写真と基準モデル。ここでは、モデルは、いくつかの基準マーカ（赤で表示）のトラックを失ったし、これは悪い自動追跡の代表であることがわかります。（G、H）箱入りの領域でズームイン、それぞれ（E、F）でモデルを表示します。このチルトシリーズは、3.51画素の平均残留誤差で位置合わせされ、一連の手動アラインメントによって処理されなければならなかった。（A）スケールバーは500nm（C）スケールバーは50nm。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。
図6.断層像tomoautoによって自動的に生成されました。 （A）これは、 図4Aに表示されたチルトシリーズの復興の中心から7スライスの投影が表示されます。 （A）中の四角で囲まれた領域を考慮してズームスケールバーは250nm（B）A無傷injectisomeを表示します。スケールバーは100nm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
そのまま Sの 図7.サブ断層像の平均 フレクスナー III型分泌システム。 （A）は、無傷 のS. 2.7 nmのサブ断層像の平均の中央スライスEMDB（EMD-2667）からフレクスナー T3SS。（B）全投影に沿ってボリュームのX軸（C）IMOD 130の輪郭閾値で観察体積のisosurfaceのレンダリング。スケールバーは5nm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
動画1：非整列チルトシリーズのアニメーション（右クリックしてダウンロード）最初にSerialEMによって収集されたように、このアニメーションは、チルトシリーズを介して実行されます。並進シフトは、簡単に画像から画像への個々の基準マーカーの不安定なパスによって識別され、チルトシリーズを再構築することができる前に、目立た欠陥と一緒にこれらのシフトを修正する必要があります。
ムービー2：整列チルトシリーズのアニメーションは、（右クリックしてダウンロード）このアニメーションはtomoautoによる自動位置合わせした後、ムービー1で表示され 、同じ顕微鏡写真を介して実行されます。基準マーカーの不安定なパスは現在のチルトシリーズを通じてスムーズな軌跡をたどると、チルト軸は、視聴者に対して垂直に整列しています。
ムービー3：再構成されたチルトシリーズのアニメーション（右クリックしてダウンロード）このアニメーションムービー2（b）に表示されたチルトシリーズの図6に生成した後に自動復興に示す断層像を通りますY tomoauto。
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Discussion
ここで説明するハイスループット法は、1917クライオチルトシリーズを処理し、そのままSの 4,500を超えるサブ断層像を生成することができましたフレクスナー injectisome 19は、収集されたデータは、複雑なソート細胞質を含め、 その場 injectisome での詳細な特性評価につながりました。この方法はまた、injectisomeの選別プラットフォームの組成を解明する助け推定上のタンパク質成分の特定の欠失を有するいくつかの変異体細胞を可視化するために利用されました。我々の方法はinjectisomeの構造 - 機能関係を研究するための新しい手段を提供しました。その結果、新たなステージをT3SS媒介分泌および病原性のメカニズムのさらなる解剖のために設定しました。
ここで紹介するプロトコルは、完全なSの高スループットクライオ-ETを説明フレクスナー、しかし凍結ETに適した任意のプロジェクトに適用可能です。この方法は、structuで使用されていますボレリアburgdorferiは 27、Eの感染のべん毛モーターのRAL特性評価大腸菌におけるバクテリオファージT7 28、および化学受容体の配列により大腸菌ミニセル大腸菌 29。大規模なデータセットの収集を容易にすることによって、複数の変異体だけでなく、画像、機械アセンブリ27およびファージ感染28の進行などの動的プロセスの推論を可能にする条件の多数をスクリーニングすることが可能です。複数のソフトウェアパッケージを収集し、処理実行を完全に制御を可能にすることによって、ユーザーは最適な結果を得るためのパッケージの異なる組み合わせをカスタマイズすることができます。 Chenら21は、以前にソフトウェアパッケージLeginon 12を使用してデータを収集し、IMOD 13及びRAPTOR 24を使用して、傾斜シリーズ処理を自動化する記述類似のプロトコルを発表しました。現在のプロトコルは、同時に別の方法を詳述し、このメソッドを補完llectingと処理データも技術や手順は、用量分画データ、自動化されたCTF推定と補正、内より堅牢な自動アライメント・ルーチンで、高度なサブ断層の平均化を通じた高解像度の増加焦点で駆動しているどのくらい示しながらIMOD 13。以前のプロトコルは、データ収集に重点を置いた視覚的な詳細に入るが、この方法では、収集されたデータを処理の詳細に焦点を当てています。
主要なボトルネックとプロジェクトとの行為を遅く面倒なマニュアル介入の量を制限しながらハイスループット法は、顕微鏡およびコンピュータリソースの使用率を最大化し、大規模なデータ収集を可能にします。ラッパー・ライブラリーtomoautoはシンプルで一元的に各ソフトウェアパッケージで使用されるすべてのパラメータの完全な設定を可能にするように設計されています。適切な設定が決定されると、それはその後、全Dに設定を適用することは容易ですataset。マイナーサブセットを手動で処理されることが要求される一方で傾斜シリーズの大部分は、許容可能な結果（ 図4A）で処理することができます。これらのチルトシリーズは通常、過度の画像シフト、コントラストが低い、または失敗するために自動化された基準追跡ルーチンを引き起こすのに十分な基準マーカーの欠如（ 図4B）に悩まさ少ない理想的な買収です。可能な限り最高の断層像を得るためには、広範なケアは、サンプル調製、画像取得から、画像処理をすべての重要なステップで取られなければなりません。
このような自動化されたサブ断層像のテンプレートマッチングによる抽出とtomoautoのような既存のワークフローパイプラインに、このようなダイナモなどの近代的なサブ断層の平均化ソフトウェアパッケージの統合などの高スループットクライオ-ETにおけるさらなる発展は、現在検討されています。新世代の直接検出デバイスカメラの最近の出現は、傾斜シリーズのSNRを増加させ、MORを可能に大きな改善を行っています検出器の高効率化に電子一貫CTF決意。新しいフル金グリッドタイプの使用は、手動介入30にはあまり必要と自動チルト系処理および再構成のための成功率を向上させる、傾斜シリーズ収集欠陥を減少させることができます。最終的に、大きなデータセットの処理を並列化し、スピードアップするために、コンピュータ・クラスタとグラフィック処理ユニット（GPU）の今ユビキタス使用して、これらのシステムを利用することができるパイプラインの開発がすぐに願わくはをユーザに提供し、時間の日から実行時間を短縮することができるであろう実験のデザインと意味のあるデータ分析の間でもまだ少ないダウンタイム、まだデータセットのサイズを大きくし、より高い解像度を達成することができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちはコメント博士ウィリアム・マーゴリンに感謝します。私たちは、博士からSerialEMのサポートに感謝しています。デビッドMastronardeとチェン徐。 DM、BHとJLは、ウェルチ財団から国立アレルギー感染症研究所、総合医科学研究所（NIGMS）から補助金R01GM110243とR01GM107629、グラントAU-1714からの助成金R01AI087946によってサポートされていました。直接電子検出器は、健康賞S10OD016279の国立研究所によって資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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