Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, wie Hochdurchsatz-Kryo-Elektronentomographie zu nutzen, um hochauflösende in situ Strukturen der molekularen Maschinen zu bestimmen. Das Protokoll unterstützt große Datenmengen zu verarbeiten sind, vermeidet gemeinsame Engpässe reduziert Ressourcenstillstandszeit, so dass der Benutzer auf wichtige biologische Fragen zu konzentrieren.
Introduction
Typ III-Sekretion Systeme (T3SS) sind wesentliche Virulenzdeterminanten für viele gramnegative Krankheitserreger. Die Injektisoms, auch bekannt als die Nadel-Komplex bekannt ist, ist die zentrale T3SS Maschine für direkte Translokation von Effektor-Proteine aus dem Bakterium in eukaryotischen Wirtszellen 1, 2 erforderlich. Die Injektisoms umfasst eine extrazelluläre Nadel, ein Basaltemperatur und einen zytoplasmatischen Komplex ebenfalls bekannt als Sortierkomplexe 3. Frühere Studien haben 3-D-Strukturen von gereinigtem injectisomes aus Salmonella und Shigella erläutert, zusammen mit den atomaren Strukturen der Haupt Basaltemperatur Proteinen 4, 5. Jüngste in situ Strukturen injectisomes aus Salmonella, Shigella und Yersinia wurden enthüllt Kryo-ET 6 , 7. Jedoch ist die cytoplasmatische Komplexes wesentlich für Effektorzellen Auswahl und Nadelbaugruppe, nicht in diesen Strukturen sichtbar gemacht.
Cryo-ET wird der MOS-t geeignete Technik für die Bildgebung molekulare Maschinerie in Nanometer-Auflösung in seiner nativen zellulären Kontext (in situ). Dennoch ist die erreichbare Auflösung durch Kryo-ET von Probendicke begrenzt. Um den Nachteil zu überwinden, bebildert wir intakte injectisomes in einem virulenten Shigella flexneri Stamm, der genetisch veränderten wurde auf Minizellen dünn genug für die Kryo-ET zu produzieren. Eine weitere Einschränkung der Kryo-ET ist die Empfindlichkeit der Probe auf die Strahlung von dem Elektronenstrahl, die sehr schnell zerstört die Information hoher Auflösung in der Probe induziert wird. Als Ergebnis sind extrem niedrige Dosen für einzelne neigungsBilder verwendet, so daß eine geeignete Dosis kann unter der vollen Neigungsreihe verteilt sein. Dies das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in der endgültigen Rekonstruktion, wodurch es schwierig ist, die strukturellen Merkmale des Gegen aus der großen Menge von Rauschen in dem Tomogramm zu differenzieren und begrenzt die Auflösung, die durch Kryo- erzielbaren senkt erheblich ET. Conventional Bildverarbeitung wie Fourier und Realraumfilter sowie Abwärtsabtasten kann verwendet werden, um den Kontrast zu erhöhen, aber auf Kosten der Ausfilterung viel von der Information hoher Auflösung. In jüngerer Zeit hat Unter Tomogramm Lungs machte es möglich, stark zu erhöhen das SNR und anschließend die endgültige Lösung in einigen Fällen auf Sub-Nanometerstufen 8, 9. Eine detailliertere Analyse von Komplexen ermöglicht wird durch rechen Extrahieren Tausende von Teilschnittbildern, enthaltend die Bereiche von Interesse von den ursprünglichen Schichtaufnahmen und dann Ausrichten und Mittelwertbildung der Teilschnittbilder in situ komplexe Strukturen mit höherer SNR und eine höhere Auflösung zu bestimmen. Diese Verfahren können mit genetischen Methoden noch größere Einblicke in die makromolekularen Anordnungen und ihre dynamischen Konformationen in der nativen zellulären Kontext bereitzustellen integriert werden.
In der Regel Dutzende oder sogar Hunderte von tausend Unterschichtaufnahmen müssen, um zu bestimmen, Hoch gemittelt werden-Auflösung Strukturen in situ. Die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Tilt-Serie erforderlich, um zu produzieren diese große Anzahl von Unterschichtaufnahmen schnell zu einem Engpass. Die sich ergebende Tilt-Serie werden häufig durch strahlinduzierte Verschiebung der Bühne spiel sowie Vergrößerung, Rotation und Schräg Mängel, die gelöst werden müssen, um die Neigung der Serie in eine Ausrichtung vor der Rekonstruktion zu bringen betroffen. Der Neigungsserie wird in der Regel durch die Verfolgung Goldbezugsmarkierungen, die traditionell von Hand durch Inspektion des Tilt-Reihe ausgewählt sind, wodurch eine weitere Flaschenhals ausgerichtet sind. Viele Software-Pakete für die automatisierte Tilt-Serie Nahme durch computergesteuerte Elektronenmikroskopen 10, 11, 12, Tilt-Serie Ausrichtung und Wiederaufbau 13, 14 und Unterschichtaufnahme von durchschnittlich 15 bis 18 entwickelt. Da diese Pakete hand diskreten Operationen in den Workflow der Kryo-ET, wird es wünschenswert, einen höheren Abstraktionsebene in den Prozess zu systema bauendas gesamte Schema tisch zu optimieren zu einer einzigen Pipeline. Daher entwickelten wir eine Software-Wrapper-Bibliothek "tomoauto" entwickelt, um eine Reihe von diesen Paketen in einem einzigen halbautomatische Einheit zu organisieren, so dass für einfache User-Betrieb bei voller Konfiguration jeder Komponente in einer zentralisierten Weise. Die Bibliothek ist Open-Source, gut dokumentiert, fortlaufend entwickelt und für den Einsatz frei verfügbar, maßgeschneiderte Entwicklung oder die weitere Integration mit Hilfe eines Online-Remote-Quellcode-Repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Dieses High-Throughput-Kryo-ET Leitung wurde verwendet, um intakt injectisomes in S. visualisieren flexneri Minizellen. Insgesamt 1.917 Schichtaufnahmen wurden mit dieser Methode erzeugt werden, offenbart eine hochauflösende in situ Struktur des intakten Maschine einschließlich der zytoplasmatischen Sortierplattform von Unterschichtaufnahme von durchschnittlich 19 bestimmt. Zusammen mit Molecular Modeling von Wildtyp und mutant Maschinen, bietet unser Hochdurchsatz-Pipeline einen neuen Weg, um den Aufbau und die Funktion des intakten Injektisoms im nativen zellulären Kontext zu verstehen.
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Protocol
1. Minicell Vorbereitung
- Um S. machen flexneri Minizellen, zu transformieren 1 ul Plasmid pBS58, die konstitutiv exprimiert Escherichia coli Zellteilungsgene ftsQ, FTSA und ftsZ aus einem low-copy Spectinomycin-resistente Plasmid in 5 ul elektrokompetente Streptomycin-resistente Serotyp 5a (M90T-Sm) Zellen durch Elektroporation bei 2,5 kV für 5 ms in 1 mm Küvetten.
- Speicher Minizellenproben bei -80 ° C in 15% Glycerin in 1,5 ml Kryo-Mikroröhrchen. Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, kratzen etwa 5 & mgr; l von Zellen aus dem unthawed Mikroröhrchen mit einer Pipettenspitze und die Zellen in 4 ml tryptische Sojabrühe mit Spectinomycin hinzugefügt, um 100 ug / ml-Konzentration. Wachsen Sie O / N bei 37 ° C.
- Pipette wurden 2 ml der Kultur von 1,2 in 200 ml tryptischer Sojabrühe mit Spectinomycin erneut auf 100 & mgr; g / ml Konzentrationen zugegeben. Wachsen bei 37 ° C bis zur späten log-Phase.
- Um Minizellen, Zentrifugen bereichern200 ml der Kultur von 1,3 bei 1.000 xg für 5 min. Die Überstandsfraktion in ein neues Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere sorgfältig gießen bei 20.000 × g für 10 min. Vorsichtig abgießen und den Überstand verwerfen Fraktion und vorsichtig mischen des Pellets mit der verbleibenden Flüssigkeit mit einer Pipettenspitze und übertragen etwa 100 & mgr; l des Pelletmischung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. EM Grid Vorbereitung
- Legen Sie eine R2 / 2 löchrigen Kohlenstofffilm 200 mesh Kupfernetz Kohlenstoffseite nach oben auf einen Glasobjektträger.
HINWEIS: Ein R2 / 2 200-mesh Gitter ausgewählt ist, um die Anzahl der Tilt-Serie, die eingestellt werden können, in einem einzelnen Rasterquadrat erwerben bei gleichzeitiger Unterstützung der Probe und Platzieren der Kante der Kohlenstoffschicht im Bereich der Kamera zu maximieren bei der gewünschten Vergrößerung. Feineren Maschengitter und kleinere löchrigen Kohlenstoffschichten, wie R1.2 / 1.3 400 Mesh kann für Proben bei höherer Vergrößerung abgebildet werden; größere löchrigen Kohlenstoffschichten, wie R3.5 / 1 200 mesh können nützlich seind für Proben, die bei geringer Vergrößerung abgebildet wird, oder wenn die Mikrophotographie sollte nicht die Kohlenstoffkante und löchrigen Kohlenstoffschichten mit größerer Abstand wie R1 enthalten / 4 200 mesh verwendet, um die Ausrichtung der Bühne, um den interessierenden Bereich und der Schutz Bereiche aus zu unterstützen Überbelichtung in Fokussier- und Spur Routinen. - Setzen Sie den Schieber auf der Plattform in einer Glimmentladung Gerät.
HINWEIS: Wir verwenden eine interne Vorrichtung, in der eine Anode und Plattform wurde in einem Vakuumexsikkator bearbeitet worden und wird von einem Hochfrequenzgenerator gespeist. Nach dem Anlegen eines Vakuums, befestigen Sie den Hochfrequenzgenerator-Sonde an die Anode und schalten Sie die Sonde für 1 min, um eine Glimmentladung das Raster. Die erforderliche Zeit, um eine Entladung das Gitter kann von wenigen Sekunden bis zu einer Minute liegen glühen. Variieren der Gasentladungszeit kann verwendet werden, um Probleme mit der Probenkonzentration und Netze, die ohne Glaskörper Eis trocken erscheinen zu diagnostizieren. - Entfernen Sie das Gitter mit einer Reihe von Pinzetten, und verriegeln Sie die Zange mit einer elastischen b geschlossenund.
- Fügen Sie 100 ul von 10 nm kolloidalem Gold Lösung des Mikrozentrifugenröhrchen mit den in 1.4 hergestellte Minizellen und mischen durch vorsichtiges Schwenken der Röhre mit einem Finger. Mit einer neuen Pipetten Platz 4 ul der Mischung auf die in 2.2 hergestellte Raster.
HINWEIS: Kolloidales Gold ist in einer Vielzahl von Größen und es sollte darauf geachtet werden, dass die Größe der Gold größer als 5 Pixel aufgrund der Bildpunktgröße der Mikroaufnahmen an das erworbene Vergrößerung verarbeitet werden, werden zwar nicht zu groß, um dunkle Merkmale von Interesse. - Bereiten Sie den Sprung Gefriergeräte; füllen die äußeren Gefrierbehälter mit flüssigem Stickstoff und füllen Sie dann die innere Kammer mit flüssigem Ethan. Befestigen Sie die Zange mit dem Raster, um die Kolbenstange und verriegeln Sie die Kolbenstange in die angehobene Position.
HINWEIS: Siehe Iancu et al 20 für ein Protokoll, welche die Verwendung eines handelsüblichen Tauchgefriergerät.. - Tupfen Sie das Raster durch vorsichtiges berühren ein Stück Filterpapier zu ter der Probe fallen, bis der Meniskus zwischen dem Gitter und Filterpapier trennt und die Docht auf dem Filterpapier hält, dann kurz die Kolbenstange, das Einfrieren des Gitters. Die Zange vorsichtig aus der Kolbenstange und setzen Sie das Gitter in eine Gitterhalter.
- Bereiten Sie die Kryo-EM-Transferstation durch Füllen der Ladefläche und Absorptionspumpe Behälter mit flüssigem Stickstoff. Sobald der Ladebereich ist Temperatur von flüssigem Stickstoff statt der Netzhalter und ein Mikroskop Probenpatrone in den Ladebereich.
- Entfernen Sie vorsichtig den Sicherungsring, der entweder eine kleine Gewindeverriegelungsring auf früheren Polara Mikroskopen oder einem C-Stil-Clipring bei späteren Modellen ist; platzieren Sie den EM Grid in die Patrone mit einer Pinzette und dann sanft bringen Sie den Sicherungsring wieder auf die Patrone Befestigung des Gitters.
- Entfernen Sie die Mehrfachprobenhalter aus dem Mikroskop und befestigen es an der Übergabestation. Setzen Sie die Patrone in den Probenhalter mit einer Pinzette eine Patroned Legen Sie den Halter von der Ladefläche zurückziehen und übertragen Sie die Mehrfachprobenhalter zurück in das Mikroskop.
Hinweis: Siehe Chen et al 21 für eine visuelle Protokoll Detaillierung 2,1-2,9..
3. Hochdurchsatz Automatisierte Tilt-Serie Sammlung
- Sammlung von Low-Vergrößerung Karten
- Öffnen Sie eine neue Navigator-Fenster, indem Sie auf "Öffnen" in der "Navigator" Menü SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Finden Planquadrate, die akzeptable Abbildungsbedingungen enthalten (dh dünnem Eis, keine Verunreinigung, Thema von Interesse) mit dem Leuchtschirm bei niedriger Vergrößerung (~ 2,300X für die Minizellenprobe).
HINWEIS: [Optional:. Dieser Schritt kann mit SerialEM durch Anbringung von das gesamte Raster automatisiert werden, aber es schneller sein, senden Sie einfach ein paar Bereiche manuell] - Stellen Sie die Bühne, um euzentrischen Höhe durch Neigen des Probenhalters um 50 ° und stellen Siedie z-Höhe, bis die XY-Translationsbühnen minimal zwischen den geneigten und nicht geneigten Ansichten.
- Zu bewegen, um das Zentrum der Planquadrat und klicken Sie auf "Hinzufügen Bühnen Pos" Knopf im Navigator-Fenster, um die aktuelle Tischposition zu speichern.
- Weiter Schritte 3.1.1-4 oben, bis alle akzeptable Planquadrate Tischpositionen gespeichert wurden.
- Öffnen Sie eine neue Montage MRC-Datei, indem Sie auf 'New montage "im Menü" Datei ". In der Montage Setup Dialog, die sich öffnet, wählen Sie eine Reihe von Stücken in X und Y, die den gesamten Planquadrat (zB 10 x 10 für eine Standard-200 mesh Gitter) erwerben wird. Verwenden Sie eine hohe Binning wie 8 und wählen Sie die "Move Bühne statt Shifting Bild 'und' überspringen Korrelationen verwendet, um Stücke auszurichten 'Radio-Buttons.
- Im Navigator-Fenster klicken Sie auf die erste Stufe Position und setzen Sie ihn auf, indem Sie die "Acquire" Checkbox, erworben werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Stufe Position im Navigator-Fenster.
- Öffnen Sie den Navigator Erwerben Dialog, indem Sie auf "Erwerben Sie bei Punkte" in der "Navigator" -Menü. Überprüfen Sie die "Acquire Kartenbild" und "Raue eucentricity" Kontrollkästchen und stellen Sie sicher, dass alle anderen Kontrollkästchen deaktiviert sind. Klicken Sie auf "Weiter", um eine Montage in jeder Phase Position zu sammeln.
- Tilt-Serie Acquisition
- Im Navigator-Fenster wählen Sie eine der erworbenen Karten und klicken Sie auf den 'Load Karte' button.
- Im Navigator-Fenster klicken Sie in der Karte, an dem einen Tilt-Serie erwerben die 'Add Punkte "Taste und wählen Sie Punkte. Klicken Sie dann auf die "Stopp Hinzufügen von Punkten 'button. Wiederholen Sie für jede Karte gesammelt.
- Im Kamera-Menü wählen Sie "Parameter" und definieren Sie die Parameter für die Bildschärfe, Gerichtsverhandlung, und Aufnahmemodi. [Optional:. Dosis-fraktioniert Daten können in Parameter für Record-Modus festgelegt werden]
- Wählen Sie einen Punkt im Navigator-Fenster und überprüfen Sie die "Tilt-Series9; Kontrollkästchen. Klicken Sie im Dialogfenster Setup-Tilt-Series, die wählen Sie die Parameter öffnet Wunsch für den Tilt-Serie Sammlung. Wiederholen Sie dies für den Rest der ausgewählten Punkte im Navigator-Fenster, aber nicht die Karten zu wählen.
- Im Navigator-Menü wählen Sie erneut die "Erwerben Sie bei Punkte". Im Navigator Erwerben Dialog wählen Sie "Richten Sie den Artikel" Autofokus "und" Raue eucentricity ', wie Vorarbeiten, und wählen Sie "Acquire Kippserie' als primäre Aufgabe, und wählen Sie" Schließen Spalte Ventile am Ende ", um die Spalte zu schließen, wenn alle der Punkte wurden gesammelt. Nach fortfahren einem Tilt-Serie wird an jedem Punkt in jeder Karte gesammelt werden.
4. Hochdurchsatz Automatisierte Tilt-Serie Verarbeitung und Rekonstruktion Mit Tomoauto
- Korrektur der Lichtstrahl-induzierte Bewegung in Dosis-fraktioniert Daten [optional]
HINWEIS: Tomoauto verwendet MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) zu strahlen-induzierte Bewegung von Dosis-fraktioniert mikroskopischen Aufnahmen zu entfernen. NOTIONCORR 16 muss auf dem System installiert werden.- Mit dem Original Tilt-Serie, der Ausgabeprotokoll aus SerialEM 10 und der Einzeldosis-fraktionierten Bilder aller im aktuellen Arbeitsverzeichnis, in einem Terminal den Befehl:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> ist der Name des Tilt-Serie zu verarbeiten.
- Mit dem Original Tilt-Serie, der Ausgabeprotokoll aus SerialEM 10 und der Einzeldosis-fraktionierten Bilder aller im aktuellen Arbeitsverzeichnis, in einem Terminal den Befehl:
- Ausrichtung und Rekonstruktion der Tilt-Serie
HINWEIS: Tomoauto standardmäßig verwendet IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) zu kippen-Serie automatische Bezugsmodellgeneration, Ausrichtung, Bestimmung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF), CTF-Korrektur 23, Handgriff und Wiederaufbau. Alternativ Nutzer haben die Möglichkeit, in tomoauto zu RAPTOR 24 verwenden (in IMOD enthalten) für die automatische Bezugsmodellgeneration, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf), um die CTF bestimmen und tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) zur Rekonstruktion oder in irgendeiner Kombination von Software-Paketen durch Konfiguration. Diese Konfiguration sowie die verfügbaren Parameter in jedem Paket wird von einem globalen Konfigurationsdatei, die bearbeitet werden können, um die Werte am häufigsten in einem Labor verwendet werden, angepasst werden, während lokale Konfigurationsdateien können auch Detail-Parameter für eine bestimmte Probe verwendet, Sammlung erstellt werden behandelt eingestellt oder einzelne Tilt-Serie. Alle Pakete, die verwendet werden will, muss auf dem System installiert werden.- Mit der Tilt-Serie in der aktuellen Arbeitsverzeichnis, in einem Terminal den Befehl
tomoauto --CTF --mode = align <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> ist der Tilt-Serie verarbeitet werden und <fid_diam> der Durchter der Bezugsmarkierungen in Nanometern. Dieser Befehl wird ausrichten und schätzen Sie die CTF des Neigungs-series automatisch. Es ist möglich, CTF Verarbeitung durch Entfernen der --CTF Option aus dem Befehl zu überspringen. - Untersuchen Sie das ausgerichtet Tilt-Serie optisch für eklatante Fehler bei der Ausrichtung Verarbeitung und überprüfen den geschätzten CTF durch Ausführen der Befehle:
3dmod <Dateiname> .ali
submfg <Dateiname> _ctfplotter.com
jeweils, wobei <Dateiname> ist der Name des Tilt-Serie ohne Suffix. Überprüfen Sie auch die Ausgabe des Befehls tomoauto, um die durch die Ausrichtung, die eine quantitative statistische der Ausrichtungsqualität erzeugt mittlere Restfehler zu sehen. - Angesichts eine akzeptable Ausrichtung gehen Verarbeitung durch Ausführung des Befehls:
tomoauum --CTF --mode = reconstruct <filename.st> <fid_diam>
mit den gleichen Benutzer Substitutionen wie in 4.2.1. Dieser Befehl wird die CTF zu beheben, löschen Sie die Bezugsmarkierungen vom Tilt-Serie und berechnen den Wiederaufbau. Wieder CTF Verarbeitung kann wie in 4.2.1 übersprungen werden. - [optional] Um die visuelle Inspektion Schritt überspringen und vollständig zu automatisieren die Verarbeitung und Rekonstruktion führen Sie den Befehl
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [optional] Um eine bestimmte lokale Konfiguration verwenden, finden Sie in der tomoauto Dokumentation, wie man eine lokale Konfigurationsdatei zu erstellen, und führen Sie dann den Befehl
tomoauto [Optionen] -L <LOCAL_CONFIG> <filename.st> <fid_diam>
wobei <LOCAL_CONFIG> ist der Name des lokalen configuration Datei.
- Mit der Tilt-Serie in der aktuellen Arbeitsverzeichnis, in einem Terminal den Befehl
5. Unter Tomogramm Averaging
HINWEIS: Wir verwenden die i3-Paket 15 (http://www.electrontomography.org/), um Unter Tomogramm Lungsversuche Verfahren ist jedoch beschrieben, das Protokoll gilt generell für die meisten verfügbaren Unter Tomogramm Lungssoftware packages16to Prozessunter Tomogramm Lungsversuche, jedoch beschrieben das Protokoll gilt generell für die meisten verfügbaren Unter Tomogramm Lungssoftwarepakete 16-18.
- Mit dem rekonstruierten Tomogramms in das aktuelle Arbeitsverzeichnis öffnen, die Tomogramm für die Partikel Kommissionierung mit dem Befehl:
tomopick <Dateiname> .rec
wobei <Dateiname> ist, wie in 4.2.2. In dem Fenster, das Sie mit der linken Maustaste, um klicken Sie zuerst die Basaltemperatur und dann die Nadelspitze eine Injektisoms auszuwählen und verwenden Sie die Pfeiltasten, um durch die Scheiben des tomogra Riff eröffnetMeter Markieren Sie alle sichtbare injectisomes auf diese Weise. Dieser speichert die Koordinaten in einer Textdatei die lange Achse der Struktur definieren, als auch die Schätzung zwei der drei Euler-Winkel die Orientierung beschreibt der Struktur. - Rechnerisch Extrakt 400 3 Voxel Würfel aus dem Tomogramm in dem Mittelpunkt der langen Achse definiert durch Ausführen des Befehls zentriert:
Clip resize -CX <x> -cy <y> -cz <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<Dateiname> .rec <Dateiname> _001.mrc
wobei <x>, <y>, <z> sind die Mittelpunktkoordinaten der Struktur und <Dateiname> ist, wie in 4.2.2. Die Größe des extrahierten Würfels sollte von der Struktur und dem verwendeten Vergrößerung variieren und sollte groß genug sein, um die Struktur von Interesse, die für diese Probe beträgt 400 3 Voxeln ausreichend umschließen. - Down-Probe (bin) der Teilschnittbildes um einen Faktor von vier, um die Rechenzeit für die Anfangsausrichtung mit dem Befehl zu reduzieren:
binvol -b 4 <Dateiname> _001.mrc <Dateiname> _001.bin4.mrc
wobei <Dateiname> ist wie in 5.2. - Übernehmen der Euler-Winkel bestimmt den Unterschichtaufnahmen und berechnen Sie die globalen Durchschnitt, um die anfängliche Vorlage mit dem Befehl zu erzeugen.
I3totsum.sh - Richten und zu klassifizieren abwärts abgetastet Unterschichtbilder mit Hilfe eines binären Klassifizierungsmaske der cytoplasmatischen Region. Führen Sie Unter Tomogramm Lung im Fourierraum, um die fehlenden Keils Artefakte Merkmal der Tomographie zu minimieren. Für Binning 4 Daten, nutzen Sie bitte SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Wiederholen Sie Schritt 5.5 mit Teilschnittbilder mit einem Faktor von zwei (SAMPFACT = & Downsampling# 34; 2 2 2 ") und noch einmal mit den ursprünglichen Daten (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
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Representative Results
Proben von Minizellen S. flexneri wurden gesammelt und verarbeitet, wie in der schematischen Abbildung 1 mit tomoauto folgende der Pipeline in Figur 2 detailliert gezeigt. Tilt-Serie wurden mit SerialEM 10, die für die Hochdurchsatz-Tilt-Serie Erfassung an seitens des Nutzers auf schwachen Vergrößerungs montage Karten bezeichneten Punkten ermöglicht (Abbildung 3) gesammelt. Aufnahmen wurden mit Dosis-Fraktionierung auf einem Direktmodus-Detektionseinrichtung Kamera strahlinduzierte Bewegung 22 (Figur 4) zu reduzieren gesammelt. Tomoauto koordiniert Bewegungskorrektur unter eine Sammlung von Dosis-fraktionierten Mikroskopische Aufnahmen der Verarbeitung jedes mit MOTIONCORR 22 und montiert die Ergebnisse in eine Tilt-Serie weiterverarbeitet werden (Movie 1).
Die allgemeine Anwendung der tomoauto ist die Autc Ausrichtung einer anfänglichen Tilt-Serie. Tomoauto komponiert sequentielle Ausführung der notwendigen Befehle in IMOD 13 bis grob ausrichten Tilt-Reihe und zum Erzeugen eines anfänglichen Bezugsmodell Verfolgen der kolloidalen Goldpartikeln in der Probe, die wiederum verwendet werden, um die endgültige Ausrichtung zu erzeugen. Die Genauigkeit dieser Bezugsmodell ist für die Qualität des rekonstruierten Tomogramms, so dass der Benutzer in der Lage, eine Sichtkontrolle des automatisch berechnet Bezugsmodell, bevor mit dem Wiederaufbau voran oder hinterher zu Tilt-Serie, die manuell bearbeitet werden sollten ist. Abbildung 5 zeigt zwei Kipp-Serie grob ausgerichtet sind und der ermittelte Bezugsmodell durch tomoauto generiert. 5A, C zeigen die ungekippten Bildern und sowohl in der Bezugs Modell korrekt mit Modellpunkte auf Bezugsmarkierungen zentriert ist. 5B, D zeigen die entsprechenden Tilt- Serie bei 50 Grad, und während das Modell in 5B in 5D aus ihren entsprechenden Goldmarker abgekommen und das Modell ist nicht geeignet für die Feinausrichtung. Dieser Fehler kann quantitativ als die mittlere Restfehler zwischen dem Mittelpunkt der Modellpunkt und dem wahrscheinlichen Mittelpunkt der Goldmarkierung gemessen werden und tomoauto können konfiguriert werden, um den Benutzer zu alarmieren, wenn die gemessene Fehler eine benutzerdefinierte Schwelle überschreitet Inspektion beschleunigen. Tilt-Serie, die unzureichend automatisch ausgerichtet werden kann dann manuell ausgerichtet werden. Wir finden, dass tomoauto erfolgreich ausrichtet rund 80% -90% der gesammelten Tilt-Serie (Movie 2).
Nach einer Tilt-Serie wurde erfolgreich ausgerichtet ist, muss es in die endgültige Schichtbild rekonstruiert werden. Tomoauto wurde so konzipiert, dass der Benutzer IMOD 13 nutzen oder tomo3d 26, um den endgültigen Rekonstruktion zu erzeugen. Verwenden wir derzeit tomo3d, die Vorteile der verschiedenen Funktionen in der modernen Multi-Core-Computereinheiten (CPUs), um die Wiederaufbauzeit erheblich reduzieren. Die endgültige Schichtbild wie in Figur 6 und Film 3 gezeigt ist ein 3-D Volumen der abzubildenden Probe, die dann für die Zellanmerkung durch Segmentierung oder Unter Tomogramm Lung zu höheren Auflösungsinformationen des molekularen Maschinen innerhalb der Probe erhalten werden kann. Unter Tomogramm Lung erhöht sowohl die SNR und verringert die durch die fehlende Keil durch Mittlung der Hochpegel von Rauschen in den einzelnen Schichtbilder und Verwenden der Vielzahl Teilschnittbilder in einem gut verteilten Satz von zufälligen Orientierungen bezüglich der erzeugte Artefakte fehlende Keil, um Artefakte zu begrenzen und zur Verbesserung der endgültigen Auflösung. Die 2.7nm Unter Tomogramm Durchschnitt des intakten S. flexneri T3SS ist in 7 gezeigt, wie in der EMDB (EMD-2667), der die große Verbesserung in der Lage mit dieser Technik zusammen zeigt abgelagertauf die Injektisoms in einem Tomogramm in 6B angezeigt mpared.
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Hochdurch Kryoelektronentomographie. Eine flüssige Suspension wird rasch auf eine EM Gitter und eine Reihe von Neigungsserie gefroren ist durch einen automatisierten computergesteuerten Elektronenmikroskops aufgefangen. Die resultierenden Mikroaufnahmen werden automatisch mit tomoauto um das Tomogramm zu erzeugen verarbeitet. Der letzte Schritt ist hier ein segmentierter S. flexneri Minizelle von einer Schichtaufnahme durch dieses Protokoll von Hu et al. 2015 15 erzeugt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 Flussdiagramm der tomoauto Prozess. Eine Aufteilung der tomoauto Workflow zeigt, wie Daten aus einer Sammlung von Dosis-fraktionierten mikroskopischen Aufnahmen den ganzen Weg bis zu einer endgültigen Unter Tomogramm durchschnittliche verarbeitet. Teilprozess Symbole detailliert die Aufgaben, die Koordinaten eingeben, indem Sie die entsprechende Software konfiguriert verarbeiten tomoauto. Datensymbole zeigen Ausgangs Allgemeinen nicht durch den Benutzer verwendet wird, während Dokument und Mehr Dokument Symbole zeigen die Ausgabe tatsächlich vom Benutzer gehandhabt. Schließlich Anzeigesymbole zeigen, wo Benutzereingriff im Workflow erfolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Batch-Tilt-Serie Erfassung mit SerialEM Navigator. Die Positionen der montage Karten werden als Bühnenpositionen gespeichert (dargestellt selection) in der auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt Navigator-Fenster-Liste, und der momentan geladenen Karte wird im Puffer-Fenster zusammen mit den ausgewählten Punkten numerisch mit einem roten Kreuz auf der Karte für den Erwerb hinzugefügt markiert angezeigt. Erfassungsstellen werden von Label im Navigator-Fenster aufgelistet und kann so eingestellt werden zu erwerben mit der "Tilt-Serie" Kontrollkästchen. Werden Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Einfluss der Bewegungskorrektur auf dosis fraktioniert Daten. (A) zeigt ein nicht geneigten und unkorrigierte mikroskopische Aufnahme, und die Bewegung korrigierte Bild (von MOTIONCORR verarbeitet) in (B) dargestellt ist, wird der Kontrast leicht nach der Korrektur verbessert. Verbesserung kann mehr offenbar, indem man die Fourier transf gesehen werdenorm der Mikroaufnahme vor (C) und nach (D) Bewegungskorrektur. Bild EH die gleichen Informationen, jedoch mit einer Mikroaufnahme bei 60 Grad, in dem der Kontrast vermindert und Thon Ringe C und D ersichtlich geneigt sind nicht mehr bei hohen Neigungs sichtbar. Maßstabsleiste 250 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Gute und schlechte Ergebnisse tomoauto automatisierten Tilt-Serie Ausrichtung. (A) Ein ungekippten grob ausgerichtet Schliffbild und die hergestellte automatisch mit tomoauto Bezugsmodell. (B) Die ermittelte Bezugsmodell bei 50 Grad Neigung. Das Modell passt immer noch gut und ist auf den entsprechenden Bezugsmarkierungen zentriert ist. (C, D) (A, B) jeweils in im eingerahmten Bereich gezoomt. Diese Kipp-Reihe wurde mit einer mittleren Restfehler von 1,06 Pixeln ausgerichtet sind (E) eine Mikrophotographie nicht geneigten und Bezugsmodell von einem anderen Neigungsserien und (F) der Reihe bei 50 Grad zu kippen.. Hier sehen wir, dass Modell hat den Überblick über mehrere Bezugsmarkierungen (rot) verloren und dies repräsentativ für eine schlechte automatische Tracking ist. (G, H) Zeigt das Modell in (E, F) jeweils in im eingerahmten Bereich gezoomt. Diese Neigung-Serie wurde mit einer mittleren Restfehler von 3,51 Pixel ausgerichtet und musste durch manuelle Ausrichtung der Reihe verarbeitet werden. (A) Maßstabsbalken 500 nm (C) Maßstabsbalken 50 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Figur.
![Figur 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Abbildung 6. Tomogramm erzeugt automatisch von tomoauto. (A) Das zeigt eine Projektion von sieben Scheiben von dem Zentrum der Rekonstruktion des Tilt-Serie in 4A dargestellt. Maßstabsleiste 250 nm. (B) eine im Hinblick auf den eingerahmten Bereich gezoomt in (A) ein intaktes Injektisoms. Maßstabsleiste 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Unter Tomogramm durchschnittlich intakt S. flexneri Typ-III-Sekretionssystem. (A) Zentral Scheibe der 2,7 nm Unter Tomogramm Durchschnitt des intakten S. flexneri T3SS von EMDB (EMD-2667). (B) Volle Projektion entlangdie X-Achse des Volumens. (C) Isofläche Wiedergabe der Lautstärke auf einem Kontur Schwelle 130 in IMOD angesehen. Maßstabsleiste 5 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: Animation, der nicht ausgerichteten Tilt-Serie (Rechtsklick zum Download). Diese Animation läuft durch die Tilt-Serie als ursprünglich von SerialEM gesammelt. Translationale Verschiebungen sind leicht durch die erratischen Pfad der einzelnen Bezugsmarkierungen von Bild zu Bild, und diese Verschiebungen mit weniger bemerkbar Mängel müssen vor dem Tilt-Serie rekonstruiert werden kann korrigiert werden identifiziert.
![Movie 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Movie 2: Animation, der ausgerichtet Tilt-Serie (Rechtsklick zum Download). Diese Animation läuft durch den gleichen Mikroaufnahmen in Film 1 nach der automatisierten Ausrichtung durch tomoauto angezeigt. Die sprunghafte Wege der Bezugsmarkierungen folgen nun eine glatte Trajektorie durch den Tilt-Serie und die Tilt-Achse vertikal in bezug auf den Betrachter ausgerichtet ist.
Movie 3:. Animation der rekonstruierten Tilt-Serie (Rechtsklick zum Download) Diese Animation läuft durch die in 6 erzeugt wird, nachdem automatisierten Rekonstruktion der Tilt-Serie in Movie 2 b angezeigt gezeigt Tomogrammy tomoauto.
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Discussion
Das hier beschriebene Verfahren mit hohem Durchsatz konnten wir 1917 Kryo-Tilt-Serie verarbeiten und produzieren über 4.500 Unterschichtaufnahmen des intakten S. flexneri Injektisoms 19. Die gesammelten Daten führten zur detaillierten Charakterisierung von in situ Injektisoms, einschließlich der zytoplasmatischen Sortierkomplexe. Das Verfahren wurde auch verwendet, um mehrere mutante Zellen mit spezifischen Deletion des mutmaßlichen Protein-Komponenten, erläutern die Zusammensetzung Verlesestand des Injektisoms half visualisieren. Unsere Methode bot neue Wege, um die Struktur-Funktions-Beziehung des Injektisoms untersuchen. Als Ergebnis wurde die neue Bühne für eine weitere Zergliederung der Mechanismen T3SS-vermittelte Sekretion und Pathogenese zugrunde liegenden gesetzt.
Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt Hochdurchsatz-Kryo-ET intakter S. flexneri, aber ist auf jedes Projekt geeignet für Kryo-ET. Dieses Verfahren wurde in der structu verwendetral Charakterisierung des Flagellenmotor von Borrelia burgdorferi 27, die Infektion von E. coli-Minizellen durch Bakteriophagen T7 28 und Chemo Arrays in E. coli 29. Durch die Erleichterung der Sammlung von massiven Datenmengen, ist es möglich, Mehrfachmutanten als auch Bild eine große Anzahl von Bedingungen, die Rückschlüsse von dynamischen Prozessen zu ermöglichen, wie beispielsweise Maschinenanordnung 27 und den Fortgang der Phageninfektion 28 screenen. Durch das Sammeln von mehreren Software-Pakete und damit für die volle Kontrolle über Verarbeitungsausführungs sind Anwender in der Lage, verschiedene Kombinationen von Paketen für optimale Ergebnisse anpassen. Chen et al. 21 bisher veröffentlichten ein ähnliches Protokoll beschreibt das Sammeln von Daten mit dem Softwarepaket Leginon 12 und die Automatisierung von Tilt-Serie Verarbeitung unter Verwendung IMOD 13 und RAPTOR 24. Das aktuelle Protokoll ergänzt diese Methode detailliert eine alternative Methode zur Zusammenarbeitllecting und Verarbeitung von Daten, während sich auch zeigen, wie viel die Technologie und das Verfahren fortgeschritten ist, durch die verstärkte Konzentration auf hochauflösenden durch Unter Tomogramm Lungs angetrieben wird, mit der Dosis-fraktionierten Daten, automatisierte CTF Schätzung und Korrektur und robuster automatisierte Ausrichtungsroutinen innerhalb IMOD 13. Während das vorherige Protokoll geht in visuelle Detail mit Schwerpunkt auf die Datenerfassung, konzentriert sich dieses Verfahren von den Details der Verarbeitung der gesammelten Daten.
Hochdurchsatz-Methoden erlauben für massive Datensammlung, die Verwendung von Mikroskop und Computer-Ressourcen zu maximieren, während die Begrenzung der Höhe der mühsame Bedienungsanleitung Interventionen, die sich das Projekt und als Flaschenhals zu verlangsamen. Die Wrapper-Bibliothek tomoauto wurde entwickelt, um vollständige Konfiguration aller in jedem Software-Paket auf eine einfache und zentralisierte Weise verwendeten Parameter zu ermöglichen. Sobald eine geeignete Konfiguration festgelegt wurde, dann ist es einfach, um die Einstellungen auf ganze d geltenataset. Ein Großteil der Tilt-Serie können mit akzeptablen Ergebnissen (4A) verarbeitet werden, während eine geringe Teilmenge erforderlich ist, um manuell bearbeitet werden. Diese Tilt-Serie sind in der Regel weniger ideal Akquisitionen durch übermäßige Bildverschiebung, schlechten Kontrast, oder ein Mangel an ausreichenden Bezugsmarkierungen, die die automatische Bezugsverfolgungsroutine verursacht zu scheitern (4B) geplagt. Um bestmögliche Schichtaufnahmen zu erhalten, muss eine umfassende Betreuung in jedem entscheidenden Schritt von der Probenvorbereitung, Bildaufnahme, Bildverarbeitung berücksichtigt werden.
Weitere Entwicklungen in Hochdurchsatz-Kryo-ET wie automatisierte Sub-Tomogramm Extraktion durch Schablonenanpassung und die Integration der modernen Unter Tomogramm Lungssoftwarepakete wie Dynamo in bestehende Workflow-Pipelines wie tomoauto werden derzeit untersucht. Die jüngste Einführung der neuen Generation direkten Erfassungseinrichtung Kameras hat wichtige Verbesserungen bei der Erhöhung Tilt-Serie SNR und damit mor gemachte konsistent CTF Bestimmung aufgrund der höheren Effizienz des Detektors. Der Einsatz neuer gold Gittertypen können Tilt-Serie Sammelfehler zu verringern, verbessern die Erfolgsrate für die automatisierte Tilt-Serie Verarbeitung und Rekonstruktion mit weniger manuelle Eingriffe 30. Schließlich mit der heute allgegenwärtigen Einsatz von Computer-Clustern und Grafikprozessoren (GPUs) zur Parallelisierung und Beschleunigung der großen Datenmenge Verarbeitung, Entwicklung von Rohrleitungen, die diese Systeme nutzen können, wird hoffentlich bald in der Lage, die Ausführungszeit von Tagen auf Stunden verkürzen, die Nutzer mit noch noch weniger Ausfallzeiten zwischen Experiment Design und sinnvolle Datenanalyse, während immer noch zunehmende Datenmenge Größe und das Erreichen einer hohen Auflösung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. William Margolin für Kommentare. Wir sind dankbar für die Unterstützung auf SerialEM aus Drs. David Mastronarde und Chen Xu. DM, BH und JL wurden von Grant R01AI087946 aus dem Nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, Grants R01GM110243 und R01GM107629 vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), und Grant AU-1714 von der Welch Foundation unterstützt. Die direkte Elektronendetektor wurde vom National Institutes of Health Award S10OD016279 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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