Summary
Vi præsenterer en protokol om, hvordan man udnytter high-throughput cryo-elektron tomografi til at bestemme høj opløsning in situ strukturer af molekylære maskiner. Protokollen tillader store mængder data, der skal behandles, undgår fælles flaskehalse og reducerer ressource nedetid, så brugeren kan fokusere på vigtige biologiske spørgsmål.
Introduction
Type III sekretionssystemer (T3SS) er vigtige virulensdeterminanter for mange Gram-negative patogener. Den injectisome, også kendt som nålen komplekset, er den centrale T3SS maskinen kræves til direkte translokation af effektorceller proteiner fra bakterien i eukaryote værtsceller 1, 2. Den injectisome omfatter et ekstracellulært nål, en basal krop, og et cytoplasmatisk kompleks også kendt som sortering komplekse 3. Tidligere undersøgelser har belyst 3-D strukturer af oprensede injectisomes fra Salmonella og Shigella, sammen med de atomare strukturer af store basale kropsproteiner 4, 5. Nylige in situ strukturer injectisomes fra Salmonella, Shigella og Yersinia blev afsløret ved cryo-ET 6 7. Men den cytoplasmatiske komplekse, afgørende for effektor udvælgelse og nåleaggregatet, er ikke blevet visualiseret i disse strukturer.
Cryo-ET er MOSt egnet teknik til billeddannelse molekylær maskiner på nanometer opløsning inden for sit oprindelige cellulære kontekst (in situ). Ikke desto mindre er den opnåelige beslutning cryo-ET begrænset af prøven tykkelse. For at overvinde den ulempe, vi afbildes intakte injectisomes i en virulent Shigella flexneri stamme, der var genetisk modificeret til at producere miniceller tynde nok til kryo-ET. En anden begrænsning ved kryo-ET er følsomheden af prøven for strålingen induceret af elektronstrålen, som meget hurtigt ødelægger information med høj opløsning i prøven. Som et resultat, er yderst lave doser anvendes til individuelle tilt-billeder, så en passende dosis kan fordeles blandt de full tilt-serien. Dette sænker signal-til-støj-forholdet (SNR) i den endelige genopbygning, hvilket gør det vanskeligt at skelne de strukturelle træk af emnet fra den store mængde af støj i tomogram og begrænser opløsning, der kan opnås ved fryselagring stærkt ET. ConventiOnal billedbehandling såsom Fourier og real-space-filtre samt ned prøvetagning kan bruges til at øge kontrasten, men på bekostning af bortfiltrere meget af oplysninger den høje opløsning. For nylig har sub-tomogram gennemsnitsberegning gjort det muligt i høj grad at øge SNR og efterfølgende den endelige opløsning i nogle tilfælde til sub-nanometer niveauerne 8, 9. En mere detaljeret analyse af komplekser er gjort mulig ved beregningsmæssigt udvinder tusindvis af sub-tomogrammer indeholder de områder af interesse fra de oprindelige tomogrammer og derefter tilpasse og gennemsnit sub-tomogrammer at bestemme in situ komplekse strukturer med højere SNR og højere opløsning. Disse metoder kan integreres med genetiske metoder til at opnå en endnu bedre indsigt i makromolekylære forsamlinger og deres dynamiske konformationer i den native cellulære kontekst.
Generelt skal gennemsnit for at bestemme høj snesevis eller endda hundredvis af tusinde sub-tomogrammer-Opløsning strukturer i stedet. Købet af et tilstrækkeligt antal tilt-serien er nødvendig for at producere denne store antal sub-tomogrammer hurtigt bliver en flaskehals. Den resulterende tilt-serien er ofte påvirket af stråle-induceret skift, scene slør, samt forstørrelse, rotation og skæve defekter, som skal løses for at bringe tilt-serien på linje forud for genopbygning. Tilt serien er typisk rettet ind ved at spore guld referencemærker markører, der traditionelt er valgt manuelt via inspektion af tilt-serien, der forårsager endnu en flaskehals. Mange softwarepakker er blevet udviklet til automatiseret tilt-serien erhvervelse gennem computerstyrede elektronmikroskoper 10, 11, 12, tilt-serien tilpasning og genopbygning 13, 14 og sub-tomogram gennemsnit 15-18. Da disse pakker håndtere diskrete operationer i arbejdsgangen af kryo-ET, bliver det ønskeligt at opbygge et højere abstraktionsniveau i processen til Systemamatisk strømline hele ordningen i en enkelt rørledning. Derfor har vi udviklet en software wrapper bibliotek "tomoauto" designet til at organisere en række af disse pakker i en enkelt halvautomatisk enhed, der giver mulighed for enkel brugerbetjening og samtidig opretholde fuld konfiguration af hver komponent i en centraliseret måde. Biblioteket er open source, veldokumenteret, løbende udviklet og frit tilgængelige til brug, skræddersyet udvikling eller yderligere integration ved hjælp af en online remote kildekode repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Denne high-throughput kryo-ET rørledningen er blevet anvendt til at visualisere intakte injectisomes i S. flexneri miniceller. I alt 1.917 tomogrammer blev genereret ved hjælp af denne metode, afslører en høj opløsning in situ struktur intakt maskine inklusive cytoplasmatiske sortering platform bestemt af sub-tomogram gennemsnit 19. Sammen med molekylær modellering af vildtype og mutant maskiner, vores high-throughput pipeline tilvejebringer en ny vej til at forstå strukturen og funktionen af det intakte injectisome i det native cellulære kontekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Minicell Forberedelse
- For at gøre S. flexneri miniceller, transformere 1 pi plasmid pBS58, som konstitutivt udtrykker Escherichia coli celledeling gener ftsQ, ftsA og ftsZ fra en lav-kopi spectinomycin-resistent plasmid i 5 pi elektrokompetente streptomycin-resistente serotype 5a (M90T-Sm) celler ved elektroporering ved 2,5 kV i 5 ms i 1 mm kuvetter.
- Opbevar minicelle prøver ved -80 ° C i 15% glycerol i en 1,5 ml mikrorør. Kryogen Når klar til brug, skrabe ca. 5 pi celler fra unthawed mikrorør ved hjælp af en pipettespids og suspenderer cellerne i 4 ml tryptisk bouillon med spectinomycin tilsat til 100 ug / ml koncentration. Grow O / N ved 37 ° C.
- Der afpipetteres 2 ml af kulturen fra 1,2 i 200 ml tryptisk bouillon med spectinomycin igen tilsat til 100 ug / ml koncentrationer. Vokse ved 37 ° C til sen log-fase.
- At berige miniceller, centrifuge200 ml af kulturen fra 1,3 ved 1000 x g i 5 min. Hæld forsigtigt supernatantfraktionen i et nyt centrifugerør og centrifugeres ved 20.000 xg i 10 min. Hæld forsigtigt fjernes og kasseres supernatantfraktionen og bland forsigtigt pelleten med den resterende væske ved hjælp af en pipettespids og overføre ca. 100 pi af pellet blandingen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
2. EM Grid Forberedelse
- Placer en R2 / 2 vandudtryk kulstof film 200-mesh kobber gitter kulstof opad på en glasplade.
BEMÆRK: A R2 / 2 200-mesh gitter er valgt for at maksimere antallet af tilt-serie, der kan indstilles til at erhverve et enkelt gitter firkant samtidig støtte prøven og placere kanten af carbonfilm på kameraet ved den ønskede forstørrelse. Finere mesh net og mindre huller forsynede carbon film såsom R12 / 1.3 400-mesh kan anvendes for prøver afbildes ved højere forstørrelse; Større huller forsynede carbon film såsom R3.5 / 1 200-mesh kan være brugd for prøver afbildet ved lavere forstørrelse, eller hvis mikrografiet ikke skal indeholde carbon kant og vandudtryk carbon film med større afstand, såsom R1 / 4 200 mesh kan anvendes til at hjælpe med at tilpasse scenen til området af interesse og beskytte områder fra overeksponering i fokusering og sporing rutiner. - Placer glider på platformen i en udledning glød enhed.
BEMÆRK: Vi anvender en in-house, i hvilken en anode og platformen er blevet bearbejdet i et vakuumtørreskab og er drevet af en højfrekvent generator. Efter oprettelse af en vakuum, fastgøre højfrekvensgeneratoren sonde til anoden og magt på sonden i 1 min til at gløde aflade nettet. Den nødvendige tid til at gløde decharge gitteret kan variere fra nogle få sekunder til et minut. Varierende udledning glød tid kan bruges til at diagnosticere problemer med prøven koncentration og gitre, der vises tørt med nogen glasagtige is. - Fjern nettet med et sæt af pincet, og lås tangen lukket med et elastisk bog.
- Tilføj 100 ul 10 nm kolloidt guld løsning på mikrocentrifugerør med miniceller udarbejdet i 1.4 og bland ved forsigtigt zappe røret med en finger. Med en ny pipette sted 4 pi af blandingen på nettet udarbejdet i 2.2.
BEMÆRK: kolloidt guld er tilgængelig i en række størrelser og skal sørges for, at størrelsen af guldet er større end 5 pixel givet pixelstørrelse Mikrografierne til behandling på den erhvervede forstørrelse, uden at være for stor til uklare funktioner af interesse. - Forbered springet-fryse apparat; fylde ydre kølecontaineren med flydende nitrogen og derefter udfylde det indre kammer med flydende ethan. Fastgør pincet med gitteret til stempelstangen og låse stempelstangen i den hævede stilling.
BEMÆRK: Se Iancu et al 20 for en protokol, der beskriver brugen af en kommerciel springet-fryse apparater.. - Dup gitteret ved forsigtigt at røre et stykke filtrerpapir til than falde af prøve, indtil menisken mellem net- og filter papir adskiller og fugtspredende på filtrerpapiret stopper, derefter straks udløse stempelstangen, frysning nettet. Fjern forsigtigt pincet fra stempelstangen og placere risten i et gitter holder.
- Forbered kryo-EM transfer station ved at udfylde lastefladen og absorption pumpe beholder med flydende nitrogen. Når lastning området er ved flydende nitrogens temperatur sted indehaveren nettet og et mikroskop eksemplar patron i læsning området.
- Fjern forsigtigt låsering, som er enten et lille gevind låsering på tidligere Polara mikroskoper eller en C-clip ring på senere modeller; placere EM gitter i patronen ved hjælp af pincet og derefter forsigtigt vedhæfte låseringen tilbage på patronen sikrer nettet.
- Fjern præparatholderen multipel fra mikroskopet og fastgør den til overførsel station. Placer prøven patronen ind i holderen ved hjælp af patron pincet end trække holderen fra lastning område og overføre præparatholderen multiple tilbage til mikroskopet.
BEMÆRK: Se Chen et al 21 for en visuel protokol detaljer 2,1-2,9..
3. Højkapacitetsforskning Automatiseret Tilt-serien Collection
- Indsamling af Maps Low-forstørrelse
- Åbn et nyt Navigator vinduet ved at klikke på 'Åbn' i "Navigator" menu af SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Find netkvadrater der indeholder acceptable imaging betingelser (dvs. tynd is, ingen forurening, emne af interesse) ved hjælp af fluorescerende skærm ved lav-forstørrelse (~ 2,300X for minicelle modellen).
BEMÆRK: [Valgfrit:. Dette trin kan automatiseres med SerialEM ved montaging hele nettet, men det kan være hurtigere at blot vælge et par områder manuelt] - Juster scenen til eucentric højde ved at vippe præparatholderen til 50 ° derefter justerez-højde indtil xy oversættelse af scenen er minimal mellem de vippes og vippede synspunkter.
- Flyt til midten af gitteret torv og klik på 'Læg Stage Pos' knappen i Navigator-vinduet for at gemme den nuværende fase position.
- Fortsæt trin 3.1.1-4 ovenfor, indtil alle acceptable netkvadrater fase positioner er blevet gemt.
- Åbn en ny montage MRC-fil ved at klikke på "Ny montage" i menuen 'Filer'. I Dialog Montage opsætning, der åbner, skal du vælge et antal stykker i X og Y, der vil erhverve hele gitter firkantet (fx 10 x 10 for en standard 200 mesh gitter). Brug en høj binning såsom 8 og vælg "Flyt Stage I stedet for Shifting Billede" og "Skip sammenhænge bruges til at tilpasse stykker 'radioknapper.
- I Navigator vinduet klikke på første etape position og sæt den skal erhverves ved at markere afkrydsningsfeltet 'Acquire ". Gentag dette for hver etape position i Navigator vinduet.
- Åbn Dialog Navigator Acquire ved at klikke på 'Acquire på point' i 'Navigator' i menuen. Kontroller 'Acquire kortbilledet' og afkrydsningsfeltet 'Rough eucentricity «, og sørg for, at alle andre afkrydsningsfelter er markeret. Klik på 'Fortsæt' for at indsamle en montage på hvert trin position.
- Tilt-serien Acquisition
- I Navigator vinduet vælge en af de tilkøbte kort og klik på knappen "Load kort«.
- I Navigator vinduet Klik på knappen 'Points Tilføj', og vælg punkter i kortet ved at erhverve en tilt-serie. Klik derefter på "Stop Tilføjelse Points 'knappen. Gentag for hvert kort indsamlet.
- I menuen Kamera vælg 'Parametre' og definere parametrene for Focus, Trial, og Record tilstande. [Valgfrit:. Dosis-fraktioneret data kan angives i parametre for Record mode]
- Vælg et punkt i Navigator vinduet og tjek den "Tilt-serien9; afkrydsningsfeltet. I Tilt-serien dialogboksen Setup vindue, der åbnes vælger de parametre, der ønskes for tilt-serien kollektion. Gentag for resten af de udvalgte punkter i Navigator-vinduet, men ikke vælger kortene.
- I menuen Navigator igen vælge 'Acquire på point'. I Navigator Acquire dialogen vælg 'Juster punkt «, Autofokus" og "Rough eucentricity" som Foreløbige opgaver, og vælg' Acquire tilt-serie "som den primære opgave, og vælg 'Luk kolonne ventiler i slutningen' for at lukke kolonnen, når alle af punkterne er blevet indsamlet. Ved fortsætter en tilt-serien vil blive indsamlet på hvert punkt på hvert kort.
4. Højkapacitetsforskning Automatiseret Tilt-serien Forarbejdning og genopbygning Brug Tomoauto
- Korrektion af Beam-induceret Motion i Dosis-fraktioneret oplysninger [frivilligt]
BEMÆRK: Tomoauto bruger MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) for at fjerne stråle-induceret bevægelse fra dosis-fraktioneret mikrofotografier. NOTIONCORR 16 skal være installeret på systemet.- Med den originale tilt-serie, output log fra SerialEM 10 og de individuelle dosis-fraktioneret billeder alle i den aktuelle arbejdsmappe, i en terminal udføre kommandoen:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> er navnet på tilt-serien til at behandle.
- Med den originale tilt-serie, output log fra SerialEM 10 og de individuelle dosis-fraktioneret billeder alle i den aktuelle arbejdsmappe, i en terminal udføre kommandoen:
- Tilpasning og genopbygning af Tilt-serien
BEMÆRK: Tomoauto som standard bruger israelske forsvarsminister 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) til at håndtere tilt-serien automatiseret fiducial model generation, tilpasning, bestemmelse af kontrasten overføringsfunktion (CTF), CTF-korrektion 23, og rekonstruktion. Alternativt brugere har mulighed i tomoauto at bruge RAPTOR 24 (inkluderet i israelske forsvarsminister) til automatiseret fiducial model generation, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) for at bestemme CTF, og tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) til genopbygning eller i en kombination af software-pakker, som konfiguration. Denne konfiguration samt parametrene tilgængelige i hver pakke varetages af en global konfigurationsfil, der kan redigeres til at passe de værdier mest anvendte i et laboratorium, mens kan også oprettes lokale konfigurationsfiler til detaljer parametre, der anvendes til en bestemt prøve, indsamling indstille eller individuel tilt-serien. Alle pakker, der ønsker at blive, skal være installeret på systemet.- Med tilt-serie i den aktuelle arbejdsmappe, i en terminal udføre kommandoen
tomoauto --CTF --mode = align <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> er tilt-serien, der skal behandles, og <fid_diam> er Diameter af de referencemærker markører i nanometer. Denne kommando vil tilpasse og automatisk estimere CTF af tilt-serien. Det er muligt at springe CTF behandling ved at fjerne --CTF mulighed fra kommandoen. - Undersøg justeret tilt-serien visuelt for eventuelle grelle fejl i behandlingen tilpasning og inspicere den anslåede CTF ved at udføre kommandoerne:
3dmod <filnavn> .ali
submfg <filnavn> _ctfplotter.com
henholdsvis, hvor <filnavn> er navnet på tilt-serien uden endelse. Også kontrollere produktionen af tomoauto kommandoen for at se den gennemsnitlige resterende fejl genereret af tilpasningen, som er en kvantitativ statistik af tilpasning kvalitet. - Givet en acceptabel tilpasning fortsætte behandlingen ved at udføre kommandoen:
tomoautil --CTF --mode = rekonstruere <filename.st> <fid_diam>
med de samme brugerrettigheder udskiftninger som i 4.2.1. Denne kommando vil rette CTF, slette de referencemærker markører fra tilt-serien og beregne genopbygning. Igen CTF behandling kan springes som i 4.2.1. - [valgfrit] For at springe den visuelle trin inspektion og fuldt automatisere behandlingen og genopbygning udføre kommandoen
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [valgfrit] Hvis du vil bruge en bestemt lokal konfiguration, henvises til tomoauto dokumentation om hvordan man kan generere en lokal konfigurationsfil, og derefter udføre kommandoen
tomoauto [indstillinger] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
hvor <local_config> er navnet på den lokale configuration fil.
- Med tilt-serie i den aktuelle arbejdsmappe, i en terminal udføre kommandoen
5. Sub-tomogram Gennemsnitsberegnings
BEMÆRK: Vi bruger i3 pakke 15 (http://www.electrontomography.org/) til at behandle sub-tomogram gennemsnitsperioder eksperimenter, men beskrev protokollen gælder generelt for de fleste tilgængelige sub-tomogram gennemsnit software packages16to proces sub-tomogram gennemsnitsperioder eksperimenter, men protokollen beskrevet gælder generelt for de fleste tilgængelige sub-tomogram gennemsnitsberegning softwarepakker 16-18.
- Med den rekonstruerede tomogram i den aktuelle arbejdsmappe åbne tomogram for partikel plukning ved at udføre kommandoen:
tomopick <filnavn> .rec
hvor <filnavn> er som i 4.2.2. I det vindue, der åbnes bruge venstre museknap til at klikke på først den basale kroppen og derefter nålespidsen at vælge en injectisome og bruge pil op og pil-tasterne til at riff gennem skiver af tomogram. Vælg alle synlige injectisomes på denne måde. Dette gemmer koordinaterne i en tekstfil definerer den lange akse af strukturen samt estimerer to af de tre Euler vinkler beskriver orienteringen af strukturen. - Beregningsmæssigt ekstrakt 400 3 voxel terninger fra tomogram centreret ved midtpunktet af den definerede lange akse ved at udføre kommandoen:
clip resize Cx <x> -CY <y> -CZ <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<filnavn> .rec <filnavn> _001.mrc
hvor <x>, <y>, <z> er de midtpunktet koordinater for strukturen og <filnavn> er som i 4.2.2. Størrelsen af den ekstraherede terningen bør variere med strukturen og forstørrelse anvendes, og skal være stort nok til en tilstrækkelig omslutte strukturen af interesse, som for denne prøve er 400 3 voxels. - Down-prøve (bin) sub-tomogram med en faktor fire for at reducere beregningstiden til indledende tilpasning ved at udføre kommandoen:
binvol -b 4 <filnavn> _001.mrc <filnavn> _001.bin4.mrc
hvor <filnavn> er som i 5.2. - Påfør bestemt Euler vinkler til sub-tomogrammer og beregne det globale gennemsnit at producere den oprindelige skabelon ved at afvikle kommandoen.
I3totsum.sh - Juster og klassificere sub-tomogrammer ned-stikprøven ved hjælp af en binær klassifikation maske af det cytoplasmatiske område. Udfør sub-tomogram gennemsnit i Fourier plads til at minimere de manglende kile artefakter karakteristiske for tomografi. Til binning 4 data, skal du bruge SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Gentag trin 5.5 ved hjælp af sub-tomogrammer ned-samplet med en faktor to (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") og en gang mere med de oprindelige data (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøver af miniceller S. flexneri blev indsamlet og behandlet som vist i den skematiske figur 1 under anvendelse af tomoauto følge rørledningen vist detaljeret i figur 2. Tilt-serien blev indsamlet ved hjælp af SerialEM 10, som giver mulighed for high-throughput tilt-serien erhvervelse ved punkter, der er udpeget af brugeren på lav-forstørrelse montage kort (figur 3). Mikrografer blev opsamlet under anvendelse af dosis-fraktionering tilstand på en direkte-detekteringsindretning kameraet for at reducere stråle-induceret bevægelse 22 (figur 4). Tomoauto koordinerer bevægelse korrektion tager en samling af dosis-fraktioneret mikrografier forarbejder hver med MOTIONCORR 22 og samler resultaterne i en tilt-serie, der skal bearbejdes (Movie 1) yderligere.
Den mest generelle anvendelse af tomoauto er automac tilpasning af en indledende tilt-serien. Tomoauto komponerer sekventiel udførelse af de nødvendige kommandoer i israelske forsvarsminister 13 til groft justere tilt-serien og generere en indledende fiducial model spore kolloide guldpartikler i prøven, som igen bruges til at generere den endelige tilpasning. Er Nøjagtigheden af denne fiducial model afgørende for kvaliteten af det rekonstruerede tomogram, og så brugeren er i stand til visuelt at inspicere automatisk beregnede fiducial model før du fortsætter med genopbygning eller bagefter for at identificere tilt-serie, der skal behandles manuelt. Figur 5 viser to tilt-serien groft alliancefrie og beslutsom fiducial model genereret af tomoauto. 5A, C viser de vippede billeder og i både den fiducial model er korrekt med model point centreret om referencemærker markører. Figurerne 5B, D viser den tilsvarende tilt- serien ved 50 grader og mens modellen i figur 5B figur 5D overtrådt fra deres tilsvarende guld markører og modellen er ikke egnet til finjustering. Kan måles denne fejl kvantitativt som den gennemsnitlige resterende fejl mellem midten af modellen punktet og den sandsynlige midten af guld markering, og tomoauto kan konfigureres til at advare brugeren, når den målte fejl overskrider en brugerdefineret tærskelværdi for at fremskynde inspektion. Tilt-serie, der ikke er tilstrækkeligt justeret automatisk kan derefter tilpasses manuelt. Vi finder, at tomoauto held bringer omkring 80% -90% af vores indsamlede tilt-serien (Film 2).
Efter en tilt-serien har været en succes på linje, skal det rekonstrueres i den endelige tomogram. Tomoauto er designet, så brugeren kan anvende israelske forsvarsminister 13 eller tomo3d 26 for at generere den endelige rekonstruktion. Vi har i øjeblikket bruger tomo3d at drage fordel af en række funktioner i moderne multi-core computer behandlingsenheder (CPU'er) i høj grad at reducere genopbygningen tid. Den endelige tomogram som vist i figur 6 og film 3 er en 3-D volumen af afbildes prøven, som derefter kan anvendes til cellulære annotation ved deling eller sub-tomogram gennemsnit at opnå højere information af molekylære maskineri i prøven opløsning. Sub-tomogram gennemsnitsperioder øger både SNR og nedsætter artefakter produceret af den manglende-kile af gennemsnittet af de høje støjniveauer i individuelle tomogrammer og udnytte det store antal sub-tomogrammer i et godt fordelt sæt af tilfældige orienteringer i forhold til mangler kile til at begrænse artefakter og forbedre den endelige opløsning. Den 2.7nm sub-tomogram gennemsnit af den intakte S. flexneri T3SS er vist i figur 7 som deponeret i EMDB (EMD-2667), som viser den store forbedring i stand med denne teknik compared til injectisome vises i en enkelt tomogram i figur 6B.
Figur 1. Skematisk oversigt over high-throughput cryo-elektron tomografi. En flydende suspension fryses hurtigt på en EM gitter og et sæt af tilt-serien indsamles af en automatiseret computerstyret elektronmikroskop. De resulterende mikrografier behandles automatisk ved hjælp tomoauto at generere tomogram. Det sidste trin her er en segmenteret S. flexneri minicelle fra en tomogram genereret af denne protokol fra Hu et al. 2015 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Flowchart af tomoauto proces. En opdeling af tomoauto workflow viser, hvordan data behandles fra en samling af dosis-fraktioneret mikrografier hele vejen til en endelig sub-tomogram gennemsnit. Sub-proces symboler detaljeret redegørelse for de opgaver, der tomoauto koordinater til at behandle input ved at køre den konfigurerede passende software. Datasymboler viser output generelt ikke anvendes af brugeren, mens dokumentet og multi-dokument symboler viser outputtet faktisk håndteres af brugeren. Endelig vise symboler viser, hvor brugerindgreb forekommer i arbejdsgangen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Batch tilt-serien erhvervelse med SerialEM Navigator. Positioner montage kort er gemt som fase positioner (vist selectipå) i Navigator-vinduet listen på venstre side af skærmen, og den aktuelt indlæste kortet vises i bufferen vinduet sammen med de valgte punkter mærket numerisk med et rødt kryds tilføjet til kortet for erhvervelsen. Erhvervelse punkter er opført efter mærke i Navigator-vinduet og kan indstilles til at erhverve ved brug af afkrydsningsfeltet "Tilt-serien". Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Effekt af motion-korrektion på dosis-fraktioneret data. (A) viser en vippede og ukorrigeret mikrograf, og motion-korrigerede billede (behandles af MOTIONCORR) er vist i (B), er kontrasten en smule forbedret efter korrektion. Forbedring kan ses mere tilsyneladende ved at se på Fourier transform af mikrografiet før (C) og efter (D) motion korrektion. Billeder EH viser den samme information, men med en mikrograf vippes ved 60 grader, hvor kontrasten mindskes og Thon ringe synlige i C og D ikke længere er synlige ved høj hældning. Scale bar 250 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Gode og dårlige resultater af tomoauto automatiseret tilt-serien tilpasning. (A) En vippede groft justeret mikrograf og fiducial model produceres automatisk ved hjælp af tomoauto. (B) Den bestemte fiducial model på 50 grader hældning. Modellen stadig passer godt og er centreret om de passende referencemærker markører. (C, D) (A, B) henholdsvis zoomet ind på det indrammede område. Denne tilt-serien blev rettet ind med en gennemsnitlig resterende fejl på 1,06 pixels. (E) En vippede mikrograf og fiducial model fra en anden tilt-serien og (F) serien ved 50 grader hældning. Her ser vi, at modellen har mistet overblikket over flere referencemærker markører (vist med rødt), og dette er repræsentant for en dårlig automatiseret sporing. (G, H) Viser modellen i (E, F) henholdsvis zoomet ind på det indrammede område. Denne tilt-serien blev rettet ind med en gennemsnitlig resterende fejl af 3,51 pixels og måtte behandles af manuel justering af serien. (A) Målestok 500 nm (C) Målestok 50 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
![Figur 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figur 6. tomogram genereres automatisk af tomoauto. (A) Dette viser en fremskrivning af syv skiver fra midten af genopbygningen af tilt-serien vises i figur 4A. Scale bar 250 nm. (B) A zoomet i betragtning af den indrammede areal i (A) viser en intakt injectisome. Skala bar 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Sub-tomogram gennemsnit af intakt S. flexneri type III sekretion system. (A) Central skive 2,7 nm sub-tomogram gennemsnit af intakte S. flexneri T3SS fra EMDB (EMD-2667). (B) Fuld projektion sammenX-aksen af volumenet. (C) Isosurface præstationen af volumen ses ved en kontur tærskel på 130 i israelske forsvarsminister. Scale bar 5 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: Animation af unaligned tilt-serien (Højreklik for at downloade). Denne animation løber gennem tilt-serien som oprindeligt indsamlet af SerialEM. Translationelle skift let identificeres af uberegnelige vej individuelle referencemærker markører fra billede til billede, og disse skift sammen med mindre synlige defekter skal korrigeres før tilt-serien kan rekonstrueres.
![Movie 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Film 2: Animation af linie tilt-serien (Højreklik for at downloade). Denne animation løber gennem de samme mikrografer vises i Movie 1 efter automatiseret justering af tomoauto. De uregelmæssige stier af referencemærker markører følger nu en glat bane gennem tilt-serien, og tilt-aksen er justeret lodret i forhold til beskueren.
Film 3:. Animation af rekonstrueret tilt-serien (Højreklik for at downloade) Denne animation løber gennem tomogram vist i figur 6 genereret efter automatiseret rekonstruktion af tilt-serien vises i Movie 2 by tomoauto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne high-throughput metode muligt for os at behandle 1917 kryo tilt-serier og producerer over 4.500 sub-tomogrammer af den intakte S. flexneri injectisome 19. De indsamlede data førte til detaljeret karakterisering af in situ injectisome, herunder den cytoplasmatiske sortering kompleks. Metoden blev også anvendt til at visualisere flere mutantceller specifikke deletion af formodede proteinkomponenter, som hjalp belyse sammensætningen af sorteringsanlægget platform injectisome. Vores metode forudsat nye veje til at undersøge strukturen-funktionen forholdet mellem injectisome. Som følge heraf blev den nye lagt op til yderligere dissektion af de underliggende mekanismer T3SS-medieret sekretion og patogenese.
Protokollen præsenteres her beskriver high-throughput kryo-ET af intakt S. flexneri, men er gældende for ethvert projekt, der er egnet til kryo-ET. Denne metode er blevet anvendt i struktral karakterisering af flagellært motor Borrelia burgdorferi 27, infektion af E. coli miniceller af bakteriofag T7 28, og kemoreceptorernes arrays i E. coli 29. Ved at lette indsamlingen af store datamængder, er det muligt at screene flere mutanter samt billede en lang række betingelser, der tillader slutninger af dynamiske processer såsom maskine samling 27 og forløbet af faginfektion 28. Ved at samle flere softwarepakker og giver mulighed for fuld kontrol over udførelse behandling, brugerne er i stand til at tilpasse forskellige kombinationer af pakker til optimale resultater. Chen et al. 21 tidligere udgivet en tilsvarende protokol beskriver indsamling af data ved hjælp af softwarepakken Leginon 12 og automatisere tilt-serien behandling ved hjælp af israelske forsvarsminister 13 og RAPTOR 24. Den nuværende protokol supplerer denne metode beskriver en alternativ metode til at samarbejdellecting og databehandling og samtidig viser, hvor meget teknologi og proceduren har avancerede, drevet af det øgede fokus på høj opløsning gennem sub-tomogram gennemsnitsberegning, med dosis-fraktioneret data, automatiseret CTF estimering og korrektion, og mere robuste automatiserede alignment rutiner inden israelske forsvarsminister 13. Mens den foregående protokol går i visuelle detaljer med vægt på dataindsamling, denne metode fokuserer på detaljerne i behandlingen af indsamlede data.
High-throughput metoder giver mulighed for massiv indsamling af data, der maksimerer brugen af mikroskop og computer ressourcer, mens begrænse mængden af kedelige brugermanual interventioner, bremse projektet og fungere som en væsentlig flaskehals. Den wrapper bibliotek tomoauto er designet til at tillade fuld konfiguration af alle parametre, der anvendes i hvert softwarepakke på en enkel og centraliseret måde. Når en passende konfiguration er blevet bestemt, er det så let at anvende indstillingerne til hele dataset. Et flertal af tilt-serien kan behandles med acceptable resultater (figur 4A), mens en mindre delmængde er nødvendig for at blive behandlet manuelt. Disse tilt-serien er normalt mindre ideelle opkøb plaget af overdreven billede skift, dårlig kontrast, eller mangel på tilstrækkelige referencemærker markører, som bevirker, at automatiserede fiducial sporing rutine til at mislykkes (figur 4B). For at opnå de bedst mulige tomogrammer skal omfattende pleje skal træffes på hvert afgørende skridt fra prøveforberedelse, billedoptagelse, til billedbehandling.
Yderligere udvikling i high-throughput kryo-ET såsom automatiserede sub-tomogram ekstraktion med skabelon matching og integration af moderne sub-tomogram gennemsnitsberegning softwarepakker såsom Dynamo i eksisterende workflow rørledninger som tomoauto bliver nu undersøgt. Den seneste fremkomsten af nye generation direkte detektionsindretning kameraer har gjort store forbedringer i stigende tilt-serien SNR og muliggør more konsekvent CTF bestemmelse på grund af den højere effektivitet af detektoren. Anvendelsen af nye fuld guld grid-typer kan nedsætte tilt-serien indsamling defekter, forbedre succesraten for automatiseret tilt-serien forarbejdning og genopbygning med mindre behov for manuel indgriben 30. Endelig med den nu allestedsnærværende brug af edb-klynger og grafiske (GPU'er) til parallelize og fremskynde store datasæt behandling, udvikling af rørledninger, der kan udnytte disse systemer vil snart forhåbentlig være i stand til at forkorte gennemførelsestid fra dage til timer, der giver brugerne stadig endnu mindre nedetid i mellem eksperiment design og meningsfuld dataanalyse, mens du stadig stigende datasæt størrelse og opnå højere opløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. William Margolin for kommentarer. Vi er taknemmelige for den støtte på SerialEM fra Drs. David Mastronarde og Chen Xu. DM, BH og JL blev støttet af Grant R01AI087946 fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme, Grants R01GM110243 og R01GM107629 fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), og Grant AU-1714 fra Welch Foundation. Den direkte elektron detektor blev finansieret af National Institutes of Health Award S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
