Summary
Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.
Introduction
Tipo III sistemas de secreção (T3SS) são determinantes de virulência essenciais para muitos patógenos gram-negativas. O injectisome, também conhecido como o complexo de agulha, é a máquina central de T3SS necessária para a translocação directa de proteínas efectoras a partir da bactéria em células hospedeiras eucarióticas 1, 2. A injectisome compreende uma agulha extracelular, uma basal do corpo, e um complexo citoplasmático também conhecida como o complexo de triagem 3. Estudos anteriores elucidado estruturas 3-D de injectisomes purificadas de Salmonella e Shigella, juntamente com as estruturas atômicas de grandes proteínas do corpo basais 4, 5. Recentes em estruturas in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella, e Yersinia foram revelados por crio-ET 6 , 7. No entanto, o complexo citoplasmático, essencial para a selecção efectora e conjunto de agulha, não foi visualizado nessas estruturas.
Cryo-ET é o most técnica adequada para a imagiologia maquinaria molecular na resolução nanometros no seu contexto celular natural (in situ). No entanto, a resolução alcançável por crio-ET é limitado pela espessura da amostra. Para superar o problema, nós fotografada injectisomes intactas em um Shigella flexneri estirpe virulenta que foi geneticamente modificada para produzir minic�ulas finas o suficiente para crio-ET. Outra limitação de crio-ET representa a sensibilidade da amostra para a radiação induzida pelo feixe de electrões, que destrói muito rapidamente a informação de alta resolução na amostra. Como resultado, doses extremamente baixas são utilizados para a inclinação-imagens individuais de modo a que uma dose adequada pode ser distribuído entre a série completa de inclinação. Isto reduz grandemente a proporção de sinal-para-ruído (SNR) na reconstrução final, o que o torna difícil de diferenciar as características estruturais de objecto a partir da grande quantidade de ruído na tomografia e que limita a resolução pode ser conseguida por cryo- ET. Conventional de processamento de imagem tais como Fourier e filtros no espaço real, bem como para baixo de amostragem pode ser utilizado para aumentar o contraste, mas à custa de filtrar a maior parte da informação de alta-resolução. Recentemente, sub-Tomogram média tornou possível aumentar grandemente o SNR e, subsequentemente, a solução final em alguns casos, para níveis sub-nanômetros 8, 9. Uma análise mais detalhada de complexos é possível graças computacionalmente extrair milhares de sub-tomogramas contendo as áreas de interesse dos tomograms originais e, em seguida, alinhando e em média os sub-tomograms para determinar em estruturas complexas in situ com maior SNR e maior resolução. Estes métodos podem ser integrados com abordagens genéticas para fornecer ainda maiores insights sobre montagens macromoleculares e suas conformações dinâmicas no contexto celular nativa.
Em geral, dezenas ou mesmo centenas de milhar de sub-tomogramas precisa ser calculada a média, a fim de determinar alta-Resolução estruturas in situ. A aquisição de um número suficiente de inclinação-série necessária para produzir este grande número de sub-tomogramas rapidamente se torna um gargalo. A série de inclinação resultante são frequentemente afectados pela mudança induzida por feixe, fase folga, bem como ampliação, rotação e defeitos de inclinação, o que deve ser resolvido para trazer a inclinação-alinhamento em série antes da reconstrução. A série de inclinação é tipicamente alinhados por rastreamento marcadores fiduciais de ouro, que tradicionalmente são selecionados manualmente através de inspeção da série tilt, causando ainda um outro gargalo. Muitos pacotes de software têm sido desenvolvidos para aquisição tilt-série automatizada através controlados por computador microscópios eletrônicos de 10, 11, 12, alinhamento tilt-série e reconstrução 13, 14 e sub-tomogram média de 15-18. Como lidar com estes pacotes operações discretas no fluxo de trabalho de crio-ET, torna-se desejável para construir um nível maior de abstração no processo para systematicamente agilizar todo o esquema em um único pipeline. Por isso, desenvolvemos uma biblioteca wrapper software "tomoauto" projetado para organizar um número destes pacotes em uma única unidade semi-automatizado, permitindo a operação de usuário simples, mantendo a configuração completa de cada componente de forma centralizada. A biblioteca é open-source, bem documentado, continuamente desenvolvido e disponível gratuitamente para uso, desenvolvimento adaptado ou uma maior integração por meio de uma linha fonte remota de código repositório (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Este high-throughput crio-ET oleoduto tem sido utilizada para visualizar injectisomes intactos Em S. minic�ulas flexneri. Um total de 1,917 tomogramas foram gerados utilizando este método, revelando uma alta resolução em estrutura situ da máquina intacto, incluindo a plataforma de triagem citoplasmática determinado pelo sub-Tomogram média de 19. Juntamente com modelação molecular de tipo selvagem e mutant máquinas, a tubagem de alto rendimento fornece um novo caminho para compreender a estrutura e função da injectisome intacta no contexto celular nativo.
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Protocol
1. Preparação Minicell
- Para fazer com que S. minic�ulas flexneri, transformar 1 ml de plasmídeo pBS58, o que expressa constitutivamente genes divisão celular Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ a partir de um baixo-cópia espectinomicina resistente plasmídeo em 5 jul electrocompetentes Estreptomicina resistente 5a sorotipo (M90T-Sm) células por eletroporação a 2,5 kV para 5 ms em cuvetes de 1 mm.
- Armazenar minic�ula amostras a -80 ° C em glicerol a 15% em 1,5 ml de um microtubo criogénico. Quando pronto para uso, raspar aproximadamente 5 jul de células a partir do microtubo unthawed utilizando uma ponta de pipeta e suspender as células em 4 ml de caldo de soja tríptico com espectinomicina adicionado a 100 ug / ml de concentração. Cresça O / N a 37 ° C.
- Pipetar 2 ml da cultura de caldo de soja 1.2 em 200 ml tríptico com espectinomicina novamente adicionados a concentrações de 100 ug / ml. Crescer a 37 ° C até à fase log tardia.
- Para enriquecer minic�ulas, centrífuga200 ml da cultura a partir de 1,3 a 1000 xg durante 5 min. Verter cuidadosamente a fracção de sobrenadante para um novo tubo de centrífuga e centrifuga-se a 20.000 xg durante 10 min. Verter cuidadosamente e descartar a fracção de sobrenadante, e agitar suavemente o sedimento com o líquido remanescente utilizando uma ponta de pipeta e transferir cerca de 100 uL da mistura de sedimento para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. EM grade Preparação
- Coloque um lado filme de carbono de 200 mesh malha de cobre de carbono R2 / 2 holey-se em uma lâmina de vidro.
NOTA: A / 2 grade de malha 200 R2 é seleccionado para maximizar o número de inclinação da série que pode ser configurado para adquirir num quadrado de grade, enquanto ainda apoiar o espécime e colocando o bordo do filme de carbono no campo da câmara com a ampliação desejada. Redes de malha mais fina e mais pequenos filmes de carbono, tais como furados R1.2 / 1.3 400 de malha podem ser usados para amostras fotografado de maior ampliação; maiores filmes de carbono holey como R3.5 / 1 200-mesh podem ser utilizadosd para amostras fotografada com menor ampliação ou se a micrografia não deve conter a borda de carbono e filmes furados de carbono com um espaçamento maior, tal como R 1/4 de malha 200 pode ser utilizada para auxiliar no alinhamento do palco para a área de interesse e proteger as áreas de sobre-exposição em foco e monitoramento rotinas. - Coloque o slide na plataforma em um dispositivo de descarga luminescente.
NOTA: Usamos um dispositivo interno no qual um ânodo e plataforma foi maquinada num exsicador de vácuo e é alimentado por um gerador de alta frequência. Depois de criar um vácuo, anexar a sonda gerador de alta frequência para o ânodo e ligue a sonda de 1 min a brilhar descarregar a grade. O tempo necessário para a descarga luminescente da grelha pode variar de alguns segundos a um minuto. Variando o tempo de descarga luminescente pode ser utilizado para diagnosticar problemas com a concentração de amostra e grades que aparecem com gelo seco vítreo. - Retire a grelha com um conjunto de pinças, e travar as pinças fechado com um elástico be.
- Adicionar 100 ul de 10 nm solução coloidal de ouro para o tubo de microcentrífuga com as minic�ulas preparadas em 1.4 e misture suavemente flicking o tubo com um dedo. Com um novo lugar pipeta 4 ul da mistura da grelha preparado em 2.2.
NOTA: O ouro coloidal está disponível numa variedade de tamanhos e deve ser tomado cuidado de que o tamanho do ouro é maior do que 5 pixels determinado o tamanho do pixel de as micrografias a serem processados com a ampliação adquirida, apesar de não ser demasiado grande para características obscuras de interesse. - Prepara-se o aparelho de êmbolo mergulhador de congelamento; encher o recipiente de congelamento exterior com nitrogênio líquido e, em seguida, encher a câmara interna com etano líquido. Fixar a pinça com a rede à haste de êmbolo e bloquear a haste do êmbolo para a posição elevada.
NOTA: Ver lancu et al 20 para um protocolo descrevendo o uso de um aparelho de imersão por congelação comerciais.. - Blot a grade cuidadosamente tocando numa peça de papel de filtro para tele gota de amostra até o menisco entre a grade e de papel de filtro se separa e a absorção no papel de filtro pára, em seguida, libertar imediatamente a haste de êmbolo, o congelamento da grade. Cuidadosamente remover a pinça a partir da haste do êmbolo e colocar a grelha para um suporte de grelha.
- Prepare a estação de transferência de crio-EM, enchendo o recipiente bomba área de carga e absorção com nitrogênio líquido. Uma vez que a área de carga é a temperatura do azoto líquido lugar o suporte da grelha e um cartucho de espécime microscópio na zona de carga.
- Retire cuidadosamente o anel de bloqueio, isto é, um pequeno anel de fecho roscado em microscópios Polara anteriores ou um anel de clip-estilo C em modelos posteriores; coloque a grelha EM dentro do cartucho usando uma pinça e volte suavemente o anel de trava de volta para o cartucho de garantir a grade.
- Remova o suporte de amostra múltipla do microscópio e anexá-lo para a estação de transferência. Coloque o cartucho de amostra no suporte usando uma pinça de cartucho de umd retrair o suporte da área de carga e transferir o suporte de amostra múltipla de volta para o microscópio.
NOTA: Ver Chen et al 21 para um protocolo visuais detalhando 2,1-2,9..
3. alta taxa de transferência Collection-série Tilt automatizada
- Coleção de baixa ampliação Mapas
- Abra uma nova janela Navigator, clicando em 'Abrir' no menu 'Navigator' de SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Encontre quadrículas que contêm as condições de obtenção de imagens aceitáveis (isto é, gelo fino, sem contaminação, assunto de interesse) utilizando a tela fluorescente em baixa ampliação (~ 2,300X para o espécime minic�ula).
NOTA: [Opcional:. Este passo pode ser automatizado com SerialEM por montaging toda a grade, no entanto, pode ser mais rápido do que simplesmente selecionar algumas áreas manualmente] - Ajuste o estágio de altura eucentric inclinando o suporte da amostra a 50 ° e ajustez-altura até que a tradução xy do palco é mínima entre os pontos de vista inclinados e não inclinado.
- Mover-se para o centro da praça grade e clique no botão "Adicionar Stage Pos 'na janela Navegador para armazenar a posição atual estágio.
- Continue passos 3.1.1-4 acima até todas as posições de estágio quadrículas aceitáveis foram salvas.
- Abra um novo arquivo de montagem MRC, clicando em 'New montage' no menu 'File'. No Setup Montagem de diálogo que se abre, selecione um número de peças em X e Y que irá adquirir a totalidade do quadrado da grade (por exemplo, 10 x 10 para uma grade de malha 200 standard). Use uma alta binning como 8 e selecione a opção 'Mover Stage Em vez de deslocamento da imagem' e 'Ir correlações utilizadas para alinhar peças' botões de rádio.
- Na janela Navegador, clique na primeira posição palco e configurá-lo para ser adquirido por verificando a caixa de seleção 'Acquire'. Repita esse procedimento para cada posição estágio na janela Navegador.
- Abra o Navegador Adquirir diálogo clicando em "Adquirir em Pontos" no menu 'Navigator'. Verifique a "imagem mapa Acquire 'e caixa de seleção" eucentricity áspero' e certifique-se que todas as outras caixas de seleção estão desmarcadas. Clique em 'Continuar' para coletar uma montagem em cada posição palco.
- Tilt-série Acquisition
- Na janela Navegador, selecione um dos mapas adquiridos e clique no botão 'Load mapa'.
- Na janela Navegador, clique em "Adicionar Points 'botão e selecionar pontos no mapa em que adquirir uma série de inclinação. Em seguida, clique no botão "Parar de adicionar Points 'botão. Repita o procedimento para cada mapa recolhidos.
- No menu Câmara selecionar 'Parâmetros' e definir os parâmetros para os modos de foco, experimentação, e Record. [Opcional:. Dose-fracionada dados podem ser especificados em parâmetros para o modo Record]
- Selecione um ponto na janela Navigator e verifique o "Tilt-Series9; caixa de seleção. Na janela de diálogo Setup Tilt-Series que se abre, selecione os parâmetros desejados para a recolha tilt-série. Repita o procedimento para o resto dos pontos selecionados na janela do navegador, mas não selecionar os mapas.
- No menu Navigator novamente selecione a opção "Adquirir nos Pontos '. No Navigator Adquirir diálogo escolher "realinhar o item ', focagem automática' e 'eucentricity áspera", como tarefas preliminares, e selecione' Adquirir série tilt 'como a principal tarefa, e selecione' Feche as válvulas de colunas no final 'para fechar a coluna, quando tudo dos pontos foram recolhidos. Após proceder uma série de inclinação serão coletados em cada ponto em cada mapa.
4. alta taxa de transferência da série Tilt automatizadas de processamento e Reconstrução Usando Tomoauto
- Correcção de Movimento induzida-Beam em dados de dose-fracionada [opcional]
NOTA: Tomoauto usa MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) para remover o movimento induzido por feixe de micrografias fraccionou-dose. NOTIONCORR 16 deve ser instalado no sistema.- Com a série de inclinação original, o registro de saída do SerialEM 10 e as imagens individuais de doses fraccionadas todos no diretório de trabalho atual, em um terminal execute o comando:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> é o nome da série de inclinação para processar.
- Com a série de inclinação original, o registro de saída do SerialEM 10 e as imagens individuais de doses fraccionadas todos no diretório de trabalho atual, em um terminal execute o comando:
- Alinhamento e Reconstrução de Tilt-série
NOTA: Tomoauto por padrão usa IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) para lidar com tilt-série automatizado de geração do modelo fiducial, o alinhamento, a determinação da função de transferência de contraste (CTF), CTF-correção 23, e reconstrução. Alternativamente os usuários têm a opção de usar em tomoauto RAPTOR 24 (incluído no IMOD) para a geração de modelo fiducial automatizado, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) para determinar o CTF, e tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) para a reconstrução ou em qualquer combinação de pacotes de software por configuração. Esta configuração, bem como os parâmetros disponíveis em cada pacote é tratado por um arquivo de configuração global que pode ser editado para se adequar os valores mais comumente utilizados em um laboratório enquanto os arquivos de configuração locais também podem ser criados para parâmetros detalhe usado para uma amostra específica, coleção definir ou tilt-série individual. Todos os pacotes que deseja utilizar deve ser instalado no sistema.- Com a série de inclinação no diretório de trabalho atual, em um terminal de executar o comando
tomoauto --CTF --mode = align <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> é a série de inclinação para ser processado e <fid_diam> é o Diameter um dos marcadores de referência no nanômetros. Este comando irá alinhar e estimar o CTF da série tilt automaticamente. É possível ignorar o processamento CTF removendo a opção --CTF do comando. - Inspecione a série de inclinação alinhado visualmente por quaisquer erros gritantes no processamento de alinhamento e fiscalizar a CTF estimado por executar os comandos:
3dmod <filename> .ali
submfg <filename> _ctfplotter.com
respectivamente, onde <filename> é o nome da série tilt sem sufixo. Também verificar a saída do comando tomoauto ver o erro residual significativo gerado pelo alinhamento, que é uma estatística quantitativa da qualidade do alinhamento. - Dado um alinhamento aceitável proceder processamento executando o comando:
tomoaupara --CTF --mode = reconstruir <filename.st> <fid_diam>
com as mesmas substituições de usuário como em 4.2.1. Este comando irá corrigir o CTF, apagar os marcadores fiduciais da série tilt e calcular a reconstrução. Novamente processamento CTF pode ser ignorada como em 4.2.1. - [opcional] Para pular a etapa de inspeção visual e automatizar completamente o processamento e reconstrução executar o comando
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [opcional] Para usar uma configuração local específico, consulte a documentação tomoauto sobre como gerar um arquivo de configuração local, e em seguida, executar o comando
tomoauto [opções] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
onde <local_config> é o nome do local, configuration arquivo.
- Com a série de inclinação no diretório de trabalho atual, em um terminal de executar o comando
5. Sub-tomogram Média
NOTA: Nós usamos o pacote i3 15 (http://www.electrontomography.org/) para processar experiências de média sub-tomogram, no entanto, o protocolo descrito aplica-se geralmente a maioria disponível sub-tomogram experimentos processo packages16to software da média sub-tomogram de média, no entanto, o protocolo descrito aplica-se geralmente a maioria disponível sub-tomogram pacotes de software de média 16-18.
- Com o tomogram reconstruída no diretório de trabalho atual abrir o tomogram por partículas picking executando o comando:
tomopick <filename> .rec
onde <filename> é como em 4.2.2. Na janela que se abre usar o botão esquerdo do mouse para clicar sobre o primeiro corpo basal e, em seguida, a ponta da agulha para selecionar um injectisome e usar a seta teclas para cima e para baixo para riff através das fatias do tomogram. Selecione todas as injectisomes visíveis dessa maneira. Este armazena as coordenadas de um ficheiro de texto que definem o eixo do comprimento da estrutura, bem como a estimativa de dois dos três ângulos de Euler que descreve a orientação da estrutura. - Extracto computacionalmente 400 3 cubos de voxel da tomografia centrado no ponto médio do eixo longitudinal definido pela execução do comando:
grampo redimensionamento Cx <x>-Cy <y> -CZ <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<filename> .rec <filename> _001.mrc
onde <x>, <y>, <z> as coordenadas do ponto médio da estrutura e <filename> é como em 4.2.2. O tamanho do cubo extraído deve variar de acordo com a estrutura e a ampliação usada, e deve ser suficientemente grande para envolver adequadamente a estrutura de interesse, que para este exemplo é de 400 3 voxels. - Baixo-amostra (compartimento) do sub-tomograma por um factor de quatro para reduzir o tempo de computação para o alinhamento inicial, executando o comando:
binvol -b 4 <filename> _001.mrc <filename> _001.bin4.mrc
onde <filename> é como em 5.2. - Aplique a determinados ângulos de Euler de sub-tomograms e calcular a média global para produzir o modelo inicial executando o comando.
I3totsum.sh - Alinhe e classificar-se-amostradas sub-tomograms usando uma máscara binária classificação da área citoplasmática. Executar sub-tomogram média no espaço Fourier para minimizar os artefatos desaparecidos cunha característicos da tomografia. Para binning 4 de dados, utilize o SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Repita o passo 5,5 utilizando sub-amostradas tomograms-down por um fator de dois (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") e mais uma vez com os dados originais (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
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Representative Results
Amostras de S. minic�ulas flexneri foram coletadas e processadas conforme mostrado na Figura 1 esquema usando tomoauto seguindo o gasoduto detalhado na Figura 2. Tilt-série foram coletados por meio SerialEM 10, que permite a aquisição de alto rendimento tilt-série em pontos designados pelo utilizador em mapas de montagem de baixa ampliação (Figura 3). As micrografias foram recolhidos utilizando o modo de dose-fraccionamento numa câmara de dispositivo de detecção directa de reduzir induzida pelo movimento do feixe 22 (Figura 4). Tomoauto coordena correção de movimento, tendo uma colecção de micrografias dose fraccionada de processamento cada um com MOTIONCORR 22 e reúne os resultados em uma série de inclinação para ser processado (Filme 1).
A aplicação mais geral de tomoauto é o automaticac alinhamento de um tilt-série inicial. Tomoauto compõe execução sequencial dos comandos necessários em IMOD 13 para alinhar grosseiramente a série de inclinação e gerar um modelo fiducial inicial rastreando as partículas de ouro coloidal na amostra, que por sua vez são usados para gerar o alinhamento final. A precisão deste modelo fiducial é essencial para a qualidade da tomografia reconstruído, e de modo que o utilizador é capaz de inspeccionar visualmente o modelo fiducial calculado automaticamente, antes de prosseguir com a reconstrução ou mais tarde, para identificar inclinação da série que deve ser processada manualmente. A Figura 5 mostra dois tilt-série grosseiramente alinhados eo modelo fiducial determinada como gerado por tomoauto. Figuras 5A, C mostram as imagens Untilted e em ambos o modelo fiducial é correto com pontos de modelo centrado na marcadores fiduciais. Figuras 5B, D mostram o correspondente toldo série a 50 graus e, enquanto o modelo na Figura 5B na Figura 5D se desviaram de seus correspondentes marcadores de ouro e o modelo não é adequado para alinhamento de precisão. Este erro pode ser medido quantitativamente com o erro residual médio entre o centro do ponto de modelo e o centro probabilidade de o marcador de ouro, e tomoauto pode ser configurado para alertar o utilizador quando o erro medido excede um limite definido pelo utilizador para acelerar inspecção. Tilt-série que não estão suficientemente alinhados automaticamente pode então ser alinhados manualmente. Nós achamos que tomoauto alinha com sucesso em torno de 80% -90% do nosso coletadas tilt-série (Filme 2).
Depois de uma série de inclinação foi alinhado com êxito, ele deve ser reconstruído para o tomogram final. Tomoauto foi concebido de modo que o usuário pode usar IMOD 13 ou 26 tomo3d para gerar a reconstrução final. Atualmente usamos tomo3d para tirar proveito de vários recursos em unidades de processamento de computador modernos multi-core (CPUs) para reduzir significativamente o tempo de reconstrução. A tomografia final como mostrado na Figura 6 e Filme 3 é um volume 3-D da amostra trabalhada que pode então ser utilizado para anotação celular por segmentação, ou sub-Tomogram média para obter a informação de alta resolução da maquinaria molecular dentro da amostra. Sub-tomografia de amostragem aumenta tanto o SNR e diminui os artefactos produzidos pelo de cunha em falta através da média para os altos níveis de ruído em tomogramas individuais e utilizar o grande número sub-tomogramas de um conjunto bem distribuído de orientações aleatórias com respeito ao faltando cunha para limitar os artefatos e melhorar a resolução final. A média 2.7nm sub-tomografia de S. intacta flexneri T3SS é mostrado na Figura 7, tal como depositado no BDME (EMD-2667), o que demonstra a grande melhoria capaz com esta técnica de compared ao injectisome apresentada numa única Tomogram na Figura 6B.
Figura 1. Visão esquemática da tomografia de alto rendimento crio-eletrônico. Uma suspensão líquido é rapidamente congelado em uma grade de EM e um conjunto de tilt-série é recolhido por um microscópio controlado por computador automatizado de elétrons. As micrografias resultantes são processados automaticamente utilizando tomoauto para gerar o tomogram. O passo final aqui é um S. segmentada minicell flexneri a partir de uma tomografia gerada por este protocolo de Hu et al. 2015 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fluxograma de processo tomoauto. A repartição do fluxo de trabalho tomoauto mostra como os dados são processados a partir de uma colecção de micrografias doses fraccionadas todo o caminho para a média final sub-tomogram. Símbolos Sub-processo detalhadamente as tarefas que tomoauto coordenadas para processar a entrada, executando o software apropriado configurado. Os símbolos de dados mostrar a saída geralmente não é usado pelo usuário, enquanto documentos e multi-documentos símbolos mostram a saída realmente tratado pelo usuário. Finalmente exibir símbolos mostrar onde a intervenção do usuário ocorre no fluxo de trabalho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Por lote de aquisição de tilt-série com SerialEM Navigator. Posições de montagem mapas são armazenados como posições de palco (mostrado selection) na lista da janela Navigator mostrado no lado esquerdo da tela, e o mapa atualmente carregado é exibido na janela de tampão junto com os pontos selecionados rotuladas numericamente com uma cruz vermelha adicionada ao mapa para aquisição. Pontos de aquisição são listados por etiqueta na janela Navegador e pode ser configurado para adquirir usando a caixa de seleção "série Tilt". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeito do movimento de correção em dados fracionados a dose. (A) mostra uma micrografia não inclinada e não corrigida, corrigida e a imagem em movimento (processado por MOTIONCORR) é mostrado em (B), o contraste é ligeiramente melhorada após a correcção. Melhoria pode ser visto mais aparentemente olhando para a transf FourierORM da micrografia antes (C) e depois (D) de correcção de movimento. Imagens EH mostram a mesma informação, mas com uma micrografia inclinado a 60 graus, onde o contraste é diminuída e anéis Thon visíveis em C e D não são mais visíveis em alta inclinação. Barra de escala de 250 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Os bons e maus resultados de tomoauto automatizado alinhamento tilt-série. (A) Uma micrografia aproximadamente alinhados untilted eo modelo fiducial produzida automaticamente usando tomoauto. (B) O modelo fiducial determinada a 50 graus de inclinação. O modelo ainda se encaixa bem e é centrado sobre os marcadores fiduciais apropriadas. (C, D) (A, B), respectivamente, ampliada na área de box. Esta série de inclinação foi alinhado com um erro residual média de 1,06 pixels. (E) Uma micrografia untilted e modelo fiducial de outro tilt-série e (F) a série em 50 graus de inclinação. Aqui vemos que o modelo perdeu o controle de vários marcadores fiduciais (mostrado em vermelho) e é representante de um mau acompanhamento automatizado. (G, H) mostra o modelo em (E, F), respectivamente, ampliada na área de box. Esta série de inclinação foi alinhado com um erro residual média de 3,51 pixels e teve de ser processado por alinhamento manual da série. Bar (A) Scale 500 nm (C) Barra de escala de 50 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
![Figura 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figura 6. Tomogram gerado automaticamente por tomoauto. (A) Este mostra uma projecção de sete fatias a partir do centro da reconstrução da série de inclinação apresentada na Figura 4A. A barra de escala de 250 nm. (B) Uma vista ampliada da área de box em (A) exibindo uma injectisome intacta. Barra de escala de 100 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura média 7. Sub-tomogram de S. intacta sistema de secreção do tipo III flexneri. (A) fatia Central do 2,7 nm média sub-tomogram do S. intacta flexneri T3SS de EMDB (EMD-2667). (B) ao longo projeção completaO eixo x do volume. (C) Isosurface rendição do volume visto em contorno um limiar de 130 em IMOD. Barra de escala 5 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Animação de não alinhado tilt-series (Clique direito a download). Esta animação é executado através da série de inclinação como inicialmente recolhidos pelas SerialEM. Deslocamentos translacionais são facilmente identificados pelo caminho errático de marcadores individuais fiduciais de imagem a imagem, e essas mudanças junto com defeitos menos perceptível deve ser corrigida antes da série de inclinação pode ser reconstruído.
![Filme 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Filme 2: Animação de-alinhados série de inclinação (Clique direito a download). Esta animação percorre as mesmas micrografias exibidos no Movie 1 após o alinhamento automático por tomoauto. Os caminhos erráticos de marcadores fiduciais agora seguir uma trajectória suave através da série de inclinação, e o eixo de inclinação é alinhado verticalmente em relação ao observador.
Filme 3:. Animação de reconstruído tilt-series (Clique direito a download) Esta animação é executado através da tomografia mostrado na Figura 6 gerado reconstrução após automatizada do tilt-série exibida no filme 2 btomoauto y.
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Discussion
O método de alto rendimento descrito aqui nos permitiu processar 1.917 crio tilt-série e produzir mais de 4.500 sub-tomograms do S. intacta flexneri injectisome 19. Os dados recolhidos conduziu à caracterização detalhada de injectisome em situ, incluindo o complexo citoplasmático triagem. O método também foi utilizado para visualizar várias células mutantes com deleção específica de componentes de proteína putativos, o que ajudou a elucidar a composição da plataforma de triagem do injectisome. Nosso método fornecido novos caminhos para investigar a relação estrutura-função da injectisome. Como resultado, o novo palco estava montado para posterior dissecação dos mecanismos subjacentes secreção e patogênese mediada por T3SS.
O protocolo aqui apresentado descreve de alto rendimento crio-ET de S. intacta flexneri, mas é aplicável a qualquer processo adequado para a crio-ET. Este método tem sido usado na estrutucaracterização ral do motor flagelar de Borrelia burgdorferi 27, a infecção de E. minic�ulas coli por bacteriófago T7 28 e matrizes quimiorreceptoras em E. coli 29. Ao facilitar a recolha de grandes conjuntos de dados, é possível rastrear vários mutantes, bem como uma imagem de grande número de condições que permitam inferências de processos dinâmicos, como montagem de máquinas 27 e o progresso da infecção fago 28. Ao coletar vários pacotes de software e permitindo controle total sobre a execução de processamento, os usuários são capazes de personalizar diferentes combinações de pacotes para melhores resultados. Chen 21 et al. Publicado anteriormente um protocolo semelhante descrevendo a coleta de dados, utilizando o pacote de software Leginon 12 e automatizando o processamento tilt-série usando IMOD 13 e 24 RAPTOR. O protocolo atual complementa esse método detalhando um método alternativo para codados llecting e processamento ao mesmo tempo, mostrando o quanto a tecnologia e processo avançou, impulsionada pelo maior foco em alta resolução através de sub-tomogram média, com dados de dose-fracionada, estimativa CTF automatizada e correção, e mais robustas rotinas de alinhamento automatizados dentro IMOD 13. Enquanto o anterior protocolo entra em detalhes visuais com ênfase na coleta de dados, este método concentra-se sobre os detalhes do tratamento dos dados recolhidos.
Métodos de alto rendimento permitem a recolha de dados em massa que maximizar o uso de microscópio e computador recursos, limitando a quantidade de intervenções manuais de usuário tediosas que abrandar o projeto e agir como um grande gargalo. O tomoauto biblioteca wrapper foi concebido para permitir a configuração completa de todos os parâmetros utilizados em cada pacote de software de uma forma simples e centralizada. Uma vez que uma configuração adequada tenha sido determinada, é fácil de aplicar, em seguida, as definições para todo dataset. A maioria das séries de inclinação pode ser processado com resultados aceitáveis (Figura 4A), ao passo que um subconjunto menor é necessário para ser processado manualmente. Estas séries de inclinação são geralmente aquisições menos ideais atormentado por turno excessiva da imagem, contraste pobre, ou a falta de marcadores fiduciais suficientes que faz com que a rotina automatizada de monitoramento fiducial a falhar (Figura 4B). Para obter os melhores tomograms possíveis, grande cuidado deve ser tomado em cada etapa crucial de preparação de amostras, aquisição de imagem, ao processamento da imagem.
Novos desenvolvimentos em high-throughput crio-ET, tais como extração automatizada sub-tomogram por modelo de harmonização e integração de pacotes de software de média modernos sub-tomogram tais como Dynamo em dutos de fluxo de trabalho existentes, como tomoauto estão agora a ser investigado. O advento recente da nova geração de câmeras de dispositivos de detecção direta fez grandes melhorias no aumento da inclinação da série SNR e permitindo more determinação CTF consistente devido à maior eficiência do detector. A utilização de novos tipos de grade de ouro cheio pode diminuir defeitos de coleta tilt-série, melhorar a taxa de sucesso para o processamento de tilt-série automatizada e reconstrução com menos necessidade de intervenção manual 30. Finalmente, com o uso agora onipresente de clusters de computadores e unidades de processamento gráfico (GPUs) para paralelizar e acelerar o processamento de grande conjunto de dados, desenvolvimento de condutas que podem utilizar estes sistemas, em breve espero ser capaz de encurtar o tempo de execução de dias para horas, proporcionando aos usuários ainda ainda menos tempo de inatividade entre delineamento experimental e análise de dados significativos enquanto continua a aumentar o tamanho do conjunto de dados e alcançar resoluções mais altas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. William Margolin para comentários. Somos gratos pelo apoio em SerialEM dos Drs. David Mastronarde e Chen Xu. DM, BH e JL foram apoiados por Grant R01AI087946 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, concessões R01GM110243 e R01GM107629 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS), e Grant AU-1714 da Fundação Welch. O detector eletrônica direta foi financiado pelo National Institutes of Award Saúde S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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