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Bioengineering

Tomoauto का प्रयोग: एक प्रोटोकॉल उच्च throughput स्वचालित क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए

Published: January 30, 2016 doi: 10.3791/53608
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

हम आणविक मशीनों के सीटू ढांचे में उच्च संकल्प निर्धारित करने के लिए उच्च throughput क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का उपयोग करने पर एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल आम अड़चनों से बचा जाता है, डेटा की बड़ी मात्रा में संसाधित किया जा करने के लिए परमिट और उपयोगकर्ता महत्वपूर्ण जैविक सवालों पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है, संसाधन डाउनटाइम कम कर देता है।

Introduction

प्रकार III स्राव सिस्टम (T3SS) कई ग्राम नकारात्मक रोगज़नक़ों के लिए आवश्यक डाह निर्धारक हैं। यह भी सुई परिसर के रूप में जाना जाता है injectisome, यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं 1, 2 में जीवाणु से प्रेरक प्रोटीन का सीधा translocation के लिए आवश्यक केंद्रीय T3SS मशीन है। injectisome एक बाह्य सुई, एक बेसल शरीर, और एक cytoplasmic जटिल शामिल भी जाना जाता है छँटाई जटिल 3 के रूप में। पिछले अध्ययनों प्रमुख बेसल शरीर के प्रोटीन 4, 5 की परमाणु संरचना के साथ-साथ, साल्मोनेला और शिगेला से शुद्ध injectisomes के 3-डी संरचनाओं स्पष्ट कर दिया है। साल्मोनेला, शिगेला, और यर्सीनिया से injectisomes के सीटू संरचनाओं में हाल-एट क्रायो 6 से पता चला रहे थे , 7। हालांकि, प्रेरक चयन और सुई विधानसभा के लिए आवश्यक साइटोप्लास्मिक जटिल, उन संरचनाओं में कल्पना नहीं की गई है।

क्रायो-एट राज्यमंत्री है(सीटू) अपने मूल सेलुलर संदर्भ में नैनोमीटर संकल्प पर आणविक मशीनरी इमेजिंग के लिए उपयुक्त तकनीक टी। फिर भी, क्रायो ईटी द्वारा प्राप्त संकल्प नमूना मोटाई द्वारा सीमित है। खामी को दूर करने के लिए, हम आनुवंशिक रूप से क्रायो एट के लिए काफी पतली minicells उत्पादन करने के लिए संशोधित किया गया था कि एक विषमय शिगेला flexneri तनाव में बरकरार injectisomes imaged। क्रायो ईटी की एक और सीमा बहुत जल्दी नमूने में उच्च संकल्प जानकारी नष्ट कर देता है जो इलेक्ट्रॉन बीम, से प्रेरित विकिरण के नमूने की संवेदनशीलता है। एक उपयुक्त खुराक पूरे ज़ोर-श्रृंखला के बीच वितरित किया जा सकता है, ताकि एक परिणाम के रूप में, बहुत कम खुराक व्यक्तिगत झुकाव छवियों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यह बहुत यह मुश्किल रण में शोर की बड़ी राशि से इस विषय की ढांचागत सुविधाओं को अलग करने के लिए बनाता है और cryo- द्वारा प्राप्त किया जा सकता है कि संकल्प की सीमा जो अंतिम पुनर्निर्माण में संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR), कम करती है ईटी। Conventiऐसे फूरियर और वास्तविक अंतरिक्ष फिल्टर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूने नीचे onal छवि प्रसंस्करण विपरीत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन उच्च संकल्प जानकारी के बहुत बाहर छानने की कीमत पर किया जा सकता है। हाल ही में, उप रण यह संभव बहुत SNR बढ़ाने के लिए और उप नैनोमीटर स्तर 8, 9 के लिए कुछ मामलों में बाद में अंतिम समाधान करने के लिए बनाया गया है। परिसरों की एक अधिक विस्तृत विश्लेषण संभव बनाया है computationally युक्त उप tomograms के हजारों निकालने के द्वारा aligning और उप tomograms औसत फिर मूल tomograms और से हित के क्षेत्रों में उच्च SNR और उच्च संकल्प के साथ सीटू जटिल संरचनाओं में निर्धारित करने के लिए। इन विधियों macromolecular विधानसभाओं और देशी सेलुलर संदर्भ में उनके गतिशील रचना में भी अधिक से अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए आनुवंशिक दृष्टिकोण के साथ एकीकृत किया जा सकता है।

सामान्य तौर पर, या दसियों हजार उप-tomograms के भी सैकड़ों उच्च निर्धारित करने के लिए औसतन किया जा करने की जरूरत हैबगल में संकल्प संरचनाओं। झुकाव श्रृंखला के लिए पर्याप्त संख्या के अधिग्रहण के उप tomograms की इस बड़ी संख्या में जल्दी से एक अड़चन बन जाता है का उत्पादन करने की जरूरत है। जिसके परिणामस्वरूप झुकाव श्रृंखला अक्सर पुनर्निर्माण करने से पहले संरेखण में झुकाव श्रृंखला लाने के लिए हल किया जाना चाहिए जो किरण प्रेरित पाली, चरण प्रतिक्रिया, साथ ही बढ़ाई, रोटेशन और तिरछा दोष से प्रभावित कर रहे हैं। झुकाव श्रृंखला आम तौर पर अभी तक एक और अड़चन के कारण पारंपरिक रूप से मैन्युअल झुकाव श्रृंखला के निरीक्षण के माध्यम से चयन किया जाता है, जो ट्रैकिंग सोने विश्वस्त मार्कर, से गठबंधन किया है। कई सॉफ्टवेयर संकुल 11, 12, झुकाव श्रृंखला संरेखण और पुनर्निर्माण 13, 14 और उप रण 15-18 औसत कंप्यूटर नियंत्रित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 10, के माध्यम से स्वचालित झुकाव श्रृंखला के अधिग्रहण के लिए विकसित किया गया है। इन पैकेजों क्रायो ईटी की कार्यप्रवाह में असतत संचालन संभाल के रूप में, यह systema करने की प्रक्रिया में अमूर्त के एक उच्च स्तर का निर्माण करने के लिए वांछनीय हो जाता हैtically एक भी पाइप लाइन में पूरी योजना को कारगर बनाने के। इसलिए, हम एक केंद्रीकृत ढंग से प्रत्येक घटक की पूरी विन्यास को बनाए रखते हुए सरल उपयोगकर्ता ऑपरेशन के लिए अनुमति देता है, एक भी अर्द्ध स्वचालित इकाई में इन संकुल के एक नंबर का आयोजन करने के लिए तैयार "tomoauto" एक सॉफ्टवेयर आवरण पुस्तकालय का विकास किया। पुस्तकालय के लिए एक ऑनलाइन दूरस्थ स्रोत कोड भंडार (http://github.com/DustinMorado/tomoauto) के माध्यम से खुला स्रोत, अच्छी तरह से प्रलेखित लगातार विकसित और उपयोग के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध, रुझान विकास या आगे एकीकरण है।

यह उच्च throughput क्रायो एट पाइपलाइन एस में बरकरार injectisomes कल्पना करने के लिए उपयोग किया गया है flexneri minicells। 1917 tomograms की कुल उप रण 19 के औसत से चुना गया साइटोप्लास्मिक छँटाई मंच सहित बरकरार मशीन के सीटू संरचना में एक उच्च संकल्प खुलासा, इस पद्धति का उपयोग उत्पन्न किया गया। साथ में जंगली प्रकार और मीटर के आणविक मॉडलिंग के साथutant मशीनों, हमारे उच्च throughput पाइपलाइन मूल निवासी सेलुलर संदर्भ में बरकरार injectisome की संरचना और समारोह को समझने के लिए एक नया अवसर प्रदान करता है।

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Protocol

1. Minicell तैयारी

  1. एस बनाने के लिए flexneri minicells, अनिवार्यता से spectinomycin प्रतिरोधी प्लाज्मिड 5 μl electrocompetent स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी सीरोटाइप 5 ए (M90T-एस) electroporation द्वारा कोशिकाओं में एक कम नकल से कोलाई कोशिका विभाजन जीन ftsQ, ftsA, और ftsZ व्यक्त करता है जो प्लाज्मिड pBS58, 1 μl बदलना 1 मिमी cuvettes में 5 मिसे के लिए 2.5 केवी पर।
  2. एक 1.5 मिलीलीटर क्रायोजेनिक microtube में 15% ग्लिसरॉल में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर minicell नमूने हैं। उपयोग के लिए, 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं को एक विंदुक टिप का उपयोग unthawed microtube से कोशिकाओं के लगभग 5 μl परिमार्जन और निलंबित जब तैयार spectinomycin साथ tryptic सोया शोरबा / एमएल एकाग्रता 100 माइक्रोग्राम के लिए कहा। 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन आगे बढ़ें।
  3. पिपेट फिर से 100 माइक्रोग्राम / एमएल सांद्रता में जोड़ा spectinomycin के साथ 1.2 200 में एमएल tryptic सोया शोरबा से संस्कृति के 2 मिलीलीटर। देर लॉग चरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें।
  4. Minicells, सेंट्रीफ्यूज को समृद्ध करने के लिए5 मिनट के लिए 1000 XG पर 1.3 से संस्कृति की 200 मिलीलीटर। ध्यान से 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर एक नए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला अंश डालना। ध्यान से डालो और सतह पर तैरनेवाला अंश त्यागें, और धीरे से एक विंदुक टिप का उपयोग कर शेष तरल के साथ गोली मिश्रण और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब गोली मिश्रण के लगभग 100 μl हस्तांतरण।

2. ईएम ग्रिड तैयारी

  1. एक गिलास स्लाइड पर एक आर 2/2 छेददार कार्बन फिल्म 200-जाल तांबा ग्रिड कार्बन ऊपर की ओर रखें।
    नोट: ए आर 2/2 200-जाल ग्रिड अभी भी नमूना समर्थन और कैमरे के क्षेत्र में कार्बन फिल्म के किनारे रखकर जबकि एक भी ग्रिड वर्ग में प्राप्त करने के लिए सेट किया जा सकता है कि झुकाव सीरीज की संख्या को अधिकतम करने के लिए चयन किया गया है वांछित बढ़ाई। महीन जाल ग्रिड और ऐसे R1.2 के रूप में छोटे छेददार कार्बन फिल्मों / 1.3 400 जाल उच्च बढ़ाई imaged नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; ऐसे R3.5 के रूप में बड़ा छेददार कार्बन फिल्मों / 1 200-जाल उपयोग किया जा सकता हैनमूने के लिए घ कम बढ़ाई imaged या माइक्रोग्राफ़ ऐसे R1 के रूप में बड़ा अंतर के साथ कार्बन बढ़त और छेददार कार्बन फिल्मों को शामिल नहीं करना चाहिए अगर / 4 200-जाल हित के क्षेत्र के लिए मंच aligning और से क्षेत्रों रक्षा करने के साथ सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अधिक जोखिम दिनचर्या ध्यान केंद्रित है और ट्रैकिंग में।
  2. एक चमक निर्वहन डिवाइस में मंच पर स्लाइड रखें।
    नोट: हम एक एनोड और मंच एक निर्वात desiccator में machined किया गया है और एक उच्च आवृत्ति जनरेटर के द्वारा संचालित है, जिसमें एक घर में डिवाइस का उपयोग करें। एक वैक्यूम बनाने के बाद, ग्रिड का निर्वहन चमक के लिए 1 मिनट के लिए जांच पर एनोड और बिजली के लिए उच्च आवृत्ति जनरेटर जांच देते हैं। आवश्यक समय ग्रिड एक मिनट के लिए कुछ ही सेकंड से लेकर कर सकते मुक्ति चमक के लिए। चमक निर्वहन समय अलग नमूना एकाग्रता और कोई कांच का बर्फ के साथ सूखी दिखाई देते हैं कि ग्रिड के साथ समस्याओं का निदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. संदंश का एक सेट के साथ ग्रिड निकालें, और संदंश एक इलास्टिक ख के साथ बंद तालाऔर।
  4. 1.4 में तैयार minicells साथ microcentrifuge ट्यूब 10 एनएम कोलाइडयन सोने समाधान के 100 μl जोड़ें और धीरे से एक उंगली के साथ ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण। 2.2 में तैयार ग्रिड पर मिश्रण का एक नया पिपेट जगह 4 μl के साथ।
    नोट: कोलाइडयन सोने आकार और देखभाल की एक किस्म में उपलब्ध है सोने के आकार का अधिग्रहण, बढ़ाई संसाधित करने के लिए micrographs की पिक्सेल आकार को देखते हुए अधिक से अधिक 5 पिक्सल है कि लिया जाना चाहिए अस्पष्ट सुविधाओं के लिए बहुत बड़ी नहीं किया जा रहा है, जबकि ब्याज की।
  5. डुबकी फ्रीज तंत्र तैयार करें; तरल नाइट्रोजन के साथ बाहरी ठंड कंटेनर को भरने और फिर तरल ईथेन साथ भीतरी कक्ष भरें। सवार रॉड करने के लिए ग्रिड के साथ संदंश देते हैं और उठाया स्थिति में सवार रॉड ताला।
    नोट: देखें Iancu एट अल 20 एक व्यावसायिक फ़ैसला फ्रीज उपकरण के उपयोग का वर्णन एक प्रोटोकॉल के लिए।।
  6. ध्यान करने के लिए टी फिल्टर कागज के एक टुकड़े को छू द्वारा ग्रिड ब्लाटइसके बाद उन्होंने तुरंत ग्रिड ठंड, सवार रॉड जारी, ग्रिड और फिल्टर पेपर अलग और बंद हो जाता है फिल्टर पेपर पर बाती के बीच meniscus तक नमूने के ड्रॉप। ध्यान सवार रॉड से संदंश को हटाने और एक ग्रिड धारक में ग्रिड जगह है।
  7. तरल नाइट्रोजन के साथ लोडिंग क्षेत्र और अवशोषण पंप कंटेनर को भरने से क्रायो ईएम हस्तांतरण स्टेशन तैयार करें। लोड हो रहा है क्षेत्र ग्रिड धारक और लदान क्षेत्र में एक माइक्रोस्कोप नमूना कारतूस तरल नाइट्रोजन तापमान जगह पर है एक बार।
  8. ध्यान से पहले Polara सूक्ष्मदर्शी या बाद में मॉडल पर एक सी शैली क्लिप अंगूठी पर एक छोटे से पिरोया ताला अंगूठी है जो या तो ताला अंगूठी, हटा; संदंश का उपयोग कारतूस में ईएम ग्रिड जगह और फिर धीरे ग्रिड हासिल कारतूस पर वापस ताला अंगूठी पुनः अनुलग्न।
  9. माइक्रोस्कोप से कई नमूना धारक को हटाने और हस्तांतरण स्टेशन को देते हैं। कारतूस संदंश एक का उपयोग कर धारक में नमूना कारतूस की जगहलोड हो रहा है क्षेत्र से धारक को वापस लेना और माइक्रोस्कोप के लिए वापस कई नमूना धारक हस्तांतरण चाहते हैं।
    नोट:। चेन एट अल 21 2.1-2.9 ब्यौरा एक दृश्य प्रोटोकॉल के लिए देखें।

3. उच्च throughput स्वचालित टिल्ट-श्रृंखला संग्रह

  1. कम बढ़ाई मैप्स का संग्रह
    1. SerialEM 10 के 'नेविगेटर' मेनू में 'ओपन' पर क्लिक करके नया नेविगेटर विंडो खोलें (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
    2. स्वीकार्य इमेजिंग की स्थिति में होते हैं कि ग्रिड वर्गों का पता लगाएं (यानी, पतली बर्फ, कोई संदूषण, रुचि का विषय) कम बढ़ाई फ्लोरोसेंट स्क्रीन का उपयोग (~ 2,300X minicell नमूना के लिए)।
      नोट: [वैकल्पिक:। यह कदम पूरे ग्रिड montaging द्वारा SerialEM साथ स्वचालित किया जा सकता है, लेकिन यह बस मैन्युअल कुछ क्षेत्रों का चयन करने के लिए तेजी से किया जा सकता है]
    3. तब समायोजित 50 डिग्री करने के लिए नमूना धारक झुकने से eucentric ऊंचाई करने के लिए मंच को समायोजित करेंमंच के xy अनुवाद तक Z-ऊंचाई झुका हुआ है और untilted विचारों के बीच बहुत कम है।
    4. ग्रिड वर्ग के केंद्र में ले जाएँ और वर्तमान चरण की स्थिति को स्टोर करने के नेविगेटर विंडो में 'जोड़ें स्टेज स्थिति' बटन पर क्लिक करें।
    5. सभी स्वीकार्य ग्रिड चौकों मंच पदों बचा लिया गया है जब तक ऊपर के चरणों 3.1.1-4 जारी रखें।
    6. 'फ़ाइल' मेनू में 'न्यू असेंबल' पर क्लिक करके एक नया असेंबल एमआरसी फ़ाइल खोलें। खुल जाता है कि असेंबल सेटअप संवाद में, पूरे ग्रिड वर्ग (एक मानक 200 जाल ग्रिड के लिए उदाहरण के लिए, 10 x 10) का अधिग्रहण करेगी कि एक्स और वाई में टुकड़े के एक नंबर का चयन करें। 'बजाय छवि स्थानांतरण के मंच चाल' और रेडियो बटन 'टुकड़े संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया सहसंबंध जाएं' 8 के रूप में एक उच्च binning का प्रयोग करें और का चयन करें।
    7. नेविगेटर विंडो में पहले चरण की स्थिति क्लिक करें और इसे 'मोल' चेकबॉक्स की जाँच करके प्राप्त किया जा करने के लिए निर्धारित किया है। नेविगेटर विंडो में प्रत्येक चरण के पद के लिए इस दोहराएँ।
    8. नेविगेटर 'नेविगेटर' मेनू में 'अंक पर मोल' पर क्लिक करके संवाद मोल खोलें। 'मोल नक्शा छवि' और 'रफ eucentricity' चेकबॉक्स चेक और अन्य सभी चेक बॉक्स अनियंत्रित हैं कि सुनिश्चित करें। प्रत्येक चरण के स्थान पर एक असेंबल इकट्ठा करने के लिए 'आगे बढ़ें' पर क्लिक करें।
  2. टिल्ट-श्रृंखला अधिग्रहण
    1. नेविगेटर खिड़की में अधिग्रहीत नक्शे में से एक को चुनें और 'मानचित्र लोड करें' बटन पर क्लिक करें।
    2. नेविगेटर विंडो में एक झुकाव सीरीज प्राप्त करने के लिए, जिस पर नक्शे में बटन 'अंक जोड़ें' और चयन अंक क्लिक करें। तब बटन 'अंक जोड़ने बंद करो' पर क्लिक करें। एकत्र प्रत्येक नक्शे के लिए दोहराएँ।
    3. कैमरा मेनू में 'पैरामीटर' का चयन करें और फोकस, परीक्षण, और रिकार्ड मोड के लिए मानकों को परिभाषित। [वैकल्पिक:। डेटा रिकॉर्ड मोड के लिए मानकों में निर्दिष्ट किया जा सकता खुराक-fractionated]
    4. नेविगेटर खिड़की में एक बिंदु का चयन करें और 'टिल्ट-सीरीज की जांच9; बॉक्स की जाँच करें। मापदंडों का चयन खुलती टिल्ट-सीरीज सेटअप संवाद विंडो में झुकाव सीरीज संग्रह के लिए वांछित। नेविगेटर विंडो में चयनित अंक के आराम के लिए दोहराएँ, लेकिन नक्शे का चयन नहीं करते।
    5. नेविगेटर मेनू में फिर से 'अंक पर मोल' का चयन करें। नेविगेटर में संवाद का चयन 'आइटम करने के लिए फिर से संगठित करना', ऑटोफोकस 'और' रफ eucentricity मोल 'प्रारंभिक कार्यों के रूप में, और चुनें' झुकाव श्रृंखला मोल 'प्राथमिक कार्य के रूप में, और चुनें' जब सब कॉलम बंद करने के लिए 'के अंत में बंद स्तंभ वाल्व अंक के एकत्र किया गया है। एक झुकाव श्रृंखला आगे बढ़ने पर प्रत्येक नक्शे में प्रत्येक बिंदु पर एकत्र किया जाएगा।

4. उच्च throughput स्वचालित टिल्ट-श्रृंखला प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण Tomoauto का उपयोग

  1. खुराक-fractionated डेटा में बीम प्रेरित मोशन का सुधार [वैकल्पिक]
    नोट: Tomoauto MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht का उपयोग करता हैएमएल) खुराक fractionated micrographs से बीम प्रेरित गति को दूर करने के लिए। NOTIONCORR 16 सिस्टम पर स्थापित किया जाना चाहिए।
    1. आदेश पर अमल एक टर्मिनल में मूल झुकाव श्रृंखला, वर्तमान कार्य निर्देशिका में SerialEM 10 से उत्पादन लॉग इन करें और व्यक्तिगत खुराक fractionated छवियों, सब के साथ:
      dose_fractioned_to_stack <filename.st>
      <Filename.st> पर कार्रवाई करने के झुकाव श्रृंखला का नाम है।
  2. टिल्ट-श्रृंखला के संरेखण और पुनर्निर्माण
    नोट: डिफ़ॉल्ट रूप से Tomoauto झुकाव श्रृंखला स्वचालित विश्वस्त मॉडल पीढ़ी, संरेखण, इसके विपरीत हस्तांतरण समारोह (CTF), CTF-सुधार 23 के निर्धारण को संभालने के लिए (http://bio3d.colorado.edu/imod/) IMOD 13 का उपयोग करता है और पुनर्निर्माण। वैकल्पिक रूप से उपयोगकर्ता स्वचालित विश्वस्त मॉडल पीढ़ी, CTF के लिए (IMOD में शामिल) RAPTOR 24 उपयोग करने के tomoauto में विकल्प होता हैFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) CTF निर्धारित करने के लिए, और tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) पुनर्निर्माण के लिए या सॉफ्टवेयर संकुल के किसी भी संयोजन द्वारा में विन्यास। प्रत्येक पैकेज में उपलब्ध यह विन्यास के साथ ही मानकों को स्थानीय विन्यास फाइल भी एक विशिष्ट नमूना के लिए इस्तेमाल विस्तार पैरामीटर, संग्रह करने के लिए बनाया जा सकता है, जबकि सबसे अधिक एक प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता मूल्यों अनुरूप करने के लिए संपादित किया जा सकता है कि एक वैश्विक विन्यास फ़ाइल द्वारा नियंत्रित किया जाता है सेट या व्यक्तिगत झुकाव श्रृंखला। इस्तेमाल किया जा करना चाहते हैं कि सभी संकुल सिस्टम पर स्थापित किया जाना चाहिए।
    1. वर्तमान कार्य निर्देशिका में झुकाव-श्रृंखला के साथ, एक टर्मिनल में आदेश पर अमल
      tomoauto --CTF --mode = संरेखित <filename.st> <fid_diam>
      <Filename.st> संसाधित करने के लिए झुकाव श्रृंखला है और <fid_diam> diame हैनैनोमीटर में विश्वस्त मार्कर की आतंकवाद। यह आदेश पंक्ति में है और स्वचालित रूप से झुकाव श्रृंखला की CTF अनुमान जाएगा। यह आदेश से --CTF विकल्प को हटाने के द्वारा CTF प्रसंस्करण छोड़ करने के लिए संभव है।
    2. संरेखण प्रसंस्करण में किसी भी स्पष्ट त्रुटियों के लिए नेत्रहीन गठबंधन झुकाव श्रृंखला का निरीक्षण किया और आदेशों को क्रियान्वित करने से अनुमान लगाया CTF का निरीक्षण:
      3dmod <filename> .ali
      submfg <filename> _ctfplotter.com
      क्रमशः है, जहां <filename> प्रत्यय के बिना झुकाव श्रृंखला का नाम है। इसके अलावा संरेखण गुणवत्ता का एक मात्रात्मक आंकड़ा है जो संरेखण, द्वारा उत्पन्न मतलब अवशिष्ट त्रुटि दिखाई tomoauto कमांड के उत्पादन की जाँच करें।
    3. एक स्वीकार्य संरेखण दिए गए आदेश को क्रियान्वित करने से प्रसंस्करण के लिए आगे बढ़ें:
      tomoauकरने के लिए --CTF --mode = पुनर्निर्माण <filename.st> <fid_diam>
      4.2.1 के रूप में ही उपयोगकर्ता प्रतिस्थापन के साथ। यह आदेश, CTF सही झुकाव श्रृंखला से विश्वस्त मार्करों मिटा और पुनर्निर्माण की गणना करेगी। फिर CTF प्रसंस्करण 4.2.1 के रूप में छोड़ी जा सकती हैं।
    4. [वैकल्पिक] दृश्य निरीक्षण के कदम को छोड़ और पूरी तरह से प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण के आदेश पर अमल को स्वचालित करने के लिए
      tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam>
    5. [वैकल्पिक] एक स्थानीय विन्यास को उत्पन्न करने के लिए कैसे पर tomoauto दस्तावेज को देखें, एक विशिष्ट स्थानीय विन्यास का उपयोग करें, और उसके बाद आदेश पर अमल करने के लिए
      tomoauto [विकल्प] एल <local_config> <filename.st> <fid_diam>
      जहां <local_config> स्थानीय conf का नाम हैiguration फ़ाइल।

5. उप-रण

नोट: हम 15 (http://www.electrontomography.org/) उप-रण प्रयोगों पर कार्रवाई करने के लिए, तथापि प्रोटोकॉल वर्णित i3 पैकेज का उपयोग सबसे उपलब्ध उप रण सॉफ्टवेयर packages16to प्रक्रिया उप रण प्रयोगों के लिए आम तौर पर लागू होता है, हालांकि प्रोटोकॉल सबसे उपलब्ध उप रण सॉफ्टवेयर संकुल 16-18 करने के लिए आम तौर पर लागू होता है का वर्णन किया।

  1. वर्तमान कार्य निर्देशिका में खंगाला रण के साथ आदेश को क्रियान्वित करने से कण चुनने के लिए रण को खोलने:
    tomopick <filename> .rec
    जहां <filename> 4.2.2 के रूप में है। एक injectisome चयन और tomogra के स्लाइस के माध्यम से रिफ के लिए ऊपर और नीचे तीर कुंजी का उपयोग करने के लिए पहली बेसल शरीर और फिर सुई की नोक पर क्लिक करने के लिए बाईं माउस बटन का उपयोग खुलने वाली विंडो मेंमी। इस तरीके में सभी दृश्य injectisomes का चयन करें। इस संरचना की लंबी अक्ष को परिभाषित करने के साथ ही तीन यूलर के दो संरचना के उन्मुखीकरण का वर्णन कोण का आकलन करने के लिए एक पाठ फ़ाइल में निर्देशांक संग्रहीत करता है।
  2. Computationally निकालें आदेश को क्रियान्वित करने से परिभाषित लंबे अक्ष के मध्य में केंद्रित रण से 400 3 voxel क्यूब्स:
    क्लिप का आकार बदलने -cx <x> -cy <Y> -cz <जेड> -ix 400 -iy 400 -iz 400
    <Filename> .rec <filename> _001.mrc
    जहां <x>, <Y>, <जेड> संरचना का मध्यबिंदु समन्वय कर रहे हैं और <filename> 4.2.2 के रूप में है। निकाले क्यूब का आकार संरचना और इस्तेमाल बढ़ाई द्वारा भिन्न चाहिए, और पर्याप्त रूप से इस नमूने के लिए 400 3 voxels है, जो ब्याज की संरचना, बंद करने के लिए इतना बड़ा होना चाहिए।
  3. डाउन-नमूना (बिन) आदेश को क्रियान्वित करने से प्रारंभिक संरेखण के लिए गणना समय को कम करने के लिए चार का एक पहलू से उप रण:
    binvol बी 4 <filename> _001.mrc <filename> _001.bin4.mrc
    जहां <filename> 5.2 में के रूप में है।
  4. चुना गया यूलर उप tomograms को कोण लागू करें और आदेश को क्रियान्वित करने से प्रारंभिक टेम्पलेट का उत्पादन करने के लिए वैश्विक औसत की गणना।
    I3totsum.sh
  5. संरेखित और cytoplasmic क्षेत्र के एक द्विआधारी वर्गीकरण मुखौटा का उपयोग कर नीचे नमूना उप tomograms वर्गीकृत करते हैं। टोमोग्राफी की विशेषता लापता कील कलाकृतियों को कम करने के लिए फूरियर अंतरिक्ष में उप रण प्रदर्शन करते हैं। 4 डेटा binning के लिए, SAMPFACT = "4 4 4" का इस्तेमाल करें।
    i3mramsacls.sh
  6. दोहराएँ कदम 5.5 का उपयोग करते हुए उप-tomograms दो (SAMPFACT = & का एक पहलू से नीचे नमूना# 34; 2 2 2 ") और एक बार फिर मूल डेटा के साथ (SAMPFACT =" 1 1 1 ")।
    i3mramsacls.sh

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Representative Results

Minicells एस के नमूने flexneri एकत्र की है और चित्रा 2 में विस्तृत पाइपलाइन निम्नलिखित tomoauto का उपयोग कर योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया के रूप में प्रोसेस किया गया। टिल्ट-श्रृंखला कम बढ़ाई असेंबल नक्शे पर उपयोगकर्ता द्वारा नामित बिंदुओं पर उच्च throughput झुकाव श्रृंखला के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है जो SerialEM 10, (चित्रा 3) का उपयोग कर एकत्र किए गए थे। Micrographs किरण प्रेरित गति 22 (चित्रा 4) को कम करने के लिए एक सीधा-डिटेक्शन डिवाइस कैमरे पर खुराक विभाजन मोड का उपयोग कर एकत्र किए गए थे। Tomoauto MOTIONCORR 22 के साथ प्रत्येक प्रसंस्करण खुराक fractionated micrographs का एक संग्रह लेने के प्रस्ताव सुधार निर्देशांक और एक झुकाव सीरीज में परिणाम आगे (1 मूवी) संसाधित करने के लिए assembles।

tomoauto का सबसे सामान्य आवेदन अपने आप हैएक प्रारंभिक झुकाव श्रृंखला की ग संरेखण। Tomoauto कटा झुकाव श्रृंखला पंक्ति में है और अंतिम संरेखण उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो बदले में कर रहे हैं जो नमूने में कोलाइडयन सोने के कणों, ट्रैकिंग एक प्रारंभिक विश्वस्त मॉडल उत्पन्न करने के लिए IMOD 13 में आवश्यक आदेशों की अनुक्रमिक निष्पादन composes। इस असंदिग्ध मॉडल की सटीकता खंगाला रण की गुणवत्ता के लिए आवश्यक है, और तो उपयोगकर्ता नेत्रहीन मैन्युअल कार्रवाई की जानी चाहिए कि झुकाव श्रृंखला की पहचान करने के लिए बाद में पुनर्निर्माण के साथ आगे बढ़ने से पहले या स्वचालित रूप से गणना विश्वस्त मॉडल का निरीक्षण करने में सक्षम है। 5 से पता चलता है दो झुकाव श्रृंखला कटा-निरपेक्ष और tomoauto द्वारा उत्पन्न के रूप में। निर्धारित विश्वस्त मॉडल 5 ए, सी untilted छवियों को दिखाने और असंदिग्ध मॉडल दोनों में विश्वस्त मार्कर पर केन्द्रित मॉडल अंक के साथ सही है आंकड़े। 5 ब आंकड़े, इसी tilt- दिखाने D चित्रा 5 ब में मॉडल 50 डिग्री पर और जब तक श्रृंखला चित्रा 5 डी में कई मॉडल अंक (लाल) उनके इसी सोने मार्कर से भटक गया और मॉडल ठीक संरेखण के लिए उपयुक्त नहीं है है। यह त्रुटि मॉडल बिंदु के केंद्र और सोने मार्कर की संभावना केंद्र के बीच का मतलब अवशिष्ट त्रुटि के रूप में मात्रात्मक मापा जा सकता है, और tomoauto मापा त्रुटि का निरीक्षण तेजी लाने के लिए एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित सीमा से अधिक है जब उपयोगकर्ता को सचेत करने के लिए विन्यस्त किया जा सकता है। अपर्याप्त स्वचालित रूप से गठबंधन कर रहे हैं कि टिल्ट-श्रृंखला तो स्वयं गठबंधन किया जा सकता है। हम tomoauto सफलतापूर्वक लगभग 80% हमारे एकत्र झुकाव श्रृंखला (मूवी 2) के -90% संरेखित करता है कि लगता है।

एक झुकाव सीरीज सफलतापूर्वक गठबंधन किया गया है, यह अंतिम रण में खंगाला जाना चाहिए। उपयोगकर्ता IMOD 13 का उपयोग करें या अंतिम पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए 26 tomo3d सकता है, ताकि Tomoauto डिजाइन किया गया है। वर्तमान में हम टी का उपयोगomo3d बहुत पुनर्निर्माण के समय को कम करने के लिए आधुनिक मल्टी कोर कंप्यूटर प्रोसेसिंग यूनिट (CPU) में कई सुविधाओं का लाभ लेने के लिए। चित्रा 6 और मूवी 3 में दिखाया गया के रूप में अंतिम रण तो विभाजन से सेलुलर एनोटेशन, या नमूना भीतर आणविक मशीनरी के उच्च संकल्प जानकारी प्राप्त करने के लिए औसत उप रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि imaged नमूने के एक 3-डी की मात्रा है। उप-रण बढ़ जाती है SNR और दोनों अलग-अलग tomograms में शोर के उच्च स्तर से औसत और सम्मान के साथ यादृच्छिक झुकाव की एक अच्छी तरह से वितरित सेट में बड़ी संख्या में उप tomograms के उपयोग से लापता कील द्वारा उत्पादित कलाकृतियों कम हो जाती है कील लापता कलाकृतियों की सीमा और अंतिम समाधान में सुधार होगा। बरकरार एस के 2.7nm उप रण औसत इस तकनीक सह के साथ सक्षम बड़े सुधार से पता चलता है जो EMDB (EMD-2667), में जमा के रूप में flexneri T3SS चित्रा 7 में दिखाया गया हैचित्रा 6B में एक भी रण में दिखाया injectisome को mpared।

आकृति 1
चित्रा 1. उच्च throughput क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के योजनाबद्ध सिंहावलोकन। एक तरल निलंबन तेजी से एक ईएम ग्रिड और झुकाव श्रृंखला का एक सेट पर जमे हुए है एक स्वचालित कंप्यूटर नियंत्रित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से इकट्ठा किया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप micrographs रण उत्पन्न करने के लिए tomoauto का उपयोग कर स्वचालित रूप से कार्रवाई कर रहे हैं। यहां अंतिम चरण एक खंडों एस है हू एट अल। 2015 15 से इस प्रोटोकॉल के द्वारा उत्पन्न एक रण से flexneri minicell। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा tomoauto प्रक्रिया 2. फ़्लोचार्ट। Tomoauto कार्यप्रवाह के टूटने डेटा सभी तरह से एक अंतिम उप रण औसत करने के लिए खुराक fractionated micrographs का एक संग्रह से संसाधित किया जाता है कैसे पता चलता है। उप-प्रक्रिया प्रतीकों विस्तार से कॉन्फ़िगर उपयुक्त सॉफ्टवेयर चलाकर निवेश की प्रक्रिया को निर्देशांक tomoauto कि कार्य। दस्तावेज़ और बहु ​​दस्तावेज़ प्रतीकों वास्तव में उपयोगकर्ता द्वारा नियंत्रित उत्पादन दिखाने जबकि डेटा प्रतीकों, आम तौर पर उपयोगकर्ता द्वारा नहीं किया जाता उत्पादन दिखा। अंत में उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के कार्यप्रवाह में होता है जहां प्रतीकों को दिखाने प्रदर्शित करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
SerialEM नेविगेटर के साथ चित्रा 3. बैच झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण। चरण पदों के रूप में जमा हो जाती है असेंबल नक्शे का पद (दिखाया selectiस्क्रीन के बाईं ओर दिखाया नेविगेटर विंडो सूची, और वर्तमान में लोड नक्शे में) पर अधिग्रहण के लिए नक्शा करने के लिए जोड़ा एक रेड क्रॉस के साथ संख्यानुसार लेबल चयनित अंक के साथ बफर विंडो में प्रदर्शित किया जाता है। अधिग्रहण अंक नेविगेटर विंडो में लेबल के द्वारा सूचीबद्ध हैं और। "झुकाव श्रृंखला" चेकबॉक्स का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए सेट किया जा सकता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा खुराक fractionated डेटा पर गति-सुधार की 4. प्रभाव। (ए) एक untilted और अनुशासनहीन माइक्रोग्राफ़ दिखाता है, और (MOTIONCORR द्वारा संसाधित) गति को सही छवि (बी) में दिखाया गया है, इसके विपरीत थोड़ा सुधार के बाद सुधार हुआ है। सुधार फूरियर स्ि्न्ंतरर को देखकर अधिक जाहिरा तौर पर देखा जा सकता हैमाइक्रोग्राफ़ की ORM (सी) से पहले और (डी) गति सुधार के बाद। छवियाँ एह ही जानकारी दिखा, लेकिन इसके विपरीत कम हो गई और सी और डी में दिखाई दे Thon छल्ले जाता है, जहां 60 डिग्री पर झुका हुआ एक माइक्रोग्राफ़ साथ नहीं रह उच्च झुकाव पर दिखाई दे रहे हैं। स्केल बार 250 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा tomoauto स्वचालित झुकाव श्रृंखला संरेखण के 5. अच्छा और बुरा परिणाम है। (ए) एक untilted मोटे तौर पर गठबंधन माइक्रोग्राफ़ और स्वचालित रूप से tomoauto का उपयोग कर उत्पादन विश्वस्त मॉडल। (बी) 50 डिग्री के झुकाव पर निर्धारित विश्वस्त मॉडल। मॉडल अभी भी अच्छी तरह से फिट बैठता है और उचित विश्वस्त मार्करों पर केंद्रित है। (सी, डी) (ए, बी) को दिखाती है। यह झुकाव सीरीज 1.06 पिक्सल का एक मतलब अवशिष्ट त्रुटि के साथ गठबंधन किया गया था। (ई) एक और झुकाव सीरीज और 50 डिग्री के झुकाव पर (एफ) श्रृंखला से एक untilted माइक्रोग्राफ़ और असंदिग्ध मॉडल। यहाँ हम उस मॉडल (लाल रंग में दिखाया गया है) कई विश्वस्त मार्कर का ट्रैक खो दिया है देख सकते हैं और यह एक बुरा स्वचालित ट्रैकिंग का प्रतिनिधि है। (जी, एच) बॉक्सिंग क्षेत्र में तेजी से बढ़ी क्रमश: (ई, एफ) में मॉडल दिखाता है। यह झुकाव सीरीज 3.51 पिक्सल का एक मतलब अवशिष्ट त्रुटि के साथ गठबंधन किया है और श्रृंखला के मैनुअल संरेखण द्वारा संसाधित किया जा सकता था किया गया था। (ए) स्केल बार 500 एनएम (सी) स्केल बार 50 एनएम। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्रा 6 चित्रा 6 रण tomoauto द्वारा स्वचालित रूप से उत्पन्न। (क) इस चित्रा -4 ए में दिखाया झुकाव श्रृंखला के पुनर्निर्माण के केंद्र से सात स्लाइस की एक प्रक्षेपण प्रदर्शित करता है। स्केल बार 250 एनएम। (बी) ए (ए) में बॉक्सिंग क्षेत्र की दृष्टि से तेजी से बढ़ी एक अक्षुण्ण injectisome प्रदर्शित। स्केल बार 100 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
बरकरार एस चित्रा 7. उप-रण औसत flexneri प्रकार III स्राव प्रणाली। (ए) बरकरार एस का 2.7 एनएम उप रण औसत के केंद्रीय टुकड़ा EMDB (EMD-2667) से flexneri T3SS। (बी) पूर्ण प्रक्षेपण के साथमात्रा के एक्स-अक्ष। (सी) IMOD में 130 का एक समोच्च दहलीज पर देखी मात्रा की isosurface प्रतिपादन। पैमाने पर पट्टी 5 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1
फिल्म 1: एनीमेशन unaligned झुकाव सीरीज के (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। यह एनीमेशन के रूप में शुरू में SerialEM द्वारा एकत्र झुकाव श्रृंखला के माध्यम से चलाता है। ट्रांसलेशनल पारियों आसानी से कम नजर दोष खंगाला जा सकता है झुकाव सीरीज से पहले सही किया जाना चाहिए के साथ-साथ व्यक्तिगत विश्वस्त छवि के लिए छवि से मार्कर, और इन बदलावों की अनियमित पथ से पहचाने जाते हैं।

फिल्म 2 फिल्म 2:। गठबंधन झुकाव श्रृंखला की एनीमेशन (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) इस एनीमेशन tomoauto द्वारा स्वचालित संरेखण के बाद 1 मूवी में दिखाया ही micrographs के माध्यम से चलाता है। विश्वस्त मार्कर की अनियमित रास्तों अब झुकाव श्रृंखला के माध्यम से एक चिकनी प्रक्षेपवक्र का पालन करें, और झुकाव अक्ष दर्शक के लिए सम्मान के साथ खड़ी गठबंधन किया है।

मूवी 3
मूवी 3:। एनीमेशन खंगाला झुकाव सीरीज के (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) इस एनीमेशन फिल्म 2 बी में दिखाया झुकाव श्रृंखला की चित्रा 6 उत्पन्न होने के बाद स्वचालित पुनर्निर्माण में दिखाया गया रण के माध्यम से चलाता हैY tomoauto।

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Discussion

यहाँ वर्णित उच्च throughput विधि 1917 क्रायो झुकाव श्रृंखला की प्रक्रिया और बरकरार एस के 4,500 से अधिक उप-tomograms उत्पादन करने के लिए हमें सक्षम flexneri 19 injectisome। एकत्र किए गए आंकड़ों जटिल छँटाई साइटोप्लास्मिक सहित सीटू injectisome में की विस्तृत लक्षण वर्णन में इजाफा हुआ। विधि को भी injectisome की छंटाई के मंच की संरचना को स्पष्ट मदद की है जो ख्यात प्रोटीन घटकों के विशिष्ट विलोपन, के साथ कई उत्परिवर्ती कोशिकाओं कल्पना करने के लिए उपयोग किया गया था। हमारे विधि injectisome की संरचना समारोह संबंधों की जांच करने के लिए नए रास्ते प्रदान की है। नतीजतन, नए चरण T3SS की मध्यस्थता स्राव और रोगजनन अंतर्निहित तंत्र के आगे विच्छेदन के लिए स्थापित किया गया था।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल बरकरार एस के उच्च throughput क्रायो ईटी का वर्णन flexneri, लेकिन क्रायो एट के लिए उपयुक्त किसी भी परियोजना के लिए लागू है। इस विधि संरचना में इस्तेमाल किया गया हैBorrelia burgdorferi 27 की कशाभी मोटर की RAL लक्षण वर्णन, ई का संक्रमण ई में जीवाणुभोजी T7 28 से कोलाई minicells, और chemoreceptor सरणियों कोलाई 29। विशाल डेटासेट के संग्रह की सुविधा से, यह कई म्यूटेंट के रूप में अच्छी तरह से छवि के रूप में ऐसी मशीन विधानसभा में 27 और फेज संक्रमण 28 की प्रगति के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं का अनुमान अनुमति है कि स्थितियों की एक बड़ी संख्या स्क्रीन के लिए संभव है। कई सॉफ्टवेयर संकुल का संग्रह और प्रसंस्करण के निष्पादन पर पूरा नियंत्रण के लिए अनुमति देकर, उपयोगकर्ता इष्टतम परिणामों के लिए संकुल के विभिन्न संयोजनों को अनुकूलित करने में सक्षम हैं। एट अल। 21 चेन पहले से झुकाव श्रृंखला IMOD 13 का उपयोग कर प्रसंस्करण और RAPTOR 24 Leginon 12 सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग और स्वचालित एकत्रित डेटा का वर्णन एक समान प्रोटोकॉल प्रकाशित किया। वर्तमान प्रोटोकॉल सह करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका का ब्यौरा इस पद्धति का पूरकllecting डाटा प्रोसेसिंग और भी तकनीक और प्रक्रिया खुराक fractionated डेटा, स्वचालित CTF आकलन और सुधार, और भीतर और अधिक मजबूत स्वचालित संरेखण दिनचर्या के साथ, उन्नत उप रण के माध्यम से उच्च संकल्प पर ध्यान केंद्रित द्वारा संचालित है कितना दिखाते हुए IMOD 13। पिछले प्रोटोकॉल डेटा संग्रह पर जोर देने के साथ दृश्य विस्तार में चला जाता है, वहीं इस विधि एकत्र डाटा प्रोसेसिंग के विवरण पर केंद्रित है।

एक बड़ी अड़चन के रूप में परियोजना और अभिनय धीमा है कि थकाऊ उपयोगकर्ता पुस्तिका हस्तक्षेप की मात्रा सीमित है, जबकि उच्च तरीकों, माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर के संसाधनों के उपयोग को अधिकतम है कि बड़े पैमाने पर डेटा संग्रह के लिए अनुमति देते हैं। आवरण पुस्तकालय tomoauto एक सरल और केंद्रीकृत तरीके से एक सॉफ्टवेयर पैकेज में इस्तेमाल सभी मापदंडों का पूरा विन्यास अनुमति देने के लिए डिजाइन किया गया है। एक उपयुक्त विन्यास निर्धारित किया गया है एक बार, यह पूरे घ के लिए सेटिंग्स को लागू करने के लिए तो आसान हैataset। एक नाबालिग सबसेट मैन्युअल संसाधित करने की आवश्यकता है, जबकि झुकाव श्रृंखला का बहुमत, स्वीकार्य परिणाम (चित्रा 4 क) के साथ कार्रवाई की जा सकती है। ये झुकाव श्रृंखला आमतौर पर अत्यधिक छवि पारी, गरीब विपरीत, या विफल करने के लिए स्वचालित विश्वस्त ट्रैकिंग दिनचर्या का कारण बनता है, जो पर्याप्त विश्वस्त मार्कर की कमी (चित्रा 4 बी) से ग्रस्त कम आदर्श अधिग्रहण कर रहे हैं। सर्वोत्तम संभव tomograms प्राप्त करने के लिए, व्यापक देखभाल छवि प्रसंस्करण के लिए नमूना तैयार करने, छवि अधिग्रहण, से हर महत्वपूर्ण कदम पर लिया जाना चाहिए।

इस तरह से स्वचालित उप रण टेम्पलेट मिलान से निकासी और tomoauto तरह मौजूदा कार्यप्रवाह पाइपलाइनों में इस तरह के डायनमो के रूप में आधुनिक उप रण सॉफ्टवेयर संकुल के एकीकरण के रूप में उच्च throughput क्रायो एट में आगे की घटनाओं अब जांच की जा रही है। नई पीढ़ी के प्रत्यक्ष पता लगाने के उपकरण कैमरों का हाल के आगमन के झुकाव श्रृंखला SNR बढ़ रही है और मोर को सक्षम करने में प्रमुख सुधार कर दिया गया हैकारण डिटेक्टर के उच्च दक्षता के लिए ई लगातार CTF दृढ़ संकल्प। नए पूर्ण सोने ग्रिड प्रकार के उपयोग मैनुअल हस्तक्षेप 30 के लिए कम समय की जरूरत के साथ स्वचालित झुकाव श्रृंखला प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण के लिए सफलता की दर में सुधार, झुकाव श्रृंखला संग्रह दोष कम हो सकती है। अंत में कंप्यूटर समूहों और ग्राफिक प्रोसेसिंग इकाइयों (GPUs) की अब सर्वव्यापी उपयोग के साथ साथ उपयोगकर्ताओं को उपलब्ध कराने, parallelize और बड़े डाटासेट प्रसंस्करण, जल्द ही उम्मीद घंटे दिनों से निष्पादन के समय कम करने में सक्षम हो जाएगा कि इन प्रणालियों का उपयोग कर सकते हैं कि पाइपलाइन के विकास में तेजी लाने के अभी भी प्रयोग के डिजाइन और सार्थक डेटा विश्लेषण के बीच में भी कम से अन्तराल अभी भी डाटासेट आकार में वृद्धि और उच्च संकल्प प्राप्त हुए।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

हम टिप्पणी के लिए डॉ विलियम Margolin धन्यवाद। हम डीआरएस से SerialEM पर समर्थन के लिए आभारी हैं। डेविड Mastronarde और चेन जू। डीएम, बिहार और जीएल वेल्च फाउंडेशन की ओर से राष्ट्रीय एलर्जी के संस्थान और संक्रामक रोग, जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (NIGMS) से अनुदान R01GM110243 और R01GM107629, और ग्रांट ए.यू.-1714 के अनुदान R01AI087946 द्वारा समर्थित थे। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर स्वास्थ्य पुरस्कार S10OD016279 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Tyrptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092
Spectinomycin Sigma-Aldrich S0692
Electroporation Apparatus Bio-rad 165-2100
1 mm Cuvette BTX 45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube Thermoscientific 5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube Sigma-Aldrich Z336769
Holey Carbon Grids Quantifoil
(Electron Microscopy Sciences)		 Q2100CR2 R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device In-House Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator Sigma-Aldrich Z119016  Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator Electro-Technic Products BD-10A Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps Dumont
(Electron Microscopy Sciences)		 72705-D Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold Aurion BSA 10nm
Filter Paper Whatman #2
Ethane  Matheson Tri-Gas UN1035
Nitrogen Matheson Tri-Gas UN1977
Plunger Device In-House Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box Electron Microscopy Sciences 71166-30
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai Polara F30
(300 KeV)
Direct Detection Device Camera Gatan K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software SerialEM http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software MOTIONCORR http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software IMOD http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software IMOD Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0
(Usable in tomoauto)
CTF Determination Software IMOD Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
(Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software tomo3d https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software tomoauto https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software i3 http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software i3 Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 107, इलेक्ट्रॉन cryotomography। जीवाणु रोगज़नक़ minicell प्रोटीन स्राव injectisome आणविक मशीनरी उच्च throughput छवि विश्लेषण
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