Summary
Мы представляем протокол о том, как использовать высокой пропускной крио-электронной томографии для определения высокого разрешения в точке, структур молекулярных машин. Протокол позволяет большие объемы данных, подлежащих обработке, избегает общих узких мест и сокращает время простоя ресурсов, позволяя пользователю сосредоточиться на важных биологических вопросов.
Introduction
Тип III секреции системы (T3SS) являются важнейшими факторами, определяющими вирулентность для многих грамотрицательных микроорганизмов. Injectisome, также известный как иглы комплекса, является центральным T3SS машина требуется для прямого транслокации эффекторных белков из бактерий в эукариотических клетках-хозяевах 1, 2. Injectisome включает внеклеточный иглу, базальный тело, и цитоплазматический комплекс также известен как сортировочного комплекса 3. Предыдущие исследования выяснены 3-D структуры очищенных injectisomes из Salmonella и Shigella, наряду с атомными структурами крупных базальных белков в организме 4, 5. Последние в точке структур injectisomes из Salmonella, Shigella, и Yersinia выявлены крио-ЭТ 6 , 7. Тем не менее, цитоплазматический комплекс, необходимый для выбора эффекторной и узла иглы, не визуализируются в этих структурах.
Крио-ЕТ МОПт подходящую методику для визуализации молекулярные машины в нанометровым разрешением в пределах своей родной сотовой связи (на месте). Тем не менее, достижимое разрешение от крио-ЭТ ограничивается толщины образца. Чтобы преодолеть недостаток, мы отображаемого нетронутыми injectisomes в опасной Shigella Флекснера штамм, который был генетически модифицированных производить минипосылок достаточно тонкие для крио-ЭТ. Другим ограничением крио-ЭТ является чувствительность образца к радиации, вызванной электронным пучком, который разрушает очень быстро информацию с высоким разрешением в образце. В результате чрезвычайно низкие дозы используются для отдельных наклона-изображений, так что подходящая доза может быть распределена среди полного наклона серии. Это значительно снижает отношение сигнал-шум (SNR) в конечном реконструкции, которая делает его трудно отличить структурные особенности предмета, от большого количества шума в томограмме и ограничивает разрешение, которое может быть достигнуто путем крио ET. CONVENTIнальных обработки изображений, такие как Фурье и в реальном пространстве фильтров, а также вниз выборки могут быть использованы для увеличения контраста, но за счет фильтрации большей части информации с высокой разрешающей способностью. Недавно, к югу от томограмма усреднения позволили значительно увеличить SNR, а затем окончательное решение, в некоторых случаях до уровня суб-нанометровых 8, 9. Более детальный анализ комплексов стало возможным благодаря вычислительно извлечения тысячи суб-томограмм, содержащих в областях, представляющих интерес с оригинальными томограмм и затем выравнивая и среднем суб-томограммы, чтобы определить, в точке сложных структур с высокой SNR и высоким разрешением. Эти методы могут быть интегрированы с генетическими подходов, чтобы обеспечить еще большую способность проникновения в суть высокомолекулярных агрегатов и их динамических конформаций в родном сотовой связи.
В общем, десятки или даже сотни тысяч суб-томограмм должны быть в среднем для того, чтобы определить высокий-Разрешение структуры на месте. Приобретение достаточного количества наклона серии, необходимой для производства этого большое количество суб-томограмм быстро становится узким местом. В результате наклона серии часто страдают от лучевой индуцированных сдвигом, ступени зазора, а также увеличения, вращения и косых дефектов, которые должны быть решены, чтобы принести наклона рядов в соответствие до реконструкции. Серия наклона, как правило, выравнивается отслеживания золотых координатных меток, которые традиционно выбранных вручную через инспекции наклона серии, вызывающих еще один узкое место. Многие программные пакеты были разработаны для автоматизированной приобретения наклона серии через компьютерным управлением электронных микроскопов 10, 11, 12, выравнивание наклона серии и реконструкция 13, 14 и суб-томограмма усреднения 15-18. Как эти пакеты обработки дискретных операций в рабочий процесс крио-ЭТ, становится желательно построить более высокий уровень абстракции в процессе к SYSTEMAски упорядочить всю схему в одном трубопроводе. Таким образом, мы разработали программное библиотеку оболочки "tomoauto", предназначенный для организации ряда этих пакетов в одной полуавтоматической блока, что позволяет простой операции пользователя, сохраняя полную конфигурацию каждого компонента в централизованном порядке. Библиотека с открытым исходным кодом, хорошо документированы, постоянно развивается и свободно доступны для использования, с учетом развития или дальнейшая интеграция с помощью онлайн-хранилище удаленного источника кода (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Эта высокая пропускная крио-ЭТ трубопровод был использован для визуализации нетронутыми injectisomes в S. Флекснера минипосылки. В общей сложности 1,917 томограмм были получены с использованием этого метода, выявление высокого разрешения в структуре месте интактного машины включая цитоплазматической сортировки платформы определяется суб-томограмма усреднения 19. Вместе с молекулярного моделирования дикого типа и мutant машины, наша высокой пропускной трубопровод обеспечивает новые возможности для понимания структуры и функции неповрежденной injectisome в родном сотовой связи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Minicell
- Для того, чтобы S. Флекснера минипосылки, преобразования 1 мкл плазмиды pBS58, которые конструктивно выражает гены деление кишечная палочка клеток ftsQ, ftsA и FtsZ от низкого копии спектиномицин устойчивостью плазмиды в 5 мкл Электрокомпетентные стрептомицинустойчивых серотип 5а (M90T-Sm) клеток путем электропорации 2,5 кВ в течение 5 мс в 1 мм кювет.
- Храните образцы Minicell при -80 ° С в 15% глицерине в 1,5 мл микропробирок. Криогенной Готовое, очистить приблизительно 5 мкл клеток от unthawed микропробирок с помощью пипетки и суспендирования клеток в 4 мл трипсином соевый бульон с спектиномицином добавлены 100 мкг / мл концентрации. Выращивают O / N при 37 ° С.
- Пипетка 2 мл культуры из 1,2 в 200 мл трипсинового соевого бульона с спектиномицином снова добавляли к 100 мкг / мл концентрации. Выращивают при температуре 37 ° С до поздней лог-фазы.
- Для обогащения минипосылок, центрифуги200 мл культуры с 1,3 в 1000 мкг в течение 5 мин. Осторожно залить фракции супернатанта в новую центрифужную пробирку и центрифугируют при 20000 х г в течение 10 мин. Тщательно слейте и отбросить фракцию супернатанта, а осторожно перемешать осадок с оставшейся жидкости с использованием пипетки и передачи приблизительно 100 мкл гранул смеси до 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
2. М. Сетка Подготовка
- Поставьте R2 / 2 дырявый углеродная пленка 200-сетка Медная сетка углерода стороной вверх на стекле.
Примечание: а R2 / 2 200-меш сетки выбран чтобы максимизировать количество наклона серии, которые могут быть установлены, чтобы приобрести в одном квадрате сетки в то же время поддерживая образец и размещение край углеродной пленки в области камеры при желаемой увеличением. Более мелкие сетки сетки и меньшие дырявые углеродных пленок, таких как R1.2 / 1,3 400 меш могут быть использованы для образцов отображаемого при большем увеличении; крупные дырявые углерода такие фильмы, как R3.5 / 1 200-сетка может быть использованиеd для образцов отображаемого на низком увеличении, или если микрофотография не должны содержать край углерода и дырчатые углеродные пленки с большей расстояния, такие как R1 / 4 200 меш может быть использован, чтобы помочь с выравнивание этап к интересующей области и защиты области от чрезмерного воздействия в фокусировки и трекинга процедуры. - Поместите слайд на платформе в тлеющего разряда устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовать устройство в доме, в котором анод и платформа была механической обработке в вакуумном эксикаторе и питается от генератора высокой частоты. После создания вакуума, приложите зонд высокочастотный генератор к аноду и власти на зонде в течение 1 мин, чтобы тлеющего разряда сетки. Время, необходимое для тлеющего разряда сетки может варьироваться от нескольких секунд до минуты. Изменение времени тлеющего разряда может быть использован для диагностики проблем с концентрацией образца и сеток, которые появляются сухой не стекловидного льда. - Удалить сетку с набором щипцов и зафиксировать щипцы закрыты эластичным ба также.
- Добавить 100 мкл 10 нм коллоидного раствора золота в микроцентрифужных трубки с минипосылок, подготовленной в 1,4 и перемешать аккуратно стряхивая трубку с пальцем. С новым пипетки место 4 мкл смеси на сетке, полученной в 2.2.
Примечание: Коллоидный золота доступен в различных размеров и следует соблюдать осторожность, чтобы размер золота больше, чем 5 пикселей, учитывая размер пиксела микрофотографий, подлежащие обработке в приобретенной увеличением, не будучи слишком большим, чтобы скрыть особенности представляет интерес. - Подготовка окунуться заморозки аппарат; заполнить внешний контейнер замораживания с жидким азотом, а затем заполнить внутреннюю камеру с жидким этана. Прикрепите щипцы с решеткой на штока поршня и зафиксировать стержень поршня в поднятом положении.
ПРИМЕЧАНИЕ: См Янку др 20 для протокола, описывающей использование коммерческого аппарата окунуться заморозки.. - Пятно сетку тщательно касаясь кусок фильтровальной бумаги Тон не упасть образца до мениска между сеткой и фильтровальной бумаги отделяет и впитывающее на фильтровальной бумаге останавливается, то немедленно освободить стержень поршня, замораживание сетку. Осторожно снимите пинцетом из поршневого штока и поместите сетку в держатель сетки.
- Подготовка крио-ЭМ передачи станции, заполнив зоне погрузки и поглощения насоса контейнер с жидким азотом. После того, как загрузка площадь в жидком месте при температуре жидкого азота держатель сетки и микроскоп образец картридж в зоне погрузки.
- Осторожно снимите стопорное кольцо, которое либо небольшой резьбовое стопорное кольцо на ранних микроскопов Polara или клипа кольца С-стиля на более поздних моделях; разместить сетку EM в картридж с помощью щипцов, а затем аккуратно прикрепить стопорное кольцо обратно на картридже крепит сетку.
- Снимите несколько держатель образца с микроскопом и приложите его к передаточной станции. Поместите образец картридж в держатель картриджа с использованием щипцовD убрать держатель из зоны загрузки и передачи несколько держатель образца обратно в микроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ: См Чен и др 21 для визуального детализации протокола 2.1-2.9..
3. Высокая пропускная способность Автоматизированная наклона серии Коллекция
- Коллекция Низкий увеличений Карты
- Откройте новое окно Navigator, нажав "Открыть" в меню "Навигатор" в SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Найти сетки квадратов, которые содержат приемлемые условия обработки изображений (т.е., тонкий лед, нет загрязнения, предметом интереса) с помощью флуоресцентного экрана на низком увеличении (~ 2,300X для Minicell образца).
ПРИМЕЧАНИЕ: [Дополнительно:. Этот шаг может быть автоматизирован с помощью SerialEM montaging всю сетку, однако это может быть быстрее просто выбрать несколько областей вручную] - Отрегулируйте этап в eucentric высоты при наклоне держателя образца до 50 ° а затем настроитьZ-высота до ху перевода этапе минимальна между наклонными и Untilted видом.
- Переместить в центре квадрата сетки и нажмите кнопку "Добавить этап POS 'кнопку в окне Navigator, чтобы сохранить текущее положение ступени.
- Продолжить шаги 3.1.1-4 выше, пока все приемлемые этап сетки квадратов позиции не были сохранены.
- Откройте новый файл монтаж MRC, нажав «Новый монтаж» в меню "Файл". В Setup Montage Диалог, который открывается, выберите количество штук в X и Y, которые будут приобретать все сетки площадь (например, 10 х 10 для стандартного сетки 200 меш). Используйте высокую биннинга такой как 8 и выберите "Переместить Стадия Вместо Сдвиг изображения" и "Пропустить корреляции, используемые для выравнивания куски" радио-кнопки.
- В окне Navigator щелкните первую позицию ступени и установить его на быть приобретены путем проверки "Acquire" флажок. Повторите эту процедуру для каждой позиции этап в окне Навигатора,
- Откройте Навигатор приобрести диалог, нажав "Приобретать в точках 'в меню' Навигатор '. Проверьте 'Acquire изображение карты' и '' Грубый eucentricity флажок и убедитесь, что все остальные флажки сняты,. Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы собрать монтаж на каждой позиции стадии.
- Приобретение наклона серии
- В окне Navigator выберите одну из приобретенных карт и нажмите кнопку "Загрузить карту».
- В окне Navigator нажмите "Добавить Points" кнопку и выберите пункты на карте, в которой на приобретение наклона рядов. Затем нажмите кнопку "Стоп" Добавление Points кнопку. Повторите для каждой карты, собранной.
- В меню камеры выберите "Параметры" и определить параметры для режимов фокусировки, судебных и запись. [Дополнительно:. Доза на фракции данные могут быть указаны в параметрах для режима записи]
- Выберите точку в окне Navigator и проверить 'Tilt-Series9; флажок. В диалоговом окне Настройка Tilt-Series, что открывшемся меню выберите параметры, желательные для сбора наклона серии. Повторите для остальных выбранных точек в окне Navigator, но не выбрать карты.
- В меню Navigator снова выберите "приобрести в точках. В навигаторе приобрести диалоговое выберите "Выровняйте пункту", Автофокус "и" Rough eucentricity "как предварительные задач, и выберите пункт" Приобретать наклона серии "в качестве основной задачи, и выберите" Закрыть столбцов клапаны в конце ", чтобы закрыть столбец, когда все точек были собраны. По исходя наклона рядов будут собраны в каждой точке каждой карте.
4. Высокая пропускная Автоматизированная наклона серии Обработка и реконструкция Использование Tomoauto
- Коррекция Луч-индуцированного движения в доза-фракционированных данных [необязательно]
ПРИМЕЧАНИЕ: Tomoauto использует MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht~~HEAD=dobjмл), чтобы удалить движение луча, вызванного из доз на фракции микрофотографии. NOTIONCORR 16 должен быть установлен в системе.- С оригинальной наклона серии, выходной журнале от 10 SerialEM и отдельных доз фракционированы изображений всех в текущем рабочем каталоге, в терминале выполнить команду:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> это имя наклона серии, чтобы обработать.
- С оригинальной наклона серии, выходной журнале от 10 SerialEM и отдельных доз фракционированы изображений всех в текущем рабочем каталоге, в терминале выполнить команду:
- Выравнивание и реконструкция Tilt-серии
ПРИМЕЧАНИЕ: Tomoauto по умолчанию использует ИМУ 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) для обработки наклона серии автоматической генерации доверительное модели, выравнивание, определение функции передачи контраста (CTF), CTF-коррекция 23, и реконструкция. В качестве альтернативы пользователи имеют возможность в tomoauto использовать RAPTOR 24 (входит в УПМ) для автоматизированного фидуциального поколения модели, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf), чтобы определить CTF, и tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) для реконструкции или в любой комбинации программных пакетов по Конфигурация. Эта конфигурация, а также параметры, доступные в каждой упаковке обрабатывается глобальном файле конфигурации, которые могут быть отредактированы, чтобы удовлетворить значения наиболее часто используемых в лаборатории в то время как локальные файлы конфигурации также могут быть созданы для параметров подробно, используемых для конкретного экземпляра, сбор установить или индивидуального наклона серии. Все пакеты, которые желают использовать должен быть установлен в системе.- С наклона серии в текущем рабочем каталоге, в терминале выполнить команду
tomoauto --CTF --mode = выравнивание <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> является наклон серии должны быть обработаны и <fid_diam> является диатер исходных точек маркеров в нанометрах. Эта команда будет выровнять и оценить CTF из наклона серии автоматически. Можно пропустить обработку CTF путем удаления --CTF опцию из команды. - Осмотрите выровненный наклона рядов визуально каких-либо вопиющих ошибок в обработке выравнивания и проверить расчетную CTF, выполнив команды:
3dmod <имя файла> .ali
submfg <имя файла> _ctfplotter.com
соответственно, где <имя файла> является именем наклона серии без суффикса. Кроме того, проверьте вывод команды tomoauto, чтобы увидеть среднюю остаточную ошибку, порожденную выравнивания, которая является количественной статистики качества выравнивания. - Учитывая приемлемым выравнивание приступить обработку, выполнив команду:
tomoauчтобы --CTF --mode = реконструировать <filename.st> <fid_diam>
с теми же заменами пользователей, как и в 4.2.1. Эта команда будет исправить CTF, стереть координатных маркеров от наклона серии и вычислить реконструкции. Опять CTF обработки может быть пропущен, как в 4.2.1. - [опционально] Для пропуска визуальный осмотр и шаг полностью автоматизировать обработку и реконструкция выполнить команду
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [опционально] Для использования конкретного локальную конфигурацию, обратитесь к документации по tomoauto как генерировать локальный файл конфигурации, а затем выполнить команду
tomoauto [опции] -L <local_config> <filename.st> <> fid_diam
где <local_config> это имя местного конфiguration файл.
- С наклона серии в текущем рабочем каталоге, в терминале выполнить команду
5. Суб-томограмма усреднения
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем i3 пакет 15 (http://www.electrontomography.org/) для обработки суб-томограмма усреднения эксперименты, однако, описанный протокол применяется в основном к наиболее доступным суб-томограмме экспериментов процесс усреднения программное обеспечение packages16to суб-томограмма усреднения, Однако протокол, описанный относится в основном к наиболее доступным суб-томограмме усреднение программных пакетов 16-18.
- С реконструированного томограммы в текущем рабочем каталоге открыть томограмму для сбора частиц, выполнив команду:
tomopick <имя файла> .rec
где <имя файла> как в 4.2.2. В открывшемся окне используйте левую кнопку мыши, чтобы нажать на первый базальный тело, а затем кончик иглы, чтобы выбрать injectisome и использовать стрелки вверх и вниз клавиши для-рифф через срезов tomograм. Выберите все видимые injectisomes в этой манере. Это сохраняет координаты в текстовом файле, определяющие продольную ось структуры, а также оценивающие два из трех углов Эйлера, описывающая ориентацию структуры. - В вычислительном экстракт 400 3 воксельных кубики из томограммы с центром в средней точке, определенной длинной оси, выполнив команду:
клип изменения размера -CX <х> -CY <Y> -cz <г> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<имя файла> .rec <имя файла> _001.mrc
где <х>, <у>, <г> являются средняя точка координаты структуры и <имя файла> как в 4.2.2. Размер извлеченного куба должна варьироваться в зависимости от структуры и увеличении используемого, и должно быть достаточно большим, чтобы надлежащим образом заключить интересующую структуру, которая в данном примере составляет 400 3 вокселов. - Вниз выборки (BIN) суб-томограмма по четыре раза сократить время вычислений для начальной синхронизации, выполнив команду:
binvol -b 4 <имя файла> _001.mrc <имя файла> _001.bin4.mrc
где <имя файла> как в 5.2. - Применить определяется углами Эйлера для суб-томограмм и вычислить средний мировой производить начальную шаблон, выполнив команду.
I3totsum.sh - Выравнивание и классифицировать вниз, отобранных суб-томограммы с помощью двоичного классификации маску цитоплазматической области. Выполните суб-томограмма усреднения в пространстве Фурье, чтобы минимизировать недостающие клин артефакты, характерные томографии. Для биннинга 4 данные, пожалуйста, используйте SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Повторите шаг 5,5, используя суб-томограммы с пониженной частотой дискретизации с коэффициентом два (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") и еще раз с исходными данными (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Образцы минипосылок S. Флекснера были собраны и обработаны, как показано на схематическом рисунке 1, используя следующие tomoauto трубопровода, изображенной на рисунке 2. Tilt-серии были собраны с помощью SerialEM 10, что позволяет с высокой пропускной приобретения наклона серии в точках, обозначенных пользователем на картах монтаж низким увеличением (рисунок 3). Микрофотографии были собраны с использованием режима дозы фракционирования на камеру устройства прямого обнаружения для уменьшения луча, вызванного движением 22 (рисунок 4). Tomoauto координаты коррекции движения, принимая коллекцию доз фракционированы микрофотографии обработки каждый с MOTIONCORR 22 и собирает результаты в наклона серии для дальнейшей обработки (Видео 1).
Наиболее общее применение tomoauto является автоматизацС выравнивание начальной наклона серии. Tomoauto составляет последовательное выполнение необходимых команд в УПМ 13, грубо выровнять наклона рядов и генерировать начальную FIDUCIAL модель отслеживания коллоидных частиц золота в образце, которые, в свою очередь используется для создания окончательного выравнивания. Точность этого доверительного модели имеет важное значение для качества восстановленного томограммы, и таким образом, пользователь имеет возможность визуально контролировать автоматически рассчитанную FIDUCIAL модель, прежде чем приступить с реконструкцией или после, чтобы определить наклона рядов, которые должны быть обработаны вручную. Рисунок 5 показывает двух наклона серии грубо выровнены и решимости доверительное модель как генерируется tomoauto. рис 5А, C Показать наклоненного изображения и как в доверительное модели является правильным с модельными точек, сосредоточенных на координатных меток. рис 5B, D показывают соответствующие tilt- Серия в 50 градусов и в то время как модели на рис 5B рис 5D отклонились от своих соответствующих золотых маркеров и модель не подходит для тонкой выравнивания. Эта ошибка может быть измерена количественно как средняя остаточной ошибки между центром модели точки и вероятного центра золотого маркера, и tomoauto может быть сконфигурирован для предупреждения пользователя, когда погрешность измерения превышает пороговое значение определяемого пользователем, чтобы ускорить обследование. Tilt-серии, которые недостаточно выровнены автоматически, то могут быть выровнены вручную. Мы считаем, что tomoauto успешно выравнивает около 80% -90% от нашей собранной наклона серии (Видео 2).
После наклона серии успешно согласованы, то он должен быть восстановлен в конечный томограммы. Tomoauto был разработан таким образом, что пользователь может использовать УПМ 13 или 26 tomo3d генерировать конечный реконструкции. Мы в настоящее время используют тomo3d воспользоваться несколькими функциями в современных многоядерных процессоров компьютера (ЦП), чтобы значительно сократить время восстановления. Окончательный томограмма, как показано на рисунке 6 и кино 3, объем 3-D из отображаемого образца, которые затем могут быть использованы для клеточной аннотации сегментации, или к югу от томограммы среднем для получения высшего информацию о молекулярных машин в образце разрешения. Суб-томограмма усреднения увеличивается и ОСШ и уменьшает артефакты, произведенные пропавшего клина путем усреднения из высокого уровня шума в отдельных томограмм и использования большого количества суб-томограммы в хорошо распределенного множества случайных ориентаций по отношению к отсутствует клин, чтобы ограничить артефакты и улучшить окончательное решение. Средняя 2.7nm суб-томограмма неповрежденной S. Флекснера T3SS показано на рисунке 7, на хранение в EMDB (EMD-2667), который показывает большой улучшение, способный с этой техникой соmpared к injectisome отображается в одном томограммы на рис 6В.
Рисунок 1. Схематический обзор высокой пропускной крио-электронного томографии. Жидкой суспензии быстро замораживали на ЭМ сетки и набора наклона серии собирают с помощью автоматического компьютерным управлением электронного микроскопа. Полученные микрофотографии обрабатываются автоматически с помощью tomoauto генерировать томограмму. Заключительный шаг здесь сегментированный С. Флекснера минипосылка из томограммы, порожденной этим протоколом от Ху и др. 2015 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. Блок-схема Рисунок процесса tomoauto. Разбивка tomoauto процесса показывает, как данные обрабатываются из коллекции доз фракционированы микрофотографии весь путь до конечной среднем суб-томограммы. Суб-процесса символы подробно задачи, которые tomoauto координаты процесса ввода, выполнив настроенный соответствующее программное обеспечение. Символы данных показывают, выход правило, не используются пользователем, а в документе, и мульти-условные обозначения показывают выход фактически обрабатывается пользователем. Наконец отображения символов показывают, где вмешательство пользователя происходит в процессе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Пакетная приобретение наклона серии с SerialEM Navigator. Позиции монтаж карты хранятся в стадии позиций (показано selectiна) в списке окна Navigator, показанного на левой стороне экрана, и в настоящее время загруженной карте отображается в окне буфера вместе с выбранными точками помечены численно с красным крестом добавленной к карте для приобретения. Приобретение точки перечислены этикетке в окне Navigator и может быть установлен, чтобы приобрести с помощью "Наклон серия" флажок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Влияние движения коррекции данных доз на фракции. (А) показывает Untilted и без поправки микрофотография, и изображение движения коррекцией (обрабатывается MOTIONCORR) показана на (B), то контраст слегка улучшились после коррекции. Улучшение можно увидеть более, по-видимому, глядя на элемен ФурьеОРМ по микрофотографии, прежде чем (С) и после (D) коррекции движения. Изображения ЕН не показывают ту же информацию, но с наклонной микрофотографии при 60 градусах, где контраст уменьшается и кольца Thon видимые в С и D не видны при высокой наклона. Масштабная линейка 250 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Хорошие и плохие результаты tomoauto автоматизированная выравнивания наклона серии. (А) Untilted примерно выравнивается микрофотография и доверительное модель производится автоматически с помощью tomoauto. (B) определяется доверительное модель на 50 градусов наклона. Модель по-прежнему хорошо вписывается и сосредоточена на соответствующих координатных меток. (С, D) модель (A, B), соответственно, увеличенное в штучной упаковке в области. Этот наклон серии был согласован со средним остаточной ошибки 1,06 пикселей. (Е) Untilted микрофотография и доверительное модель из другого наклона серии и (F) серии в 50 градусов наклона. Здесь мы видим, что модель потерял несколько исходных точек маркеров (показано красным), и это представитель плохой автоматического отслеживания. (G, H) Показывает модель в (E, F) соответственно, увеличенной в в штучной упаковке области. Этот наклон серии был согласован со средним остаточным ошибки 3.51 пикселей и должен был быть обработаны вручную выравнивания рядов. (А) масштабную линейку 500 нм (С) Масштабная линейка 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию эта фигура.
![Рисунок 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Рисунок 6. Томограмма генерируется автоматически tomoauto. (А) Отображает проекцию семи кусочков от центра реконструкции наклона серии отображается на фиг.4А. Масштабная линейка 250 нм. (Б) увеличено в связи с коробочной области в (А) отображения нетронутыми injectisome. Масштабная линейка 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Суб-томограмма среднем неповрежденной S. Флекснера тип III системы секреции. (А) Центральный срез 2,7 нм суб-томограммы среднем неповрежденной S. Флекснера T3SS от EMDB (EMD-2667). (В) Полный проекция вдольпо оси Х от объема. (С) Isosurface рендеринга объема смотреть на контурной порога 130 в УПМ. Масштабная линейка 5 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: Анимация выровненным наклона серии (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать). Эта анимация проходит через наклона серии, как первоначально собранных SerialEM. Переводческие сдвиги легко определить по неустойчивой траектории отдельных координатных меток от изображения к изображению, и эти сдвиги наряду с менее заметные дефекты должны быть исправлены до наклона серии можно восстановить.
![Фильм 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Фильм 2: Анимация в соответствие наклона серии (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать). Эта анимация проходит через те же микрофотографии, отображаемых в кино 1 после автоматического выравнивания по tomoauto. Неустойчивый пути координатных меток следуют теперь гладкую траекторию через наклона серии, и наклон оси выровнен по вертикали по отношению к зрителю.
Фильм 3:. Анимация реконструированного наклона серии (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать) Эта анимация проходит через томограммы показано на рисунке 6 генерируется после реконструкции автоматизированной наклона серии, отображаемой в Movie 2 бу tomoauto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод высокой пропускной описано здесь позволило нам обрабатывать 1,917 крио наклона рядов и производят более 4500 суб-томограммы неповрежденной S. Флекснера injectisome 19. Собранные данные привели к подробной характеристике в месте injectisome, в том числе цитоплазматических сортировочный комплекс. Метод также используется для визуализации нескольких мутантных клеток с определенной делецией предполагаемых белковых компонентов, что позволило выяснить состав сортировки платформе injectisome. Наш метод открывает новые пути для изучения структурно-функциональных отношений в injectisome. В результате новый этап был установлен для дальнейшего рассечения механизмов, лежащих T3SS-опосредованной секреции и патогенез.
Протокол, представленные здесь описывает высокой пропускной крио-ЭТ неповрежденной S. Флекснера, но применимо к любой подходящей для проекта крио-ЭТ. Этот метод был использован в structuRAL характеристика флагеллярной мотором Borrelia burgdorferi 27, инфекция Е. палочки минипосылки по бактериофага Т7 28, и хеморецепторов массивов в E. палочка 29. По облегчения сбора больших наборов данных, можно экранировать несколько мутантов, а также изображения большого количества условиях, которые позволяют выводы динамических процессов, таких как машины сборки 27 и прогресса фаговой инфекции 28. Собирая несколько пакетов программного обеспечения и позволяет осуществлять полный контроль за исполнением обработки, пользователи могут настроить различные комбинации пакетов для достижения оптимальных результатов. Чен и др. 21, ранее опубликованные аналогичный протокол, описывающий сбор данных, используя пакет программного обеспечения Leginon 12 и автоматизации обработки наклона серии, используя УПМ 13 и 24 RAPTOR. Текущий протокол дополняет этот метод подробно альтернативный метод для совместногоllecting и обработки данных, а также показывает, насколько технологии и процедура расширенный, вызванный усилением акцента на высокого разрешения через суб-томограммы усреднения, с данными доза-фракционированного, автоматизированной CTF оценки и коррекции, и более мощным автоматизированных процедур выравнивания внутри УПМ 13. В то время как предыдущая протокол переходит в визуальных деталей с упором на сбор данных, этот метод сосредотачивается на деталях обработки собранных данных.
Методы Высокая пропускная способность позволяют массовый сбор данных, максимально использование микроскопа и компьютерных ресурсов, в то время как ограничение количества утомительных вмешательств руководство пользователя, замедлить проект и действовать в качестве основного узкое. Библиотеки оболочки tomoauto был разработан, чтобы обеспечить полный конфигурацию всех параметров, используемых в каждом пакете программного обеспечения простым и централизованным образом. После соответствующей конфигурации был определен, то тогда легко применить настройки ко всему дataset. Большинство наклона серии могут быть обработаны с приемлемыми результатами (фиг.4А), тогда как небольшое подмножество должны быть обработаны вручную. Эти наклона серии, как правило, меньше, идеальные приобретения страдают от чрезмерного сдвига изображения, плохой контраст, или отсутствие достаточных исходных точек маркеров, которые вызывает автоматическое FIDUCIAL процедуру отслеживания на провал (рис 4В). Для получения наилучших томограммы, обширная уход должно быть принято на каждом решающем шаге от пробоподготовки, приобретение изображений, обработки изображения.
В настоящее время исследованы Дальнейшее развитие высокой пропускной крио-ЭТ, такие как автоматизированное извлечение суб-томограммы путем сопоставления шаблона и интеграции современных суб-томограмме пакетов усреднение программного обеспечения, таких как Динамо в существующих трубопроводов документооборота как tomoauto. Недавнее появление прямого обнаружения камер устройств нового поколения добилась значительных улучшений в увеличении наклона серии SNR и позволяет море согласуется CTF определение в связи с более высокой эффективностью детектора. Использование новых полный золотых грид-типов может уменьшить сбора наклона серии дефектов, улучшение успеха для автоматизированной обработки наклона серии и реконструкции с меньшим необходимости ручного вмешательства 30. Наконец с предприятием повсеместное использование компьютерных кластеров и графических процессоров (GPU) для распараллеливания и ускорения обработки больших набора данных, развитие трубопроводов, которые могут использовать эти системы в ближайшее время, надеюсь, смогут сократить время выполнения от нескольких дней до часов, предоставляя пользователям еще даже меньше простоев между дизайном эксперимента и содержательного анализа данных в то же время увеличивая размер набора данных и достижения более высоких разрешениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Уильяма Марголина для комментариев. Мы благодарны за поддержку на SerialEM от доктора. Дэвид Mastronarde и Чэнь Сюй. ДМ, BH и JL были поддержаны грантом R01AI087946 из Национального института аллергии и инфекционных болезней, грантов и R01GM110243 R01GM107629 из Национального института общих медицинских наук (NIGMS), и Грант AU-1714 от Welch фонда. Прямой электронный детектор финансируется Национальным институтом здравоохранения премии S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
