우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
유형 III 분비 시스템 (T3SS)는 많은 그람 음성 병원균에 필수적인 독성 결정이다. 또한 바늘 착체라고도 injectisome은 진핵 숙주 세포를 1, 2로 박테리아에서 이펙터 단백질의 직접적인 전좌 필요한 중앙 T3SS 기계이다. injectisome가 외 바늘 기저 체 및 세포질 착체를 포함라고도 정렬 복잡한 3 등. 이전의 연구는 중요한 기초 체 단백질 (4, 5)의 원자 구조와 함께, 살모넬라 및 시겔로부터 정제 injectisomes의 3 차원 구조를 해명했다. 살모넬라, 시겔 라 (Shigella), 및 예 르시 니아에서 injectisomes의 동일계 구조 최근-ET 크라이 (6)에 의해 드러난 7. 그러나, 이펙터 선택 및 니들 어셈블리에 필수적인 세포질 단지는, 그 구조에 가시화되지 않았습니다.
곳을 알아내는 – 동부 MOS입니다(원위치) 네이티브 휴대 맥락 나노 해상도 기계 분자 이미징에 적합한 기술을 t. 그럼에도 불구하고, 극저온 동부에 의해 달성 해상도는 시편의 두께에 의해 제한된다. 단점을 극복하기 위해, 우리는 유 전적으로 크라이 동부 충분히 얇은 minicells을 생산하기 위해 수정 된 악성 시겔 flexneri 변형에 그대로 injectisomes 군데. 극저온 ET의 또 다른 한계는 매우 신속하게 샘플 고해상도 정보를 파괴 전자빔에 의한 조사에 시료의 감도이다. 적합한 투여 량은 전체 기울기 계 사이에 분산 될 수 있도록 그 결과, 매우 낮은 투여 량은 개개의 틸트 – 이미지에 사용된다. 이것은 매우 어려운 단층 소음의 다량에서 피사체의 구조적 특징을 구별 할 수있게하고 cryo-에 의해 달성 될 수있는 해상도를 제한 최종 재구성 된 신호 대 잡음비 (SNR)를 낮춘다 동부. Conventi이러한 푸리에 리얼 공간 필터로서뿐만 아니라, 다운 샘플링 ONAL 화상 처리는 콘트라스트를 높이기 위해 사용하지만, 고해상도 많은 정보를 필터링을 희생 할 수있다. 최근에는, 서브 – 단층 평균화 가능 크게 SNR을 증가시키고 서브 – 나노 미터 수준 (8, 9)에 어떤 경우에는 이후에 최종 해상도로했다. 착물의보다 상세한 분석이 가능해진다 계산적 함유 서브 단층 촬영 수천 추출하여 정렬하고 하위 단층 촬영을 평균 원래 단층 촬영 및 관심 분야는 높은 SNR 및 높은 해상도와 현장 복잡한 구조에서 결정합니다. 이러한 방법은 거대 분자 어셈블리와 네이티브 휴대 문맥에서의 동적 배좌에 더욱 통찰력을 제공하는 유전자 접근법과 통합 될 수있다.
일반적으로 수십 또는 서브 – 단층 촬영 천 수백 고 판정하기 위해 평균화 될 필요현장에서 -resolution 구조. 틸트 시리즈의 충분한 수의 인수는 서브 단층 촬영이 많은 빠르게 병목 현상이 생산하는 데 필요한. 그 결과 틸트 시리즈는 종종 재건하기 전에 정렬로 기울기 시리즈를 가지고 해결해야 빔에 의한 변화, 무대 반발뿐만 아니라, 확대, 회전 및 기울이기 결함에 의해 영향을 받는다. 틸트 시리즈는 일반적으로 또 다른 병목 현상을 일으키는 원인이 전통적으로 수동 기울기 시리즈의 검사를 통해 선택 추적 금 기준 마커,에 의해 정렬됩니다. 많은 소프트웨어 패키지 (11), (12), 틸트 계 정렬 및 재구성 (13) (14)와 서브 – 단층은 평균 15-18 컴퓨터 제어 전자 현미경 (10)을 통해 자동 기울기 계 획득을 위해 개발되어왔다. 이러한 패키지는 극저온 ET의 흐름에서 개별 작업을 처리, 그것은 SYSTEMA에 프로세스에 높은 레벨의 추상화를 구축하는 것이 바람직하게학적으로 하나의 파이프 라인으로 전체 체계를 간소화. 따라서 집중적으로 각 성분의 전체 구성을 유지하면서 간단한 사용자 조작을 허용 하나 반 자동화 기기에이 패키지의 번호를 정리하기위한 "tomoauto"소프트웨어 래퍼 라이브러리를 개발했다. 도서관은 온라인 원격 소스 코드 저장소 (http://github.com/DustinMorado/tomoauto)에 의해 오픈 소스, 잘 문서화 지속적으로 개발 및 사용을위한 자유롭게 사용할 수, 맞춤형 개발 또는 추가 통합이다.
이 높은 처리량 크라이 동부 파이프 라인 (S)에 그대로 injectisomes을 시각화하기 위해 이용되고있다 flexneri minicells. 1,917 단층 촬영의 총 서브 단층 (19)을 평균함으로써 결정 세포질 정렬 플랫폼을 포함한 컴퓨터 본래의 동일계 구조 고해상도을 드러내는,이 방법을 사용하여 생성 하였다. 함께 야생 타입 및 m-의 분자 모델링utant 기계는, 우리의 높은 처리량 파이프 라인은 네이티브 휴대 컨텍스트 손상 injectisome의 구조와 기능을 이해하기위한 새로운 수단을 제공한다.
여기에 기술 된 고 처리량 방법이 1,917 크라이 틸트 계를 처리하고 그대로 S. 4,500 이상의 서브 단층 촬영을 생성 할 수있었습니다 flexneri 19 injectisome. 수집 된 데이터는 복잡한 정렬 세포질을 포함하여 현장 injectisome에서의 세부 특성화되었다. 방법은 또한 injectisome의 정렬 플랫폼의 구성을 명료하게 도왔다 추정의 단백질 성분의 특정 결실, 여러 돌연변이 세포를 …
The authors have nothing to disclose.
우리는 의견 박사 윌리엄 Margolin 감사합니다. 우리는 박사에서 SerialEM의 지원에 감사합니다. 데이비드 Mastronarde과 첸 쑤. DM, BH와 JL은 웰치 재단 알레르기 및 전염병 국립 연구소, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS)에서 보조금 R01GM110243과 R01GM107629, 그랜트 AU-1714에서 그랜트 R01AI087946에 의해 지원되었다. 직접 전자 검출기는 건강 상 S10OD016279의 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
Centrifuge | |||
Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
Filter Paper | Whatman | #2 | |
Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
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CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
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Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |