Summary
Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.
Introduction
III sistemi di secrezione di tipo (T3SS) sono fattori di virulenza essenziali per molti patogeni Gram-negativi. Il injectisome, noto anche come il complesso dell'ago, è la macchina centrale T3SS richiesto per traslocazione diretta di proteine effettrici del batterio in cellule ospiti eucariotiche 1, 2. Il injectisome comprende un ago extracellulare, un corpo basale, e un complesso citoplasmatico anche noto come il complesso di smistamento 3. Precedenti studi hanno chiarito le strutture 3-D di injectisomes purificati da Salmonella e Shigella, insieme con le strutture atomiche delle principali proteine del corpo basale 4, 5. Recente in strutture in situ di injectisomes da Salmonella, Shigella, e Yersinia sono stati rivelati da crio-ET 6 , 7. Tuttavia, il complesso citoplasmatico, essenziale per la selezione effettrici e gruppo aghi, non è stata visualizzata in quelle strutture.
Cryo-ET è il MOSt tecnica adatta per l'imaging macchinario molecolare presso risoluzione nanometrica all'interno del suo contesto cellulare nativo (in situ). Tuttavia, la risoluzione ottenibile da crio-ET è limitata dalla spessore del provino. Per superare l'inconveniente, abbiamo ripreso injectisomes intatti in una virulenta Shigella flexneri ceppo che è stato geneticamente modificato per produrre minicells abbastanza sottili per crio-ET. Un altro limite di crio-ET è la sensibilità del campione alla radiazione indotta dal fascio di elettroni, che distrugge rapidamente le informazioni ad alta risoluzione nel campione. Come risultato, estremamente basse dosi sono utilizzati per le singole tilt-immagini in modo che una dose adatta può essere distribuito tra l'inclinazione completa serie. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore (SNR) nella ricostruzione finale, il che rende difficile distinguere le caratteristiche strutturali del soggetto dalla grande quantità di rumore nel tomogramma e limita la risoluzione che può essere ottenuta da cryo- ET. Conventielaborazione delle immagini onal quali Fourier e filtri dello spazio reale e giù campionamento può essere utilizzato per aumentare il contrasto, ma a scapito di filtrare gran parte delle informazioni ad alta risoluzione. Recentemente, sub-tomogram media ha consentito di aumentare notevolmente il SNR e successivamente la risoluzione finale in alcuni casi a livelli sub-nanometri 8, 9. Un'analisi più dettagliata dei complessi è reso possibile da computazionalmente estraendo migliaia di sub-tomogrammi contenenti le aree di interesse dalle tomografie originale e quindi allineando e media i sub-tomografie per determinare in strutture complesse in situ con maggiore SNR e una risoluzione più alta. Questi metodi possono essere integrati con approcci genetici per fornire ancora maggiori intuizioni in assemblee macromolecolari e le loro conformazioni dinamici nel contesto cellulare nativo.
In generale, decine o centinaia di migliaia di sub-tomogrammi devono essere mediati per determinare altostrutture -Risoluzione in situ. L'acquisizione di un numero sufficiente di tilt serie necessaria per produrre questo grande numero di sotto-tomografie diventa rapidamente un collo di bottiglia. Il conseguente inclinazione della serie sono spesso risente spostamento fascio indotta, fase contraccolpo, e ingrandimento, rotazione e inclinazione difetti, che deve essere risolto per portare l'inclinazione serie in allineamento prima ricostruzione. La serie inclinazione è tipicamente allineato tracciando marker fiduciali oro, che sono tradizionalmente selezionabili manualmente attraverso l'ispezione del tilt-serie, causando ancora un altro collo di bottiglia. Molti pacchetti software sono stati sviluppati per automatiche di acquisizione tilt-serie attraverso microscopi elettronici controllati da computer 10, 11, 12, allineamento tilt-serie e la ricostruzione 13, 14 e sub-tomogramma media 15-18. Poiché questi pacchetti gestiscono operazioni discreti nel flusso di crio-ET, diventa desiderabile costruire un livello più elevato di astrazione nel processo per systemacamente snellire l'intero schema in una singola pipeline. Pertanto, abbiamo sviluppato una libreria wrapper software "tomoauto" progettato per organizzare una serie di questi pacchetti in una singola unità semi-automatico, consentendo funzionamento semplice utente, pur mantenendo la configurazione completa di ciascun componente in modo centralizzato. La biblioteca è open-source, ben documentato, continuamente sviluppato e liberamente disponibili per l'uso, lo sviluppo su misura o una maggiore integrazione per mezzo di un codice sorgente remota repository online (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Questo high-throughput crio-ET gasdotto è stato utilizzato per visualizzare injectisomes intatti a S. minicells flexneri. Un totale di 1.917 tomografie sono stati generati utilizzando questo metodo, rivelando una ad alta risoluzione nella struttura situ della macchina intatta tra cui la piattaforma di smistamento citoplasmatica determinato dal sub-tomogramma media 19. Insieme alla modellistica molecolare di wild-type e mmacchine utant, la nostra pipeline high-throughput fornisce una nuova strada per comprendere la struttura e la funzione del injectisome intatto nel contesto cellulare nativo.
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Protocol
1. Minicell Preparazione
- Per rendere S. minicells flexneri, trasformano 1 ml di plasmide pBS58, che esprime costitutivamente geni divisione cellulare Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ da un basso copy spectinomicina resistente plasmide in 5 microlitri electrocompetent streptomicina resistente sierotipo 5a (M90T-Sm), le cellule di elettroporazione a 2,5 kV per 5 msec a 1 mm cuvette.
- Conservare i campioni minicell a -80 ° C in 15% glicerolo in una provetta da 1,5 ml criogenico. Quando si è pronti per l'uso, raschiare circa 5 ml di cellule dalla provetta unthawed con un puntale e sospendere le cellule in 4 ml di brodo di soia trittico con spectinomicina aggiunto a 100 mg / ml di concentrazione. Crescere O / N a 37 ° C.
- Pipettare 2 ml di cultura da 1,2 in 200 ml di brodo di soia trittico con spectinomicina ancora aggiunti a 100 mcg / ml concentrazioni. Crescere a 37 ° C per fase di log in ritardo.
- Per arricchire minicells, centrifuga200 ml di coltura da 1,3 a 1000 xg per 5 min. Versare con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e centrifugare a 20.000 g per 10 min. Versare con cautela e scartare il surnatante, e mescolare delicatamente il pellet con il liquido restante con un puntale e trasferire circa 100 ml di miscela di pellet in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
2. EM griglia Preparazione
- Posizionare un lato pellicola di carbonio da 200 maglie carbonio griglia di rame R2 / 2 bucata su un vetrino.
NOTA: A / 2 griglia 200 mesh R2 è scelto per massimizzare il numero di tilt-serie che può essere impostato per acquisire in un unico quadrato della griglia supportando allo stesso tempo il campione e posizionando il bordo della pellicola di carbonio nel campo della telecamera Allo ingrandimento desiderato. Griglie maglie più fini e film di carbonio bucata più piccoli come R1.2 / 1.3 400-rete può essere utilizzato per i campioni imaged a maggiore ingrandimento; più grandi film di carbonio bucata quali R3.5 / 1 200-maglia può essere usod per campioni ripreso a ingrandimento minore o se la micrografia non deve contenere il bordo carbonio e carbonio film bucata con spaziatura più grande come R1 / 4 200 mesh può essere usato per aiutare con l'allineamento della fase alla zona di interesse e proteggere aree da sovraesposizione nella messa a fuoco e il monitoraggio di routine. - Posizionare il vetrino sulla piattaforma in un dispositivo di scarica a bagliore.
NOTA: Usiamo un dispositivo in-casa in cui un anodo e la piattaforma è stato lavorato in un essiccatore a vuoto ed è alimentato da un generatore ad alta frequenza. Dopo aver creato il vuoto, collegare la sonda generatore ad alta frequenza per l'anodo e accendere la sonda per 1 min per Glow Discharge griglia. Il tempo necessario per Glow Discharge rete può variare da pochi secondi a un minuto. Variando il tempo di scarica luminescente può essere utilizzato per diagnosticare problemi di concentrazione del campione e le griglie che appaiono a secco senza ghiaccio vitreo. - Rimuovere la griglia con un set di pinze, e bloccare le pinze chiuse con un b elasticoe.
- Aggiungere 100 ml di soluzione di 10 nm oro colloidale per la provetta con le minicells preparati in 1.4 e mescolare muovendo delicatamente il tubo con un dito. Con un nuovo posto pipetta 4 microlitri della miscela sulla griglia preparata in 2.2.
NOTA: oro colloidale è disponibile in una varietà di formati e si deve prestare attenzione che la dimensione del oro è maggiore di 5 pixel date le dimensioni dei pixel delle micrografie da trattare con l'ingrandimento acquisito, pur non essendo troppo grande per caratteristiche oscure di interesse. - Preparare l'apparato tuffo antigelo; riempire il contenitore esterno di congelamento con azoto liquido e poi riempire la camera interna con etano liquido. Fissare la pinza con griglia per lo stantuffo e bloccare lo stantuffo nella posizione sollevata.
NOTA: Vedere Iancu et al 20 per un protocollo che descrive l'uso di un apparato affondamento freeze commerciale.. - Tamponare la griglia toccando attenzione un pezzo di carta da filtro a tegli goccia del campione fino menisco tra le separa griglia e carta da filtro e la traspirazione sulla carta da filtro ferma, quindi rilasciare immediatamente lo stantuffo, il congelamento della griglia. Rimuovere con cautela la pinza dal stantuffo e posizionare la griglia in un supporto griglia.
- Preparare la stazione di trasferimento Cryo-EM riempiendo il contenitore pompa zona di carico e l'assorbimento di azoto liquido. Una volta che la zona di carico è al liquido posto temperatura dell'azoto titolare griglia e una cartuccia esemplare microscopio nella zona di carico.
- Rimuovere con attenzione l'anello di bloccaggio, che può essere un piccolo anello di bloccaggio a vite sui microscopi Polara precedenti o una clip anello C-stile sui modelli successivi; posizionare la griglia EM nella cartuccia con pinze e quindi ricollegare delicatamente la ghiera indietro sulla cartuccia di fissaggio della griglia.
- Rimuovere il supporto del campione multiplo dal microscopio e fissarlo alla stazione di trasferimento. Posizionare la cartuccia del campione nel supporto con pinze Cartuccia Unad retrarre il supporto dalla zona di carico e trasferire il portacampioni multipli al microscopio.
NOTA: Vedere Chen ed altri 21 per un protocollo visivo dettagli 2,1-2,9..
3. Alta produttività automatizzata Tilt-Series Collection
- Raccolta di basso ingrandimento Maps
- Aprire una nuova finestra di navigazione cliccando su 'Open' nel menu 'Navigator' di SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Trova quadrati della griglia che contengono condizioni di imaging accettabili (cioè, ghiaccio sottile, nessuna contaminazione, oggetto di interesse) utilizzando lo schermo fluorescente a basso ingrandimento (~ 2,300X per il campione Minicell).
NOTA: [Facoltativo:. Questa fase può essere automatizzato con SerialEM dal montaging l'intera griglia, ma può essere più veloce per selezionare semplicemente alcune aree manualmente] - Regolare la fase di altezza eucentrico inclinando il titolare del campione a 50 ° quindi regolarelo z-altezza fino a quando la traduzione xy del palco è minima tra i punti di vista inclinato e ruotato.
- Spostare al centro della piazza della griglia e fare clic sul pulsante 'Aggiungi tappa Pos' nella finestra Navigator per memorizzare la posizione attuale fase.
- Continuare passi 3.1.1-4 sopra fino a quando sono stati salvati tutti i posti quadrati della griglia palco accettabili.
- Aprire un nuovo file di montaggio MRC cliccando su 'Nuovo montage' nel menu 'File'. Nella finestra di dialogo di installazione in sequenza che si apre, selezionare un numero di pezzi in X e Y che acquisirà tutta la piazza della griglia (ad esempio, 10 x 10 per una griglia di 200 rete standard). Utilizzare un alto binning come 8 e selezionare il 'Sposta fase Invece di spostamento dell'immagine' e 'Vai correlazioni usate per allineare pezzi' pulsanti di opzione.
- Nella finestra di Navigator fare clic sulla prima posizione di fase e impostare da acquisire selezionando la casella 'Acquire'. Ripetere questa operazione per ciascuna posizione fase della finestra del navigatore.
- Aprire il Navigatore Acquire dialogo facendo clic su 'Acquire a Punti' nel menu 'Navigator'. Controllare l''immagine della mappa Acquire' e casella 'eucentricity ruvida' e fare in modo che tutte le altre caselle di controllo siano deselezionate. Fare clic su 'Procedi' per raccogliere un montaggio in ogni posizione fase.
- Tilt-series Acquisizione
- Nella finestra del Navigatore selezionare una delle carte acquisite e fare clic sul pulsante 'Carica mappa'.
- Nella finestra del navigatore cliccare su 'Aggiungi punti "pulsante e selezionare i punti nella mappa in cui acquisire un tilt-series. Quindi fare clic sul 'smettere di aggiungere punti "pulsante. Ripetere per ogni mappa raccolti.
- Nel menu Fotocamera selezionare "Parametri" e definire i parametri per le modalità di messa a fuoco, di sperimentazione, e Record. [Opzionale:. Dose-frazionata i dati possono essere specificati nei parametri per la modalità Record]
- Selezionare un punto nella finestra Navigatore e controllare il 'Tilt-Series9; casella di controllo. Nella finestra di dialogo Imposta Tilt-Series che si apre selezionare i parametri desiderati per la raccolta di inclinazione della serie. Ripetere l'operazione per il resto dei punti selezionati nella finestra del Navigatore, ma non selezionare le mappe.
- Nel menu Navigator di nuovo selezionare il 'Acquire a punti'. Nella Navigator Acquisisci finestra scegliere 'Riallineare alla voce', messa a fuoco automatica 'e' eucentricity Ruvido 'come operazioni preliminari, e selezionare' Acquire serie tilt 'come il compito primario, e selezionare' Chiudere le valvole delle colonne di fine 'per chiudere la colonna quando tutto dei punti sono stati raccolti. Al momento di procedere un'inclinazione serie saranno raccolti in ogni punto in ogni mappa.
4. Alto-throughput automatizzata Tilt-series di elaborazione e ricostruzione Utilizzando Tomoauto
- Correzione di movimento del fascio-indotta nei dati dose-frazionati [opzionale]
NOTA: Tomoauto utilizza MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) per rimuovere il movimento fascio indotta da micrografie di dose frazionata. NOTIONCORR 16 deve essere installato sul sistema.- Con l'inclinazione della serie originale, il registro di output da SerialEM 10 e le singole immagini di dose-frazionata tutto nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> è il nome del tilt-serie da elaborare.
- Con l'inclinazione della serie originale, il registro di output da SerialEM 10 e le singole immagini di dose-frazionata tutto nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando:
- Allineamento e Ricostruzione di Tilt-series
NOTA: Tomoauto di default usa IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) per gestire tilt-serie generazione del modello fiduciale automatizzato, l'allineamento, la determinazione della funzione di trasferimento di contrasto (CTF), CTF-23 la correzione, e ricostruzione. In alternativa, gli utenti hanno la possibilità di tomoauto per usare RAPTOR 24 (incluso nel IMOD) per automatizzata generazione del modello fiduciale, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) per determinare la CTF, e tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) per la ricostruzione o in qualsiasi combinazione di pacchetti software per configurazione. Questa configurazione, così come i parametri disponibili in ogni pacchetto è gestito da un file di configurazione globale che può essere modificato per soddisfare i valori più comunemente utilizzati in un laboratorio mentre i file di configurazione locali possono anche essere creati per i parametri di dettaglio utilizzati per uno specifico esemplare, di raccolta impostare o individuale di inclinazione della serie. Tutti i pacchetti che desiderano essere utilizzati devono essere installati sul sistema.- Con l'inclinazione della serie nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando
tomoauto --CTF --mode = align <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> è l'inclinazione della serie per essere elaborati e <fid_diam> è il Diameter dei marcatori di riferimento nel nanometri. Questo comando allineerà e stimare la CTF dell'inclinazione serie automaticamente. È possibile saltare elaborazione CTF rimuovendo l'opzione --CTF dal comando. - Controllare l'inclinazione-serie allineata visivamente per eventuali errori evidenti nella lavorazione di allineamento e ispezionare la CTF stimato eseguendo i comandi:
3dmod <filename> .ali
submfg <filename> _ctfplotter.com
rispettivamente, dove <nomefile> è il nome del tilt-serie senza suffisso. Controllare anche l'uscita del comando tomoauto vedere l'errore medio residuo generato dalla allineamento, che è una statistica quantitativa della qualità dell'allineamento. - Dato un allineamento accettabile procedere lavorazione eseguendo il comando:
tomoaua --CTF --mode = ricostruire <filename.st> <fid_diam>
con le stesse sostituzioni utente come in 4.2.1. Questo comando correggerà la CTF, cancellare i marker fiduciali dalla inclinazione della serie e calcolare la ricostruzione. Anche in questo caso l'elaborazione CTF può essere saltata come al punto 4.2.1. - [opzionale] Per saltare la fase di ispezione visiva e automatizzare completamente l'elaborazione e la ricostruzione eseguire il comando
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [opzionale] Per utilizzare una configurazione locale specifica, consultare la documentazione tomoauto su come generare un file di configurazione locale, e poi eseguire il comando
tomoauto [opzioni] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
dove <local_config> è il nome del locale confil file della configurazione della.
- Con l'inclinazione della serie nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando
5. Sub-tomogramma Averaging
NOTA: Usiamo il pacchetto i3 15 (http://www.electrontomography.org/) per elaborare esperimenti di calcolo della media sub-tomogramma, ma il protocollo descritto si applica generalmente alla maggior parte disponibili sub-tomogramma esperimenti processo software media packages16to sub-tomogram delle medie, tuttavia il protocollo descritto si applica generalmente alla maggior parte dei pacchetti software media disponibili sub-tomogramma 16-18.
- Con il tomogramma ricostruito nella directory di lavoro corrente aprire il tomogramma per il prelievo delle particelle eseguendo il comando:
tomopick <filename> .rec
dove <nome file> è come in 4.2.2. Nella finestra che si apre con il tasto sinistro del mouse per fare clic sul primo corpo basale e poi la punta dell'ago per selezionare un injectisome e utilizzare i tasti freccia su e giù per riff attraverso le fette della tomografiam. Seleziona tutti injectisomes visibili in questo modo. Ciò memorizza le coordinate in un file di testo che definiscono l'asse longitudinale della struttura così come stima due dei tre angoli di Eulero che descrive l'orientamento della struttura. - Estratto computazionalmente 400 3 cubetti di voxel del tomogramma centrato nel punto centrale dell'asse lungo definito eseguendo il comando:
clip di ridimensionamento -cx <x> -cy <y> -cz <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<filename> .rec <filename> _001.mrc
dove <x>, <y>, <z> sono le coordinate del punto medio della struttura e <filename> è come in 4.2.2. La dimensione del cubo estratto dovrebbe variare la struttura e l'ingrandimento utilizzato, e dovrebbe essere sufficientemente grande da includere adeguatamente la struttura di interesse, che per questo esempio è di 400 3 voxel. - Down-campione (bin) il sub-tomogramma di un fattore di quattro per ridurre il tempo di calcolo per allineamento iniziale eseguendo il comando:
binvol -b 4 <filename> _001.mrc <filename> _001.bin4.mrc
dove <nome file> è come in 5.2. - Applicare la determinata angoli di Eulero a sub-tomogrammi e calcolare la media globale per produrre il modello iniziale per eseguire il comando.
I3totsum.sh - Allineare e classificare down-campione sotto-tomogrammi utilizzando una maschera classificazione binaria dell'area citoplasmatica. Eseguire sub-tomogramma media nello spazio di Fourier per ridurre al minimo i mancanti manufatti cuneo caratteristici della tomografia. Per binning 4 dati, si prega di utilizzare SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Ripetere il punto 5.5 con sub-tomogrammi down-campionati di un fattore di due (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") e ancora una volta con i dati originali (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
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Representative Results
Campioni di minicells S. flexneri stati raccolti e trattati come indicato in figura 1 utilizzando tomoauto schema seguente pipeline descritto nella figura 2. Tilt-series sono stati raccolti utilizzando SerialEM 10, che permette di high-throughput acquisizione tilt serie nei punti designati da parte dell'utente su mappe montaggio a basso ingrandimento (Figura 3). Micrografie sono stati raccolti utilizzando la modalità dose frazionamento su una fotocamera del dispositivo di rilevamento diretto per ridurre fascio indotta movimento 22 (Figura 4). Tomoauto coordina la correzione del movimento di prendere una collezione di microscopio di dose-frazionata elaborazione ognuna con MOTIONCORR 22 e assembla i risultati in una inclinazione della serie a essere ulteriormente elaborati (Film 1).
L'applicazione più generale è tomoauto i automatic allineamento di un tilt-prima serie. Tomoauto compone esecuzione sequenziale dei comandi necessari IMOD 13 per allineare grossolanamente l'inclinazione serie e generare un modello fiducial iniziale monitoraggio delle particelle di oro colloidale nel campione, che sono a loro volta utilizzate per generare l'allineamento finale. La precisione di questo modello fiducial è essenziale per la qualità della tomogram ricostruito, e quindi l'utente è in grado di ispezionare visivamente il modello fiducial calcolati automaticamente prima di procedere alla ricostruzione o successivamente per identificare tilt-serie che devono essere trattati manualmente. La figura 5 mostra due tilt-series grossolanamente-allineati e il modello fiduciale determinato come generato da tomoauto. Figure 5A, C mostrano le immagini ruotato e sia nel modello di fiduciale è corretto con punti modello centrate su marker fiduciali. Figure 5B, D mostrano il corrispondente TILT- serie a 50 gradi e mentre il modello in figura 5B nella Figura 5D sono allontanati dai loro indici in oro corrispondenti e il modello non è adatto per l'allineamento bene. Questo errore può essere misurata quantitativamente come l'errore medio residua tra il centro del punto di modello ed il centro probabile del marcatore oro e tomoauto può essere configurato per avvisare l'utente quando l'errore di misura supera una soglia definita dall'utente per accelerare l'ispezione. Tilt-serie che non sono sufficientemente allineati automaticamente può quindi essere allineato manualmente. Troviamo che tomoauto allinea con successo circa l'80% -90% del nostro raccolto tilt-series (Movie 2).
Dopo un tilt-serie è stata allineata correttamente, deve essere ricostruito nel tomogramma finale. Tomoauto è stato progettato in modo che l'utente può utilizzare IMOD 13 o tomo3d 26 per generare la ricostruzione finale. Al momento stiamo utilizzando tomo3d per sfruttare diverse funzioni nelle moderne multi-core unità di elaborazione del computer (CPU) per ridurre notevolmente il tempo di ricostruzione. Il tomogram finale come mostrato nella Figura 6 e film 3 è un volume di 3-D del campione ripreso che può quindi essere utilizzato per l'annotazione cellulare mediante segmentazione, o sub-tomogram media per ottenere maggiore informazione risoluzione del macchinario molecolare all'interno del campione. Sub-tomogramma aumenta calcolo della media sia il SNR e diminuisce i manufatti prodotti dalla mancanza cuneo facendo una media di più alti livelli di rumore nei singoli tomogrammi e utilizzando i numeri grandi sub-tomogrammi in un insieme ben distribuito di orientazioni casuali rispetto alla mancante cuneo per limitare artefatti e migliorare la risoluzione finale. La media 2.7nm sub-tomogramma del intatto S. flexneri T3SS è mostrato in Figura 7 come depositato nella EMDB (EMD-2667), che mostra il grande miglioramento capace con questa tecnica compared al injectisome visualizzato in un unico tomogramma nella Figura 6B.
Figura 1. Schema di alta produttività crioelettronica tomografia. Una sospensione liquida viene velocemente congelata su una griglia EM e una serie di tilt-serie è raccolto da un microscopio elettronico automatico controllato da computer. Le micrografie risultanti vengono elaborati automaticamente utilizzando tomoauto per generare il tomogramma. Il passo finale: ecco un S. segmentato minicell flexneri da un tomogramma generato da questo protocollo da Hu et al. 2015 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Diagramma di flusso di processo tomoauto. L'analisi del flusso di lavoro tomoauto mostra come i dati vengono elaborati da una collezione di microscopio di dose-frazionata fino a una media finale sub-tomogramma. Simboli sottoprocesso dettaglio i compiti che tomoauto coordinate per elaborare l'input eseguendo il software appropriato configurato. Simboli dati mostrano uscita generalmente utilizzato dall'utente, mentre i simboli di documenti e multi-documenti mostrano l'output effettivamente gestito dall'utente. Infine vengono visualizzati simboli mostrano dove si verifica l'intervento dell'utente nel flusso di lavoro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Batch acquisizione tilt-serie con SerialEM Navigator. Posizioni di mappe montaggio vengono memorizzati come posizioni di scena (mostrato selectie) nella lista della finestra Navigator mostrato sul lato sinistro dello schermo, e la mappa attualmente caricata viene visualizzata nella finestra cuscinetto lungo i punti selezionati etichettati numericamente con una croce rossa aggiunti alla mappa per acquisizione. Punti di rilevazione sono elencati per l'etichetta nella finestra di navigazione e può essere impostato per l'acquisizione tramite la casella di controllo "della serie Tilt". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Effetto del movimento di correzione sui dati di dose-frazionata. (A) mostra una micrografia ruotato e non corretta, e l'immagine del movimento con correzione (elaborati da MOTIONCORR) è mostrato in (B), il contrasto è leggermente migliorata dopo la correzione. Il miglioramento può essere visto più apparentemente guardando la transf Fourierorm della micrografia prima (C) e dopo (D) Correzione movimento. Immagini EH mostrano le stesse informazioni, ma con una microfotografia inclinata a 60 gradi, dove il contrasto è diminuita e anelli Thon visibili in C e D non sono più visibili ad alta inclinazione. Barra di scala 250 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Buoni e cattivi risultati di tomoauto automatico allineamento tilt-series. (A) Un ruotato micrografia all'incirca allineata e il modello fiduciale prodotta automaticamente utilizzando tomoauto. (B) Il modello fiduciale determinato a 50 gradi di inclinazione. Il modello si adatta ancora ben ed è centrata sul appositi marker fiduciali. (C, D) in (A, B), rispettivamente, ingrandita alla zona in scatola. Questo tilt-serie è stata allineata con un errore medio residua di 1,06 pixel. (E) Un microscopio ruotato e il modello fiduciale da un altro tilt della serie e (F) della serie a 50 gradi di inclinazione. Qui vediamo che il modello ha perso le tracce di diversi marker fiduciali (mostrato in rosso) e questo è rappresentativo di un monitoraggio automatizzato cattivo. (G, H) mostra il modello a (E, F), rispettivamente, ingrandita alla zona in scatola. Questo tilt-serie è stata allineata con un errore medio residua di 3,51 pixel e doveva essere trattati da allineamento manuale della serie. Bar (A) Scala 500 nm (C) Scala bar 50 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.
![Figura 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figura 6. Tomogramma generato automaticamente dal tomoauto. (A) Questo visualizza una proiezione di sette fette dal centro della ricostruzione del tilt serie mostrata in Figura 4A. Scale bar 250 nm. (B) A ingrandita vista della zona in scatola in (A) visualizzando un injectisome intatto. Barra di scala 100 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura media 7. Sotto-tomogramma di intatto S. flexneri tipo III sistema di secrezione. (A) fetta centrale della media sub-tomogramma 2.7 nm del intatto S. flexneri T3SS da EMDB (EMD-2667). (B) proiezione completa lungol'asse X del volume. (C) isosurface resa del volume visualizzato ad una soglia di contorno 130 in IMOD. Barra di scala 5 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1: Animazione di unaligned tilt-series (clic destro per il download). Questa animazione attraversa l'inclinazione della serie come inizialmente raccolte da SerialEM. Turni traslazionali sono facilmente identificabili dal percorso erratico dei singoli marcatori fiduciali da immagine a immagine, e questi cambiamenti con difetti meno evidenti devono essere corretti prima che l'inclinazione della serie può essere ricostruito.
![Movie 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Movie 2: Animazione di allineato tilt-series (clic destro per il download). Questa animazione passa attraverso gli stessi micrografie visualizzati in Movie 1 dopo l'allineamento automatico per tomoauto. I percorsi erratici di marker fiduciali ora seguono una traiettoria regolare attraverso l'inclinazione della serie, e l'inclinazione asse è allineato verticalmente rispetto allo spettatore.
Movie 3:. Animazione di ricostruito tilt-series (clic destro per il download) Questa animazione attraversa il tomogramma mostrata in figura 6 generato ricostruzione dopo automatizzata del tilt-serie visualizzato in Movie 2 btomoauto y.
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Discussion
Il metodo di alto-rendimento descritto qui ci ha permesso di elaborare 1.917 crio tilt-serie e produrre oltre 4.500 sub-tomogrammi del intatto S. flexneri injectisome 19. I dati raccolti hanno portato alla caratterizzazione dettagliata di in situ injectisome, tra cui il citoplasmatica di ordinamento complesso. Il metodo è stato utilizzato anche per visualizzare varie cellule mutanti con specifico delezione di componenti proteiche putativi, che ha contribuito a chiarire la composizione della piattaforma di ordinamento della injectisome. Il nostro metodo ha fornito nuove strade per indagare il rapporto struttura-funzione della injectisome. Di conseguenza, la nuova scena era pronta per un'ulteriore dissezione dei meccanismi alla base della secrezione T3SS-mediata e la patogenesi.
Il protocollo presentato qui descrive high-throughput crio-ET di intatto S. flexneri, ma è applicabile a qualsiasi progetto adatto per crio-ET. Questo metodo è stato utilizzato nel structuCaratterizzazione ral del motore flagellare di Borrelia burgdorferi 27, l'infezione di E. coli minicells di batteriofago T7 28, e array chemocettoriali a E. coli 29. Per facilitare la raccolta di enormi set di dati, è possibile schermare mutanti multipli così come immagine di un gran numero di condizioni che permettono inferenze di processi dinamici quali montaggio della macchina 27 e l'avanzamento del fago infezione 28. Con la raccolta di più pacchetti software e consentendo il pieno controllo esecuzione elaborazione, gli utenti sono in grado di personalizzare diverse combinazioni di pacchetti per ottenere risultati ottimali. Chen et al. 21 precedentemente pubblicato con un protocollo simile che descrive la raccolta dei dati utilizzando il pacchetto software Leginon 12 e automatizzando l'elaborazione tilt-serie con IMOD 13 e 24 RAPTOR. L'attuale protocollo integra questo metodo in dettaglio un metodo alternativo per codati llecting e di elaborazione, mentre anche che mostra quanto la tecnologia e la procedura è avanzata, guidato dal maggiore attenzione ad alta risoluzione attraverso sub-tomogramma media, con i dati di dose-frazionata, stima CTF automatica e la correzione, e più robuste procedure di allineamento automatici all'interno IMOD 13. Mentre il protocollo precedente va in dettaglio visivo con particolare attenzione alla raccolta dei dati, questo metodo si concentra sui dettagli del trattamento dei dati raccolti.
Metodi-throughput elevato consentono la raccolta di dati enorme che massimizzare l'utilizzo delle risorse microscopio e computer, mentre limitando la quantità di interventi dell'utente manuali ripetitive che rallentano il progetto e ad agire come un serio ostacolo. Il tomoauto libreria wrapper è stato progettato per consentire la configurazione completa di tutti i parametri utilizzati in ogni pacchetto software in modo semplice e centralizzato. Una volta che una configurazione adatta è stata determinata, è quindi facile da applicare le impostazioni per tutta dataset. La maggioranza del tilt-serie può essere elaborato con risultati accettabili (Figura 4A), mentre è previsto un sottoinsieme minore da elaborare manualmente. Questi tilt-series sono di solito acquisizioni meno ideali afflitto da un eccessivo spostamento immagine, poco contrasto, o una mancanza di marker fiduciali sufficienti che fa sì che la routine di rilevamento automatico fiduciale a fallire (Figura 4B). Per ottenere i migliori possibili tomografie, vasta è necessario prestare attenzione a ogni passo cruciale dalla preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini, per l'elaborazione delle immagini.
Ulteriori sviluppi in high-throughput crio-ET come l'estrazione sub-tomogramma automatizzato da template matching e l'integrazione dei moderni pacchetti software di media sub-tomogramma come Dynamo nelle pipeline di flusso di lavoro esistenti, come tomoauto sono ora oggetto di indagine. Il recente avvento di nuova generazione telecamere dispositivo di rilevazione diretta ha fatto importanti miglioramenti per aumentare tilt serie SNR e consentendo more determinazione CTF coerente a causa della maggiore efficienza del rivelatore. L'uso di nuovi tipi di rete-pieno d'oro può diminuire i difetti di raccolta tilt-serie, il miglioramento del tasso di successo per l'elaborazione automatizzata di inclinazione della serie e la ricostruzione con minore necessità di intervento manuale 30. Infine, con l'uso ormai onnipresente di cluster di computer e unità di elaborazione grafica (GPU) per parallelizzare e velocizzare grande elaborazione di dati, lo sviluppo di gasdotti che possono utilizzare questi sistemi sarà presto speriamo in grado di ridurre i tempi di esecuzione da giorni a ore, fornendo agli utenti ancora ancora meno tempi morti tra progettazione esperimento e l'analisi dei dati significativi, pur aumentando la dimensione del set di dati e di raggiungere risoluzioni più elevate.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. William Margolin per i commenti. Siamo grati per il sostegno su SerialEM da Drs. David Mastronarde e Chen Xu. DM, BH e JL sono stati sostenuti da Grant R01AI087946 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive, Grants R01GM110243 e R01GM107629 presso l'Istituto Nazionale di scienze mediche generali (NIGMS), e Grant AU-1714 dalla Fondazione Welch. Il rivelatore di elettroni diretto è stato finanziato dal National Institutes of Health Award S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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