Summary
Nous présentons un protocole sur la façon d'utiliser à haut débit tomographie cryo-électronique pour déterminer haute résolution dans les structures in situ de machines moléculaires. Le protocole permet de grandes quantités de données à traiter, évite les goulots d'étranglement communs et de réduire l'indisponibilité des ressources, permettant à l'utilisateur de se concentrer sur des questions biologiques importantes.
Introduction
III systèmes de sécrétion de type (T3SS) sont des déterminants de virulence essentiels pour de nombreux agents pathogènes Gram-négatifs. Le injectisome, également connu sous le complexe d'aiguille, est la machine de SST3 central nécessaire pour la translocation directe de protéines effectrices de la bactérie dans des cellules hôtes eucaryotes 1, 2. L'injectisome comprend une aiguille extracellulaire, un corps de base, et un complexe cytoplasmique également connue comme le complexe de tri 3. Des études antérieures ont permis d'élucider les structures 3-D de injectisomes purifiés de Salmonella et Shigella, ainsi que les structures atomiques de protéines majeures basale du corps 4, 5. Récente dans les structures in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella, et Yersinia ont été révélés par cryo-ET 6 , 7. Cependant, le complexe cytoplasmique, essentielle pour la sélection d'effecteur et ensemble d'aiguille, n'a pas été visualisées dans ces structures.
Cryo-ET est le most technique convenable pour l'imagerie de machinerie moléculaire à une résolution nanométrique dans son contexte natif cellulaire (in situ). Néanmoins, la résolution obtenue par cryo-ET est limitée par l'épaisseur de l'échantillon. Pour pallier l'inconvénient, nous imagé injectisomes intactes dans une souche de Shigella flexneri virulente qui a été génétiquement modifié pour produire minicellules suffisamment minces pour la cryo-ET. Une autre limitation de cryo-ET est la sensibilité de l'échantillon au rayonnement induit par le faisceau d'électrons, qui détruit très rapidement l'information à haute résolution dans l'échantillon. En conséquence, des doses extrêmement faibles sont utilisés pour le basculement-images individuelles de telle sorte qu'une dose appropriée peut être répartie entre l'inclinaison de la série complète. Cela réduit considérablement le rapport signal sur bruit (SNR) dans la reconstruction finale, ce qui rend difficile de différencier les caractéristiques structurelles de l'objet à partir de la grande quantité de bruit dans le tomogramme et limite la résolution qui peut être obtenue par cryo- ET. Conventitraitement de l'image d'Onal comme Fourier et filtres-espace réel comme à la baisse échantillonnage peut être utilisé pour augmenter le contraste, mais au détriment de filtrer la plupart des informations à haute résolution. Récemment, la sous-tomogramme moyenne a permis d'augmenter considérablement le SNR et ensuite la résolution finale dans certains cas à des niveaux sub-nanométriques 8, 9. Une analyse plus détaillée de complexes est rendue possible par l'extraction de calculs des milliers de sous-tomogrammes contenant les zones d'intérêt à partir des tomographies d'origine, puis l'alignement et la moyenne de la sous-tomogrammes pour déterminer in situ dans des structures complexes avec SNR plus élevé et de plus haute résolution. Ces méthodes peuvent être intégrées à des approches génétiques pour fournir encore plus de connaissances dans des assemblages macromoléculaires et leurs conformations dynamiques dans le contexte cellulaire natif.
En général, des dizaines, voire des centaines de milliers de sous-tomographies doivent être en moyenne afin de déterminer haute-Résolution structures in situ. L'acquisition d'un nombre suffisant d'inclinaison série nécessaire pour produire ce grand nombre de sous-tomographies devient rapidement un goulot d'étranglement. L'inclinaison de la série résultant sont souvent affectée par le déplacement induit par faisceau, jeu de scène, ainsi que l'agrandissement, rotation et inclinaison défauts, qui doit être résolu à apporter le tilt-série dans l'alignement avant la reconstruction. La série d'inclinaison est généralement aligné par Repérage or marqueurs de référence, qui sont traditionnellement choisis manuellement par l'inspection de l'inclinaison de la série, ce qui provoque encore un autre goulot d'étranglement. De nombreux logiciels ont été développés pour l'acquisition d'inclinaison série automatisé grâce à des microscopes électroniques contrôlés par l'ordinateur 10, 11, 12, l'alignement tilt-série et de la reconstruction 13, 14 et sous-tomogramme moyenne 15-18. Comme ces paquets effectuer des opérations discrètes dans le workflow de cryo-ET, il devient souhaitable de construire un niveau d'abstraction plus élevé dans le processus de systemaquement de rationaliser l'ensemble du régime en un seul pipeline. Par conséquent, nous avons développé une bibliothèque de wrapper du logiciel "tomoauto" conçu pour organiser un certain nombre de ces paquets dans une unité semi-automatisé unique, permettant un fonctionnement utilisateur simple tout en conservant la configuration complète de chaque composant de manière centralisée. La bibliothèque est open-source, bien documenté, continuellement développé et librement disponible pour l'utilisation, le développement sur mesure ou une intégration plus au moyen d'un code source distante dépôt en ligne (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Ce haut-débit cryo-ET pipeline a été utilisée pour visualiser injectisomes intactes en S. minicellules flexneri. Un total de 1,917 tomographies ont été générés en utilisant cette méthode, révélant une haute résolution de la structure in situ de la machine intact, y compris la plate-forme de tri cytoplasmique déterminé par sous-tomogramme moyenne de 19. Avec la modélisation moléculaire de type sauvage et mutant machines, notre pipeline à haut débit offre une nouvelle voie pour comprendre la structure et la fonction du injectisome intacte dans le contexte cellulaire natif.
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Protocol
1. Préparation Minicell
- Pour faire S. minicellules flexneri, transforment 1 ul de plasmide pBS58, qui exprime constitutivement les gènes de la division cellulaire d'Escherichia coli ftsQ, FtsA, et FtsZ à partir d'un faible nombre de copies spectinomycine résistant plasmide dans 5 ul électrocompétentes streptomycine résistant sérotype 5a (M90T-Sm) les cellules par électroporation à 2,5 kV pendant 5 ms à 1 mm cuvettes.
- Les échantillons de conserver à -80 ° C dans 15% de glycerol dans un microtube de 1,5 ml cryogénique. Lorsque vous êtes prêt à l'emploi, gratter environ 5 pi de cellules de la microtube décongelés à l'aide d'une pipette et les cellules en suspension dans 4 ml de bouillon de soja tryptique avec spectinomycine ajouté à 100 pg / ml de concentration. Cultivez O / N à 37 ° C.
- Introduire à la pipette 2 ml de la culture de bouillon de soja 1,2 dans 200 ml de spectinomycine à nouveau avec la trypsine a été ajoutée à 100 ug / ml de concentration. Croître à 37 ° C pour la phase logarithmique tardive.
- Pour enrichir minicellules, centrifugeuse200 ml de la culture de 1,3 à 1000 g pendant 5 min. Versez délicatement la fraction de surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse et centrifuger à 20 000 g pendant 10 min. Versez délicatement et jeter la fraction de surnageant, et mélanger délicatement le culot avec le liquide restant à l'aide d'une pipette et transférer environ 100 pi du mélange de granulés à un tube de 1,5 ml.
2. EM préparation de grille
- Placer un côté film de carbone de 200 mesh grille de cuivre carbone R2 / 2 à trous sur une lame de verre.
NOTE: A / 2 grille de 200 mesh R2 est choisi pour maximiser le nombre d'inclinaison de la série qui peut être réglé à acquérir dans un carré de la grille unique tout en soutenant l'échantillon et en plaçant le bord du film de carbone dans le champ de la caméra au grossissement souhaité. Grilles à mailles plus fines et les petits films de carbone troué tels que R1.2 / 1.3 400-mesh peut être utilisé pour les échantillons imagés à un grossissement supérieur; plus grands films de carbone troué tels que R3.5 / 1 200 mesh peut être utiliséj pour les échantillons en image à un grossissement plus faible ou si la photographie ne doit pas contenir le bord de carbone et de films de carbone troué avec un plus grand espacement tel que R1 / 4 200 mesh peuvent être utilisés pour aider à l'alignement de la phase de la zone d'intérêt et la protection des zones de surexposition à se concentrer et de suivi des routines. - Placer la lame sur la plate-forme dans un dispositif à décharge luminescente.
NOTE: Nous utilisons un dispositif en interne dans lequel une anode et la plate-forme a été usiné dans un dessiccateur à vide et est alimenté par un générateur à haute fréquence. Après avoir créé un vide, fixez la sonde de générateur haute fréquence à l'anode et la puissance sur la sonde pendant 1 min à décharge luminescente la grille. Le temps nécessaire pour la décharge luminescente la grille peut varier de quelques secondes à une minute. Varier le temps de décharge luminescente peut être utilisé pour diagnostiquer des problèmes avec la concentration de l'échantillon et les réseaux qui apparaissent sec, sans glace vitreuse. - Retirez la grille avec un ensemble de pinces, et verrouiller la pince fermée avec un b élastiqueet.
- Ajouter 100 pi de 10 nm solution de l'or colloïdal au tube à centrifuger avec les minicellules préparés 1.4 et mélanger en tapotant doucement le tube avec un doigt. Avec une nouvelle pipette lieu le 4 pi du mélange sur la grille préparée en 2.2.
NOTE: L'or colloïdal est disponible dans une variété de tailles et il faut prendre soin que la taille de l'or est de plus de 5 pixels étant donné la taille de pixel des micrographies à être transformés à l'agrandissement acquis, tandis que ne pas être trop grand pour caractéristiques obscures d'intérêt. - Préparer l'appareil plongée gel; remplir le réservoir externe de congélation à l'azote liquide, puis remplir la chambre intérieure avec de l'éthane liquide. Attacher la pince avec la grille de la tige de piston et verrouiller la tige de piston dans la position relevée.
NOTE: Voir Iancu et al 20 pour un protocole décrivant l'utilisation d'un appareil commercial plongée gel.. - Sécher la grille en touchant soigneusement un morceau de papier filtre à til goutte d'échantillon jusqu'à ce que le ménisque entre la grille et le papier filtre sépare et la mèche sur le papier filtre arrête, puis relâchez immédiatement la tige de piston, le gel de la grille. Retirez délicatement la pince de la tige de piston et placer la grille dans un support de grille.
- Préparer la station de transfert cryo-EM en remplissant le récipient de la pompe à la zone de chargement et l'absorption avec de l'azote liquide. Une fois que la zone de chargement est d'au liquide lieu de la température de l'azote le support de grille et une cartouche de spécimen de microscope dans la zone de chargement.
- Retirez délicatement la bague de verrouillage, qui est soit un petit anneau de verrouillage fileté antérieures microscopes Polara ou un clip cycle C de style sur les modèles ultérieurs; placer la grille EM dans la cartouche en utilisant une pince, puis remettez doucement la bague de verrouillage en arrière sur la cartouche fixer la grille.
- Retirer le porte-échantillon multiple du microscope et l'attacher à la station de transfert. Placez la cartouche de l'échantillon dans le porte-cartouches à l'aide des pinces unD rétracter le support de la zone de chargement et de transférer le support d'échantillon multiple vers le microscope.
NOTE: Voir Chen et al 21 pour un protocole visuelle détaillant 2.1-2.9..
3. à haut débit Tilt-série automatisée Collection
- Collection de faible grossissement Plans
- Ouvrez une nouvelle fenêtre Navigator en cliquant sur «Ouvrir» dans le menu «Navigator» de SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Trouver cases de la grille qui contiennent des conditions acceptables d'imagerie (par exemple, la glace mince, pas de contamination, sujet d'intérêt) en utilisant l'écran fluorescent à faible grossissement (~ 2,300X pour le spécimen de minicellule).
REMARQUE: [Facultatif:. Cette étape peut être automatisée avec SerialEM par par montage, l'ensemble du réseau, mais il peut être plus rapide pour sélectionner simplement quelques zones manuellement] - Ajuster la phase de hauteur eucentrique par l'inclinaison du porte-échantillon à 50 ° puis ajusterla hauteur z jusqu'à ce que la translation de l'étage xy est minime entre les points de vue inclinés et non incliné.
- Déplacer vers le centre de la place de la grille et cliquez sur le bouton «Ajouter étape Pos» dans la fenêtre du navigateur pour mémoriser la position de stade actuel.
- Répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que tous 3.1.1-4 positions acceptables en scène des cases de la grille ont été enregistrées.
- Ouvrez un nouveau fichier montage MRC en cliquant sur "Nouveau montage» dans le menu «Fichier». Dans le programme d'installation Montage de dialogue qui apparaît, sélectionnez un certain nombre de pièces en X et Y qui achètera le carré de la grille entière (par exemple, 10 x 10 pour une grille de 200 mesh standard). Utilisez un haut binning tels que 8 et sélectionnez le «Move scène au lieu de déplacer l'image» et «Passer corrélations utilisées pour aligner les pièces de boutons radio.
- Dans la fenêtre de navigation cliquez sur la première position de l'étape et réglez-le à acquérir en cochant la case «Acquire». Répétez cette opération pour chaque position de la scène dans la fenêtre Navigator.
- Ouvrez le navigateur Acquérir de dialogue en cliquant sur «Acquérir aux points 'dans le menu' Navigator '. Cochez la case 'image de carte Acquire »et cochez de eucentricity Rough et assurez-vous que toutes les autres cases ne sont pas cochées. Cliquez sur «Continuer» afin de recueillir un montage à chaque position de la scène.
- Acquisition Tilt-série
- Dans la fenêtre Navigator sélectionnez l'une des cartes acquises et cliquez sur le bouton «Charge carte '.
- Dans la fenêtre de navigation cliquez sur 'Ajouter Points de bouton et sélectionnez points dans la carte à laquelle d'acquérir une inclinaison de la série. Puis cliquez sur «Stop Ajout de points de la touche. Répétez l'opération pour chaque carte recueillies.
- Dans le menu de l'appareil photo sélectionner «Paramètres» et de définir les paramètres pour les modes Mise au point, des essais et de la fiche. [Facultatif:. Dose-fractionne les données peuvent être spécifiés dans les paramètres pour le mode Record]
- Sélectionnez un point dans la fenêtre du navigateur et vérifier le «Tilt-Series9; cochez la case. Dans la fenêtre de dialogue Configuration Tilt-Series qui ouvre sélectionner les paramètres souhaité pour la collecte tilt-série. Répétez l'opération pour le reste des points sélectionnés dans la fenêtre du navigateur, mais ne sélectionnez pas les cartes.
- Dans le menu Navigator sélectionner à nouveau la «Acquérir aux points '. Dans le navigateur Acquérir dialogue choisissez 'Réalignez au point', Autofocus »et« eucentricity Rough que les tâches préliminaires, et sélectionnez «Acquérir série d'inclinaison 'que la tâche principale, et sélectionnez« Fermer les vannes de colonne à la fin »pour fermer la colonne quand tout des points ont été recueillies. Lors de poursuivre une inclinaison de la série seront recueillis à chaque point de chaque carte.
4. à haut débit traitement Tilt-série automatisée et de la reconstruction Utilisation Tomoauto
- Correction de motion Beam-induite dans les données dose-fractionnées [facultatif]
REMARQUE: Tomoauto utilise MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) pour enlever mouvement induit par faisceau de micrographies de dose fractionnée. NOTIONCORR 16 doit être installé sur le système.- Avec l'inclinaison de la série originale, le journal de sortie de SerialEM 10 et les images de la dose fractionnée individuels tous dans le répertoire de travail courant, dans un terminal, exécutez la commande:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> est le nom de l'inclinaison de la série à traiter.
- Avec l'inclinaison de la série originale, le journal de sortie de SerialEM 10 et les images de la dose fractionnée individuels tous dans le répertoire de travail courant, dans un terminal, exécutez la commande:
- Alignement et la reconstruction du Tilt-série
REMARQUE: Tomoauto utilise par défaut IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) pour gérer l'inclinaison de la série automatisé génération de modèle de repère, l'alignement, la détermination de la fonction de transfert de contraste (FCE), la FCE-correction 23, et reconstruction. Alternativement utilisateurs ont la possibilité d'utiliser dans tomoauto RAPTOR 24 (inclus dans IMOD) pour automatisé génération de modèle de repère, la FCEFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) pour déterminer le FCT, et tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) pour la reconstruction ou de toute combinaison de logiciels par configuration. Cette configuration ainsi que les paramètres disponibles dans chaque colis est assurée par un fichier de configuration globale qui peut être modifié en fonction des valeurs les plus couramment utilisées dans un laboratoire alors que les fichiers de configuration locaux peuvent également être créés à des paramètres de détail utilisé pour un spécimen spécifiques, collecte définir ou individuelle tilt-série. Tous les paquets qui souhaitent être utilisées doivent être installés sur le système.- Avec l'inclinaison de la série dans le répertoire de travail courant, dans un terminal exécuter la commande
tomoauto --CTF --mode = align <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> est l'inclinaison de la série à traiter et <fid_diam> est le Diameter des marqueurs de référence dans nanomètres. Cette commande permettra d'aligner et d'estimer le FCT de l'inclinaison de la série automatiquement. Il est possible de sauter le traitement FCT en supprimant l'option --CTF de la commande. - Inspectez le tilt-séries alignées visuellement pour des erreurs flagrantes dans le traitement d'alignement et d'inspecter le FCT estimée en exécutant les commandes:
3dmod <nom du fichier> .ali
submfg <nom du fichier> _ctfplotter.com
respectivement, où <nom du fichier> est le nom de l'inclinaison de la série sans suffixe. Vérifiez également la sortie de la commande de tomoauto pour voir l'erreur résiduelle moyenne générée par l'alignement, qui est une statistique quantitative de la qualité de l'alignement. - Étant donné un alignement acceptable de procéder de traitement en exécutant la commande:
tomoauà --CTF --mode = reconstruire <filename.st> <fid_diam>
avec les mêmes substitutions d'utilisateur comme en 4.2.1. Cette commande va corriger le FCT, effacer les marqueurs de référence de l'inclinaison de la série et calculer la reconstruction. Encore une fois le traitement de la FCE peut être ignorée comme en 4.2.1. - [facultatif] Pour sauter l'étape de l'inspection visuelle et automatiser entièrement le traitement et la reconstruction exécuter la commande
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [facultatif] Pour utiliser une configuration locale spécifique, reportez-vous à la documentation de tomoauto sur la façon de générer un fichier de configuration local, puis exécutez la commande
tomoauto [options] -L <LOCAL_CONFIG> <filename.st> <fid_diam>
où <LOCAL_CONFIG> est le nom de la conf localefichier iguration.
- Avec l'inclinaison de la série dans le répertoire de travail courant, dans un terminal exécuter la commande
5. Sous-tomogramme moyenne
NOTE: Nous utilisons le paquet de 15 i3 (http://www.electrontomography.org/) pour traiter les expériences de moyenne sous-tomographie, mais le protocole décrit applique généralement à la plupart disponibles sous-Tomogram expériences sous-tomographie de processus de packages16to logiciel de calcul de la moyenne de la moyenne, cependant le protocole décrit applique généralement disponible à la plupart des sous-tomogramme logiciels de calcul de la moyenne de 16-18.
- Avec la tomographie reconstruit dans le répertoire de travail courant ouvrir le tomogramme pour la cueillette de particules en exécutant la commande:
tomopick <nom du fichier> .rec
où <nom du fichier> est comme dans 4.2.2. Dans la fenêtre qui ouvre utiliser le bouton gauche de la souris pour cliquer sur la première basale du corps, puis la pointe d'aiguille pour sélectionner un injectisome et utiliser les touches fléchées haut et bas pour riff à travers les tranches de la tomogram. Sélectionnez tous injectisomes visibles de cette manière. Cette mémorise les coordonnées dans un fichier texte qui définissent l'axe longitudinal de la structure, ainsi que de l'estimation de deux trois angles d'Euler qui décrit l'orientation de la structure. - Extrait de calcul 400 3 voxels cubes de la tomographie centré au milieu de l'axe de temps défini par l'exécution de la commande:
couper redimensionnement -cx <x> -cy <y> -CZ <z> -ix 400 400 -iy -iz 400
<nom du fichier> .rec <nom du fichier> _001.mrc
où <x>, <y>, <z> sont les coordonnées milieu de la structure et <nom du fichier> est comme dans 4.2.2. La taille du cube extrait devrait varier selon la structure et le grossissement utilisé, et devrait être suffisamment grand pour englober adéquatement la structure d'intérêt, qui, pour cet échantillon est de 400 3 voxels. - Down-échantillon (bin) du sous-tomographie par un facteur de quatre à réduire le temps de calcul pour l'alignement initial en exécutant la commande:
binvol -b 4 <nom du fichier> _001.mrc <nom du fichier> _001.bin4.mrc
où <nom du fichier> est aussi en 5.2. - Appliquer le Euler déterminé angles à des sous-tomographies et calculer la moyenne mondiale pour produire le modèle initial en exécutant la commande.
I3totsum.sh - Aligner et classer les sous-tomographies bas-échantillonnés en utilisant un masque de classification binaire de la zone cytoplasmique. Effectuez sous-tomogramme moyenne dans l'espace de Fourier pour minimiser les artefacts de coin manquants caractéristiques de la tomographie. Pour binning données 4, s'il vous plaît utiliser SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Répétez l'étape 5.5 en utilisant des sous-tomographies-échantillonné par un facteur de deux (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") et une fois de plus avec les données d'origine (SAMPFACT =" 1 1 1 »).
i3mramsacls.sh
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Representative Results
Des échantillons de minicellules S. flexneri ont été recueillies et traitées comme montré sur la figure schématique 1, en utilisant le pipeline suivant tomoauto détaillée sur la figure 2. Tilt-séries ont été recueillies à l'aide SerialEM 10, qui permet à haut débit acquisition tilt-série aux points désignés par l'utilisateur sur les cartes de montage à faible grossissement (figure 3). Micrographies ont été collectées en utilisant le mode dose-fractionnement sur un appareil photo de l'appareil de détection directe de réduire induite par faisceau mouvement 22 (Figure 4). Tomoauto coordonne correction de mouvement en prenant une collection de photographies au microscope doses fractionnées de traitement chacun avec MOTIONCORR 22 et assemble les résultats dans une inclinaison de la série à être traitées ultérieurement (Film 1).
L'application la plus générale de tomoauto est les abonnalignement de c d'une inclinaison de la série initiale. Tomoauto compose exécution séquentielle des commandes nécessaires à IMOD 13 pour aligner grossièrement l'inclinaison de la série et de générer le suivi des particules d'or colloïdales dans l'échantillon, qui sont à leur tour utilisés pour générer l'alignement final un modèle de repère initial. La précision de ce modèle de repère est essentielle à la qualité de la tomographie reconstruite, et afin que l'utilisateur est en mesure d'inspecter visuellement le modèle de repère automatiquement calculés avant de procéder à la reconstruction ou à la suite d'identifier l'inclinaison de la série qui devrait être traitée manuellement. La figure 5 montre deux tilt-série grossièrement aligné et le modèle de repère déterminé généré par tomoauto. Figures 5A, C montrent les images Untilted et à la fois le modèle de repère est correct avec des points de modèle centré sur les marqueurs repères. Figures 5B, D montrent correspondant inclinable et série à 50 degrés et tandis que le modèle à la figure 5B la figure 5D ont dévié de leurs marqueurs d'or correspondant et le modèle ne convient pas pour un alignement parfait. Cette erreur peut être mesurée quantitativement en tant que l'erreur résiduelle moyenne entre le centre du point du modèle et le centre probable du marqueur de l'or, et tomoauto peut être configuré pour alerter l'utilisateur lorsque l'erreur mesurée dépasse un seuil défini par l'utilisateur afin d'accélérer l'inspection. Tilt-série qui sont insuffisamment automatiquement alignée peut alors être aligné manuellement. Nous constatons que tomoauto aligne avec succès autour de 80% -90% de notre recueillies tilt-série (Film 2).
Après une inclinaison de la série a été aligné avec succès, il doit être reconstruit dans le tomogramme finale. Tomoauto a été conçu de sorte que l'utilisateur peut utiliser IMOD 13 ou 26 pour générer tomo3d la reconstruction finale. Nous utilisons actuellement tomo3d de profiter de plusieurs fonctionnalités de multi-core modernes traitement informatique unités (CPU) afin de réduire considérablement le temps de la reconstruction. Le tomogramme finale comme représenté sur la figure 6 et du film 3 est un volume 3-D de l'échantillon imagé qui peut ensuite être utilisé pour l'annotation cellulaire par segmentation, ou sous-tomogramme moyenne pour obtenir ultérieure des informations de résolution de la machinerie moléculaire dans l'échantillon. Sous-tomogramme moyenne augmente à la fois le SNR et diminue les artefacts produits par le-coin manquant en moyenne sur les hauts-niveaux de bruit dans les tomographies individuels et en utilisant les grands sous-tomographies numériques dans un ensemble bien réparties des orientations aléatoires par rapport à la coin manquant de limiter les artefacts et d'améliorer la résolution finale. La moyenne des sous-tomogramme de 2.7nm des intacts S. flexneri SST3 est représenté sur la Figure 7 tel que déposé dans la EMDB (EMD-2667), ce qui montre la grande amélioration à cette technique capable de compared à l'injectisome affiché en une seule tomogramme la figure 6B.
Figure 1. Aperçu schématique de la tomographie à haut débit cryo-électronique. Une suspension liquide est rapidement gelé sur une grille d'EM et un ensemble de tilt-série est recueilli par un microscope électronique commandé par ordinateur automatisé. Les micrographies obtenues sont traitées automatiquement à l'aide tomoauto pour générer la tomographie. L'étape finale ici est un S. segmenté minicellule flexneri d'une tomographie généré par ce protocole de Hu et al. 2 015 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Organigramme du processus de tomoauto. Une ventilation des flux de tomoauto montre comment les données sont traitées à partir d'une collection de photographies au microscope doses fractionnées tout le chemin à une finale moyenne sous-tomographie. Symboles de sous-processus détail les tâches que tomoauto coordonnées pour traiter entrée en exécutant le logiciel approprié configuré. Des symboles de données de sortie montrent généralement pas utilisé par l'utilisateur, tandis que les documents et de documents multi-symboles indiquent la sortie réellement manipulé par l'utilisateur. Enfin afficher des symboles montrent où l'intervention de l'utilisateur produit dans le workflow. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Batch acquisition tilt-série avec SerialEM Navigator. Positions de montage des cartes sont stockées comme des positions de scène (montré selectiON) dans la liste de la fenêtre Navigator représenté sur le côté gauche de l'écran et de la carte chargée est affichée dans la fenêtre de tampon avec les points sélectionnés marqués numériquement avec une croix rouge ajoutée à la carte d'acquisition. Points d'acquisition sont répertoriés par étiquette dans la fenêtre du navigateur et peuvent être réglés à acquérir en utilisant la case "série Tilt". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effet de mouvement de correction sur les données de dose fractionnée. (A) montre une micrographie untilted et corrigée et l'image de mouvement corrigée (traitée par MOTIONCORR) est montré dans (B), le contraste est légèrement améliorée après correction. Amélioration peut être constatée plus apparemment en regardant le transf Fourierorm de la micrographie avant (C) et après (D) correction de mouvement. Images montrent EH la même information, mais avec une micrographie incliné à 60 degrés, où le contraste est diminué et anneaux Thon visibles en C et D ne sont plus visibles à grande inclinaison. Barre d'échelle de 250 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Les bons et les mauvais résultats de l'alignement inclinaison de la série tomoauto automatisé. (A) Une micrographie à peu près alignés untilted et le modèle de repère produite automatiquement en utilisant tomoauto. (B) Le modèle de repère fixé à 50 degrés d'inclinaison. Le modèle se glisse bien et est centrée sur les marqueurs de référence appropriés. (C, D) dans (A, B), respectivement, zoomée à la zone encadrée. Cette inclinaison de la série a été aligné avec une erreur résiduelle moyenne de 1,06 pixels. (E) Une micrographie untilted et le modèle de repère d'un autre inclinaison de la série et (F) de la série à 50 degrés d'inclinaison. Ici, nous voyons que le modèle a perdu la trace de plusieurs marqueurs de référence (en rouge) et cela est représentatif d'un mauvais suivi automatisé. (G, H) montre le modèle dans (E, F), respectivement, zoomée à la zone encadrée. Cette inclinaison de la série a été aligné avec une erreur résiduelle moyenne de 3.51 pixels et ont dû être traitées par un alignement manuel de la série. Bar (A) à l'échelle de 500 nm (C) Barre d'échelle de 50 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
![Figure 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figure 6. Tomogram généré automatiquement par tomoauto. (A) Affiche une projection de sept tranches du centre de la reconstruction de l'inclinaison de la série affiché dans la figure 4A. Barre d'échelle de 250 nm. (B) Un zoom en vue de la zone encadrée en (A) affichant une injectisome intacte. Barre d'échelle de 100 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure moyenne 7. Sous-tomographie d'Intact S. flexneri système de sécrétion de type III. (A) de la tranche centrale de la moyenne sous-tomogramme 2,7 nm de l'intacte S. flexneri SST3 de EMDB (EMD-2,667). (B) le long de la projection completl'axe X du volume. (C) Isosurface rendu du volume lu à un seuil de contour de 130 à IMOD. Barre d'échelle 5 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1: Animation des non alignés tilt-série (un clic droit pour télécharger). Cette animation traverse l'inclinaison de la série comme initialement collectées par SerialEM. Traductionnelles changements sont facilement identifiables par le chemin erratique de marqueurs individuels repères d'image en image, et ces changements avec des défauts moins visibles doivent être corrigées avant l'inclinaison de la série peut être reconstruit.
![Film 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Film 2: Animation des aligné tilt-série (un clic droit pour télécharger). Cette animation traverse les mêmes micrographies affichées dans Movie 1 après alignement automatique par tomoauto. Les chemins erratiques de marqueurs fiduciaires suivent désormais une trajectoire lisse grâce à l'inclinaison de la série, et l'axe d'inclinaison est aligné verticalement par rapport au spectateur.
Film 3:. Animation d'reconstruit tilt-série (un clic droit pour télécharger) Cette animation traverse la tomographie montre la figure 6 généré reconstruction après automatisé de l'inclinaison de la série affichée dans Movie 2 by tomoauto.
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Discussion
La méthode à haut débit décrit ici nous a permis de traiter 1917 cryo tilt-série et de produire plus de 4500 sous-tomographies de la intacts S. flexneri injectisome 19. Les données recueillies ont abouti à la caractérisation détaillée de injectisome in situ, y compris le tri complexe cytoplasmique. Le procédé a également été utilisé pour visualiser plusieurs cellules mutantes avec deletion spécifique de composants protéiques putatifs, ce qui a permis d'élucider la composition de la plate-forme de tri de la injectisome. Notre méthode a fourni de nouvelles avenues pour étudier la relation structure-fonction de l'injectisome. En conséquence, la nouvelle étape a été fixée pour de plus amples dissection des mécanismes sous-jacents de la sécrétion et la pathogenèse SST3 médiation.
Le protocole présenté ici décrit à haut débit cryo-ET de intacte S. flexneri, mais est applicable à tout projet adapté pour cryo-ET. Cette méthode a été utilisée dans la structucaractérisation ral du moteur flagellaire de 27 Borrelia burgdorferi, l'infection de E. coli minicellules par bactériophage T7 28, et les tableaux chémorécepteurs dans E. coli 29. En facilitant la collecte d'ensembles de données massives, il est possible de cribler plusieurs mutants ainsi que l'image d'un grand nombre de conditions qui permettent inférences de processus dynamiques comme ensemble de machine 27 et la progression de l'infection par le phage 28. En recueillant plusieurs logiciels et permettant un contrôle complet sur l'exécution de traitement, les utilisateurs sont en mesure de personnaliser les différentes combinaisons de forfaits pour des résultats optimaux. Chen et al. 21 issu d'un protocole similaire décrivant la collecte de données à l'aide du logiciel Leginon 12 et automatisation du traitement tilt-série à l'aide IMOD 13 et 24 RAPTOR. Le protocole actuel complète cette méthode détaillant une méthode alternative pour codonnées de llecting et de traitement tout en montrant combien la technologie et de la procédure a progressé, grâce à l'accent mis sur haute résolution grâce à la sous-tomogramme moyenne, avec des données sur les doses fractionnées, l'estimation de la FCE automatisé et de correction, et plus robustes routines d'alignement automatisés au sein 13 IMOD. Alors que le protocole précédent va dans le détail visuel avec l'accent sur la collecte de données, cette méthode met l'accent sur les détails de traitement des données recueillies.
Méthodes à haut débit permettent de collecte massive de données qui maximisent l'utilisation des ressources de microscope et informatiques, tout en limitant le montant des interventions de l'utilisateur manuelles fastidieuses qui ralentissent le projet et d'agir comme un obstacle majeur. La bibliothèque de wrapper tomoauto a été conçu pour permettre la configuration complète de tous les paramètres utilisés dans chaque logiciel d'une manière simple et centralisée. Une fois une configuration appropriée a été déterminée, il est alors facile pour appliquer les paramètres à l'ensemble de dataset. La majorité de l'inclinaison de la série peut être traitée avec des résultats acceptables (Figure 4A), tandis qu'un sous-ensemble secondaire doit être traité manuellement. Ce basculement de la série sont généralement acquisitions moins idéales en proie à l'image excessive changement, manque de contraste, ou un manque de marqueurs fiduciaires suffisantes qui provoque la routine de suivi automatisé de repère à l'échec (figure 4B). Pour obtenir les meilleurs tomographies possibles, soins importants doivent être prises à chaque étape cruciale de la préparation de l'échantillon, l'acquisition de l'image, au traitement d'image.
D'autres développements en haut débit cryo-ET telles que l'extraction automatisée sous-tomographie par template matching et l'intégration des packages de logiciels modernes de la moyenne sous-Tomogram tels que Dynamo dans des pipelines de flux de travail existants comme tomoauto sont maintenant à l'étude. L'avènement récent des caméras de l'appareil de détection directe de nouvelle génération a apporté des améliorations majeures dans l'augmentation de l'inclinaison de la série SNR et permettant more détermination FCT cohérent en raison de la plus grande efficacité du détecteur. L'utilisation de nouveaux or pleine grille-types peut diminuer les défauts de collecte inclinaison de la série, l'amélioration du taux de réussite pour le traitement automatisé tilt-série et de la reconstruction avec moins besoin d'intervention manuelle 30. Enfin, avec l'utilisation désormais omniprésent de grappes d'ordinateurs et unités de traitement graphique (GPU) pour paralléliser et d'accélérer un traitement à grande ensemble de données, le développement des pipelines qui peuvent utiliser ces systèmes seront bientôt nous l'espérons être en mesure de réduire le temps d'exécution de jours en heures, offrant aux utilisateurs même encore moins de temps morts entre la conception de l'expérience et de l'analyse de données significative tout en augmentant la taille de l'ensemble de données et d'atteindre des résolutions plus élevées.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr William Margolin pour commentaires. Nous sommes reconnaissants pour le soutien sur SerialEM de Drs. David Chen Xu et Mastronarde. DM, BH et JL ont été soutenus par Grant R01AI087946 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses, des subventions et R01GM110243 R01GM107629 de l'Institut national des sciences médicales générales (NIGMS), et Grant UA-1 714 de la Fondation Welch. Le détecteur d'électrons direct a été financée par les Instituts nationaux de la santé S10OD016279 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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