Summary

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

Published: June 06, 2016
doi:

Summary

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。

Abstract

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

Introduction

着床前胚発生は、1細胞期から桑実胚および胚盤胞に、いくつかの別個の段階に分けることができます。多くの証拠は、極性および位置合図は栄養外胚葉(TE)および内部細胞塊(ICM)に初期の細胞運命の決意に役割を果たすことを示唆しています。しかしながら、それらはセルラ信号に導入されているかの手がかりの性質、および生理学的コンテキストとは、そのような信号は、知られていない細胞系譜の分化を開始することが可能です。これらの分化した細胞は、その後胎盤1-3の胚適切な形成と成長のために必要な特徴的な構造と機能を取るために始めて、専門を受けます。

着床前胚は、siRNAまたは標的cDNAのような修飾された遺伝物質の直接注射による操作に特に適しているので、特定の標的分子を研究するために利用することができます。その遺伝的成長の理解があります脊椎動物の胚の分析は、胚発生4の我々の理解を進めるために重要です。 gain-または機能喪失型遺伝子のを達成するためのタイムリーな文脈での胚への野生型遺伝子または変異形の正確な導入が大幅に発達調節される遺伝子の研究を容易にしました。 loss-がと機能獲得型遺伝物質の微量注入を介して、個々の早期非哺乳動物および哺乳動物の胚には、その大きなサイズと大きな受容5の比較的単純です。マイクロインジェクションは、典型的には、非ウイルスベクターを使用して実行されます。特定の利点は、ウイルスベクターおよびトランスジーン上に非ウイルスベクターを使用することの容易さからとられています。マウス胚の急速なloss-がまたは機能獲得型の発現系は、私たちは解剖し、脊椎動物の発生学6,7における遺伝子機能を理解することを可能にするように開発されました。

胚の蛍光標識が大きくMICRの選択を容易にしますoinjectedまたは遺伝的に胚を操作し、同時に、間接的に蛍光強度8に基づいて、マイクロインジェクションsiRNAまたはcDNAの発現レベルを定量化する手段を付与します。この標識、蛍光タンパク質のcDNAを達成するために、GFPまたはRFPは、別々に融合構築物またはいずれかと同時注入されます。 GFPまたはRFPの蛍光強度は、loss-がを保証または機能獲得なされたものに対するsiRNAまたは外来DNAの発現の程度を明らかにする。

ここで、我々は、私たちは、着床前のマウス胚における初期の細胞分化に重要な細胞外の手がかりを中継受容体としてネオゲニン同定することを可能にしたloss-が、ゲインオブファンクション技術のためのマイクロマニピュレーションプロトコルを提示します。

Protocol

注:動物の飼育や心配事のためのすべての手順はSahmyook大学、ソウル、韓国のIACUCの規則に従って行いました。 1.過排卵、繁殖や卵管の単離 22±3℃、〜60%の湿度、12時間の明/暗サイクル、水と食料を自由摂取:以下の条件の下で、近交系C57BL / 6マウスを維持します。 誘導0.1ミリリットル/ヘッドで5 IU妊馬血清ゴナドトロピン(PMSG)の腹腔内注射によって3-5週齢の雌マウス…

Representative Results

我々は、早ければ2細胞期でとして登場すると永続的な初期の桑実胚までは、後期桑実胚と胚盤胞段階( 図2A)で欠損となって、ネオゲニンが一過着床前マウス胚の初期発生段階で発現していることを発見しました。また、ネオゲニンの空間分布は、主に細胞外に制限しました。 RT-PCR分析の結果は、4細胞期でピークに達するが、完全に16細胞期に欠く以降…

Discussion

現在のプロトコルでは、我々は、マウスの胚発生の初期に細胞分化におけるネオゲニンの役割を探求する2-PNのマウス胚に、cDNAまたはshRNAのいずれかで、遺伝物質のマイクロインジェクションの新規な方法を示しています。着床前胚の遺伝子改変は、例えばのための基礎となる分子メカニズムに関する重要な情報を暴くための強力な技術は、最初の細胞系譜の決意です。遺伝子改変は、遺伝子…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らはまた、製造およびcDNAとのshRNAベクターをネオゲニンための構造を共有するためのジョージア健康科学大学の博士熊のグループを承認したいと思います。この研究は、韓国研究財団によっておよびSahmyook大学からの研究助成金によって賄わ基礎科学研究開発プログラム(2013R1A1A4A01012572)からの助成金によってサポートされていました。

Materials

M16 medium, Gibco BRL (Grand Island, NY) M7292 LOT# 11A832
Goat serum,  Dako (Glostrup, Denmark) X0907
PMSG Folligon, Intervet, Holland G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Mineral olie Sigma Aldrich CG5-1VL LOT# SLBC6783V
human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin  (Intervet, Holland) (invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Reverse Transcriptase lifetechnologies 18080-044
PCR pre mixture  (Bioneer, Daejon, S. Korea) GenDEPOT , A0224-050
Agarose (molecular grade) BioRad 161-3101
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Affymetrix USA 19943
polyclonal rabbit anti-neogenin antibody Santa Cruz Biotechnology, US SC-15337
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-11094
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-21428
Alexa Fluor® 555 Phalloidin Molecular Probes (Invitrogen, USA) A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen, USA D1306
Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin R&D systems 3720-RG
all plasmid constructs  Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). the present studies were kindly provided by 
Neon®  Transfection System lifetech MPK10096
Stereo Microscrope Nikon SMZ1000
Micromainpulation system with Nikon Nikon Narishige ONM-1
MicroInjector Nikon Narishige GASTIGHT #1750
Holder Nikon Narishige Narishige IM 16
Microfoge Nikon Narishige Narishige MF-900
grinder Narishige EG400
Puller Sutter Instrumnet company P-97
CO2 incubator Thermo Scientific Forma EW-39320-16
Veriti® 384-Well Thermal Cycler  lifetechnologies 4388444

References

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Lee, J. H., Cho, Y. I., Choi, S. S., Kim, H., Min, C. K., Lee, S. J. Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (112), e53696, doi:10.3791/53696 (2016).

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