Nye Metrics at karakterisere Embryonale Forlængelse af nematoden<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
For næsten 50 år har nematode Caenorhabditis elegans etableret sig som en stærk model til at studere vigtige spørgsmål i udvikling, neurobiologi, evolution, vært-patogen interaktioner, etc. 1 Styrken af denne model i studiet af udviklingen ligger i: sin korte levetid 3 dage; den lethed, hvormed disse dyr kan være genetisk ændret; gennemsigtighed, der muliggør observation af celle fordrivelse og morfologi i levende dyr og dets udvikling, der er for det meste ekstra-uterin. De udviklingsmæssige stadier af rundorm involverer embryogenese og fire larvestadier (L1 til L4), efterfulgt af voksenalderen. Under fosterudviklingen, epidermal morfogenese tiltrak stor opmærksomhed for sin evne til at muliggøre en bedre forståelse af, hvordan epitelial celler migrerer som en gruppe, hvordan de omlægge deres kryds og ændre deres individuelle morfologi samt deres relative positionering inden for en funktionel epitel.Epidermal morfogenese er opdelt i fire faser: dorsal intercalation består i reorganiseringen af dorsale epidermale celler, kaldet hypodermis; ventrale kabinet, som består i migration af ventrale hypodermal celler mod ventrale midterlinjen dermed omslutter embryo i en epitelcelle monolag; tidlig og sen forlængelse omdanne bønne-formede embryo i vermiform larver. Efter morfogenese, embryo luge og L1 larver begynde at fodre ved hjælp af tilgængelige bakterier i deres nærmiljø.
Embryonale forlængelse er derfor en sene fase af den embryoniske udvikling. Den består af en forlængelse af embryonet langs sin længdeakse og en reduktion af dens tværgående diameter. Dette indebærer en dramatisk ændring af formen af hypodermal celler. Forlængelse er opdelt i en tidlig og en sen fase. Den tidlige fase starter ved komma scenen og slutter, når krop-væg muskler begynder ordregivende på 1,75 gange etape i wild-type (wt) embryoner – svarende til embryoner, der er 1,75 gange i længden i forhold til ikke-aflange embryoner. Morfogene processer, der forekommer i denne fase er primært drevet af sammentrækning af filamentøse actin bundter (FBS) placeret ved den apikale pol af hypodermal celler, der driver deres forlængelse langs antero-posteriore akse af embryonet 2. Sammentrækning af FBs er kontrol phosphorylering af myosin-lette kæder af tre kinaser LET-502 / ROCK, MRCK-1 og PAK-1 5. Den sene fase af forlængelsen, starter, når krop-væg muskler bliver funktionelle og starte ordregivende. Det indebærer mechanotransduction signalering fra kroppen væg muskler til dorsale og ventrale hypodermal celler og slutter, når dyr klækkes 3.
Forlængelse defekter er generelt karakteriseret ved procentdelen af dyr, der dør som fostre (Embryonale dødelighed, Emb), og dem arrestere deres udvikling som L1 larver (Larve anholdelse fænotype; Lva) og være betydeligt kortere end vægt. Identifikation af den fase af udviklingsmæssige anholdelse kræver mikroskopisk observation af døde fostre og anholdt Larver 3-6.
Det blev for nylig vist, at adskillige gener, såsom Cdc42 / Rac regulator og effektor pix-1 og pak-1, kontrollere morfogene processer under både tidlig og sen forlængelse 3,7. Vi har også for nylig viste, at morfogene processer adskiller langs antero-posterior akse af embryonerne under tidlig forlængelse 3 7. Disse resultater motiveret udviklingen af nye målinger specifikt er rettet mod tidlige eller sene forlængelse stadier og andre målinger muliggør karakteriseringen af morfologi af embryoner langs deres antero-posterior akse under tidlig forlængelse.
Disse hidtil ukendte metoder består i måling af længden af embryoner ved begyndelsen og slutningen af tidlig forlængelse samt bredden af deres hanannoncer og haler. 7 To protokoller blev også udviklet til at måle længden af nyklækkede larver, synkroniseret på L1 fase 7.
De æggeskaller af embryonerne beskytte dem mod alkalisk hypochlorit behandling, mens larver, voksne og bakterier til stede i dyrkningsmedierne opløses ved behandlingen. Denne behandling anvendes derefter til at oprense embryoner fra en ikke-synkroniseret population indeholdende et flertal af velnærede voksne 8. Fødebegrænsning anvendes til at synkronisere nyklækkede larver. Måle længden af disse larver anvendes derefter til påvisning af brudforlængelse defekter. Denne måling er foretrukket i forbindelse med måling af anholdt larver på dyrkningsplader fordi larver, der klækkes fra ikke-fuldt aflange embryoner kan genvinde til "normal længde" når fodring, men vil fastholde deres reducerede størrelse, når anholdt i fravær af fødevarer.
Her præsenteres detaljerede protokoller muliggør målingen af length af forlængede embryoner samt bredden af deres hoved og hale ved hjælp af time-lapse DIC mikroskopi og billedanalyse (Protokol 1). Vi leverer også detaljerede protokoller til at måle længden af synkroniseret larver hjælp billedanalyse (protokol 2) og Flow-cytometri (protokol 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver nye målinger til at karakterisere tidligt og sene faser af embryonale forlængelse.
I afsnit 1, det kritiske skridt er den potentielle tilstedeværelse af bakterier på puden. Embryonerne hermetisk indesluttet mellem puden og dækglasset under billedoptagelse. Tætning slæden er nødvendig for at undgå udtørring af dyrene under erhvervelse, der varer mere end to timer. Så vidt vi ved, ingen af de sæljægerne bruges til montering af agarose puder mellem ob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . Methods. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
