Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
Depuis près de 50 ans , les nématodes Caenorhabditis elegans est établi comme un modèle puissant pour étudier des questions importantes dans le développement, la neurobiologie, l' évolution, les interactions hôte-pathogène, etc. 1 La force de ce modèle dans l'étude du développement réside dans: son cycle de vie court de 3 jours; la facilité avec laquelle ces animaux peuvent être génétiquement modifiées; sa transparence qui permet l'observation du déplacement de la cellule et de la morphologie des animaux vivants et de son développement qui est la plupart du temps extra-utérine. Les stades de développement du nématode impliquent l'embryogenèse et quatre stades larvaires (L1 à L4), suivie par l'âge adulte. Au cours du développement embryonnaire, épidermique morphogenèse a attiré une attention considérable pour sa capacité à permettre une meilleure compréhension de la façon dont épithéliales cellules migrent en tant que groupe, comment ils réorganisent leurs jonctions et modifier leur morphologie individuelle, ainsi que leur positionnement relatif dans un épithélium fonctionnel.Epidermal morphogenèse est divisé en quatre étapes: intercalation dorsale consistant en la réorganisation des cellules épidermiques dorsale, appelée l'hypoderme; enceinte ventrale, consistant à la migration des cellules hypodermiques ventrale vers la ligne médiane ventrale enrobant ainsi l'embryon dans une monocouche de cellules épithéliales; début et fin de l'allongement transformer l'embryon en forme de haricot en larves vermiform. Après morphogenèse, embryon éclosent et les larves L1 commencent à se nourrir en utilisant des bactéries disponibles dans leur environnement immédiat.
allongement embryonnaire est donc une phase tardive du développement embryonnaire. Il est constitué de l'extension de l'embryon, le long de son axe longitudinal, et une réduction de son diamètre transversal. Cela implique une modification spectaculaire de la forme des cellules hypodermiques. Allongement est divisé en un début et une phase tardive. La première phase commence au stade de la virgule et se termine lorsque les muscles corps à parois commencent à contracter à l' étape 1.75 fois dans wild type ( en poids) des embryons – correspondant à des embryons qui sont 1,75 fois la longueur par rapport à des embryons non-allongée. Morphogenèse se produisant à ce stade sont principalement motivés par la contraction des faisceaux filamenteux d'actine (FB) situés au pôle apical des cellules hypodermiques qui conduisent leur allongement le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon 2. Contraction de FBs est le contrôle par phosphorylation des chaînes de myosine-lumière par trois kinases LET-502 / ROCK, MRCK-1 et PAK-1 5. La phase tardive de l'allongement, commence lorsque les muscles corps à parois deviennent fonctionnels et commencent à contracter. Elle implique la signalisation de transduction mécanique des muscles corps de paroi aux cellules dorsale et ventrale hypodermiques et se termine lorsque les animaux éclosent 3.
les défauts de Allongement sont généralement caractérisés par le pourcentage d'animaux qui meurent comme des embryons (létalité embryonnaire; Emb) et ceux d'arrêter leur développement en tant L1 larves (larvaire arrestation phénotype; Lva) et étant sensiblement plus courte que poids. Identification de la scène de l' arrestation de développement nécessite une observation microscopique des embryons morts et arrêté Larves 3-6.
Il a été récemment montré que plusieurs gènes, comme le régulateur / Cdc42 Rac et effecteur pix-1 et pak-1, contrôlent la morphogenèse au cours précoce et tardive allongement 3,7. Nous avons récemment montré que morphogenèse diffèrent selon l'axe antéro-postérieur de l'embryon lors de l' allongement précoce 3 7. Ces résultats ont motivé l'élaboration de nouvelles mesures ciblant spécifiquement les étapes d'allongement précoce ou tardive et d'autres mesures permettant la caractérisation de la morphologie des embryons le long de leur axe antéro-postérieur lors de l'allongement précoce.
Ces nouveaux procédés consistent à mesurer la longueur des embryons au début et à la fin de l'allongement précoce, ainsi que la largeur de leur ilannonces et les queues. 7 Deux protocoles ont également été développés pour mesurer la longueur des larves nouvellement écloses, synchronisé à l' étape L1 7.
Les coquilles des embryons de les protéger contre le traitement d'hypochlorite alcalin alors que les larves, les adultes et les bactéries présentes dans les milieux de culture sont dissous par le traitement. Ce traitement est ensuite utilisé pour purifier les embryons provenant d' une population non synchronisée contenant une majorité des adultes bien nourris 8. La restriction alimentaire est utilisé pour synchroniser les larves nouvellement écloses. Mesurer la longueur de ces larves est ensuite utilisé pour détecter des défauts d'allongement. Cette mesure est préférable à la mesure des larves arrêtés sur des plaques de culture parce que les larves qui éclosent de non-entièrement embryons allongés peut récupérer à "longueur normale" lors de l'alimentation, mais maintiendra leur taille réduite lors de son arrestation en l'absence de nourriture.
Ici, nous présentons des protocoles détaillés permettant la mesure du chierngth d'allonger les embryons ainsi que la largeur de la tête et la queue à l'aide de time-lapse DIC microscopie et l'analyse de l'image (Protocole 1). Nous fournissons également des protocoles détaillés pour mesurer la longueur des larves synchronisée par analyse d'image (protocole n ° 2) et Flow-cytométrie (protocole n ° 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit les nouveaux paramètres pour caractériser début et fin des phases d'allongement embryonnaire.
Dans la section 1, l'étape critique est la présence potentielle de bactéries sur le pad. Les embryons sont hermétiquement enfermés entre le patin et la lamelle lors de l'acquisition d'image. La lame d'étanchéité est nécessaire pour éviter la dessication des animaux lors de l'acquisition d'une durée de plus de deux heures. À notre connai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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