新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
その短いライフサイクル：ほぼ50年間、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）が開発、神経生物学、進化、宿主-病原体相互作用などで重要な問題を研究するための強力なモデルとしての地位を確立して1開発の研究では、このモデルの強さはです3日;これらの動物は、遺伝的に改変することができる容易さ。ほとんどが子宮外で生きている動物とその開発における細胞の変位と形態の観察を可能にするその透明。線虫の発達段階は、成人期に続いて、胚形成および4幼虫期（L4へL1）を伴います。胚発生時には、表皮の形態形成は、細胞が、彼らは彼らの接合部を再編成し、それらの個々の形態だけでなく、機能性上皮内での相対的位置を変更する方法を、グループとして移動する方法上皮のより良い理解を可能にする能力についてかなりの注目を集めました。表皮の形態形成は4段階に分かれています。背側表皮細胞の再編成からなる背インターカレーションは、皮下組織と呼ばれます。このように、上皮細胞単層における胚を包む腹側正中線に向かって腹側皮下細胞の遊走になる腹側筐体;初期および後期の伸び虫様幼虫に豆の形胚を変換します。以下の形態形成、胚のハッチとL1幼虫は、その直接の環境で利用可能な細菌を使用して供給し始めます。
胚性の伸びは、したがって、胚発生の後期です。これは、その長手方向軸に沿って胚の伸長と横直径の減少から成ります。これは、皮下細胞の形状の劇的な変更を伴います。伸びが初期および後期段階に分割されています。体壁の筋肉がワットで1.75倍の段階で、収縮開始時に初期の段階ではコンマ段階で開始し、終了しますILD型（wt）胚-非伸長胚と比較して、長さの1.75倍である胚に対応します。その段階で生じる形態形成のプロセスは、主に胚2の前後軸に沿ってその伸びを駆動皮下細胞の先端極に位置するフィラメント状アクチン束（FBS）の収縮によって駆動されます。政府短期の収縮は3キナーゼLET-502 / ROCK、MRCK-1とPAK-1 5によるミオシン軽鎖のリン酸化による制御です。体壁の筋肉が機能するようになると契約を起動したときに、伸びの後期相は、開始されます。これは、背側と腹側の皮下細胞に体壁の筋肉からメカノシグナリングを含み、動物が3を孵化たときに終了します。
伸び欠陥は、一般的に胚のように死んで動物の割合（胚致死性; EMB）を特徴とし、L1幼虫（幼虫逮捕表現型として、その発症を阻止するもの、左心室a）および重量よりも大幅に短くなる。発育停止の段階の同定は、死んだ胚の顕微鏡観察を必要とし、幼虫3-6を逮捕しました 。
最近、このようないくつかのCdc42 / RacのレギュレータとエフェクターPIX-1などの遺伝子、及びPAK-1は、両方の初期および後期伸び3,7の間に形態形成のプロセスを制御することが示されました。また、最近、形態形成のプロセスは早期に伸び、3〜7の間の胚の前後軸に沿って異なることを示しました。これらの知見は、特に初期の伸びの間にそれらの前後軸に沿った胚の形態の特徴付けを可能にする初期または後期の伸長段階およびその他のメトリックをターゲットに新たな評価指標の開発の動機。
これらの新規な方法は、それらの幅ならびに開始時および初期の伸長の終了時に、胚の長さを測定することからなる、彼広告や尾。7 2つのプロトコルはまた、L1ステージ7で同期、新たに孵化した幼虫の長さを測定するために開発されました。
幼虫、成虫および培養培地中に存在する細菌を処理することによって溶解させながら、胚の卵殻は、アルカリ性の次亜塩素酸処理に対してそれらを保護します。この処理は、次に、よく供給成人8の大部分を含む非同期集団から胚を精製するために使用されます。食事制限は、新たに孵化した幼虫を同期させるために使用されます。これらの幼虫の長さを測定し、次いで伸長欠陥を検出するために使用されます。孵化幼虫は、非完全に伸長した胚は、給紙時に「通常の長さ」に回復することができますが、食品の非存在下での逮捕時に彼らの小型化を維持するため、この測定は、培養プレート上で逮捕幼虫の測定よりも好ましいです。
ここでは、ルの測定を可能にする詳細なプロトコルを提示しますタイムラプスDIC顕微鏡と画像解析（プロトコル1）を使用して、胚だけでなく、自分の頭と尾の幅を長くするngth。我々はまた、画像解析（プロトコル2）およびフローサイトメトリー（プロトコル3）を使用して同期幼虫の長さを測定するための詳細なプロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、胚性の伸びの初期および後期段階を特徴づけるために新たなメトリックを説明しました。
セクション1では、重要なステップは、パッド上の細菌の潜在的な存在です。胚は気密パッドと画像取得時のカバーガラスの間に封入されています。スライドを密閉する2時間以上持続取得中に動物の乾燥を避けるために必要とされます。我々の知る限りでは、ス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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