소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em> 예쁜 꼬마 선충</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
짧은 라이프 사이클 : 거의 50 년 동안 선충 예쁜 꼬마 선충 개발, 신경 생물학, 진화, 호스트 병원체 상호 작용 등의 중요한 문제를 연구하는 강력한 모델로 자리 매김 한 개발의 연구에서이 모델의 강도에 달려있다 삼일의; 이러한 동물은 유전자 조작 될 수있는 용이성; 대부분 여분의 자궁이다 살아있는 동물과 개발에 세포 변위 및 형태의 관찰을 가능하게 투명성. 선충의 발달 단계는 성인이 다음에 배아 네 애벌레 단계 (L4에 L1)를 포함한다. 배아 발생 동안, 표피 형태 형성 세포는 그들의 접합부를 재구성하는 방법을 그룹으로 마이그레이션 방법 상피의 더 나은 이해를 가능하게하고 개별적인 형태뿐만 아니라 기능적 상피 세포 내에서의 상대 위치를 수정하는 능력에 상당한 관심을 끌었다.표피의 형태 형성은 네 단계로 구분됩니다 지느러미 표피 세포의 구조 조정에 구성된 지느러미 인터에서, 하피라고 함; 따라서 상피 세포 단층의 배아를 감싸는 복부 정중선으로 복부 피하 세포의 이동에 구성된 복부 인클로저; 초기와 후기 신장 벌레 모양의 유충에 콩 모양의 배아를 변환. 다음과 같은 형태 형성, 배아 해치 및 L1 유충은 즉시 환경에서 사용 가능한 박테리아를 사용하여 먹이를 시작합니다.
배아 신장 따라서 배아 발달의 후기이다. 그것은 그것의 길이 방향 축을 따라 배아의 확장과 가로 직경의 감소로 구성되어 있습니다. 이것은 피하 세포의 형상 급격한 변형을 포함한다. 신장은 초기와 후기로 나누어진다. 몸 벽 근육이 w의 1.75 배 단계에서 계약 시작할 때 초기 단계는 쉼표 단계에서 시작 및 종료ILD 형 (중량) 배아 – 비 신장 배아에 비해 길이의 1.75 배입니다 배아에 대응. 그 단계에서 발생하는 형태 형성 공정은 주로 두 배의 안테 – 후방 축에 그들의 연장 운전 피하 세포의 꼭대기에 위치한 극 액틴 필라멘트 다발 FBS ()의 수축에 의해 구동된다. 이물 제거의 수축 세 키나제 LET-502 / ROCK, MRCK-1, PAK-1 (5)에 의해 미오신 라이트 체인의 인산화에 의해 컨트롤입니다. 몸 벽 근육의 기능이되어 계약을 시작할 때 신장의 후기가 시작됩니다. 그것은 지느러미와 복부 피하 세포에 몸 벽 근육에서 mechanotransduction 신호를 포함하고 동물 3 부화 할 때 끝납니다.
및 L1 유충 (애벌레 체포 표현형으로 그 체포 그들의 개발, 신장 결함은 일반적으로 배아로 죽어가는 동물의 비율 (EMB 배아 치사)을 특징으로 레벨a) 및 중량보다 훨씬 짧은 것을. 발달 체포의 단계의 확인은 죽은 태아의 현미경 관찰을 필요로하고 유충 3-6을 체포했다.
그것은 최근에 같은 Cdc42 / 라 세미 레귤레이터 및 이펙터 PIX-1과 박-1, 여러 유전자가, 초기와 후기 신장 3,7 둘 중에 형태 형성 과정을 제어하는 것으로 나타났다. 우리는 또한 최근에 형태 형성 과정 초기 신장 3 ~ 7시 배아의 안테 – 후방 축을 따라 차이가 있음을 보여 주었다. 이러한 연구 결과는 특히 초기 신장 동안 자신의 안테 – 후방 축을 따라 배아의 형태의 특성을 가능하게 일찍 또는 늦게 신장 단계 및 기타 측정을 대상으로 새로운 지표의 개발 동기를 부여.
이러한 새로운 방법은 폭뿐만 아니라 처음부터 초기 신장 끝에 배아의 길이를 측정하는 구성 그광고 및 꼬리. 7 두 프로토콜은 또한 L1 단계 7에서 동기화 새로 부화 유충의 길이를 측정하기 위해 개발되었다.
유충, 성인 및 배양액에 존재하는 세균이 처리에 의해 용해되는 동안 배아 달걀 껍질 알칼리 처리 염소산으로부터 보호. 이러한 처리 후, 잘 공급 성인 (8)의 대부분을 함유하는 비 – 동기화 집단으로부터 배아를 정화하는데 사용된다. 식품 제한은 새로 부화 유충을 동기화하는 데 사용됩니다. 이들 유충의 길이를 측정하는 것은 다음 신장 결함을 검출하기 위해 사용된다. 에서 부화 유충이 아닌 완전히 신장 배아가 공급 될 때 "정상 길이"로 복구 할 수 있지만, 음식이없는 구속 할 때 자신의 소형화를 유지하기 때문에이 측정은 배양 플레이트에 구속 유충의 측정보다 선호된다.
여기서는 르의 측정을 가능 상세한 프로토콜을 제시경과 DIC 현미경과 화상 해석 (1 프로토콜)을 사용하여 배아뿐만 아니라 헤드의 폭과 신장의 꼬리 ngth. 또한 화상 해석 (프로토콜 2) 플로우 세포 계측법 (3 프로토콜)을 사용하여 동기화 된 유충의 길이를 측정하기위한 구체적인 프로토콜을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 초기 특성화하는 새로운 메트릭 및 배아 신장의 후반 단계에 대해 설명합니다.
섹션 1에서 중요한 단계는 패드 박테리아의 잠재적 인 존재이다. 배아는 밀봉 패드와 이미지 수집시 커버 슬립 사이에 동봉되어 있습니다. 슬라이드를 씰링하는 두 시간 이상 지속 취득 중에 동물의 탈수를 방지하기 위해 필요하다. 우리의 지식, 슬라이드와 커버 슬립 사이의 아가?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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