無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出
Summary
この記事では、 顔を同時に検出し、細胞内の一酸化窒素（NO）とスーパーオキシドアニオン（O 2の可視化エンための蛍光色素ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用して適応が比較的容易な方法を記載しています.- ）は、それぞれ、肥満マウスモデルの新たに単離された無傷の大動脈です。
Abstract
内皮NOシンターゼ（eNOSの）から製造された内皮由来一酸化窒素（NO）は、心臓血管生理学の中で最も重要な血管保護分子の一つです。そのようなのeNOSの脱共役としての機能不全のeNOSは、スーパーオキシドアニオンにおけるNO生物学的利用能および増加の減少につながる（O 2 .-）の生産、ひいては心血管疾患を促進します。したがって、内皮細胞におけるNOとO 2 .-レベルの適切な測定は、心血管疾患や合併症の研究のために極めて重要です。なぜならNO及びO 2 .-の極めて不安定な性質のため、測定及びO 2 .-直接血管内のが困難です。多くの方法は、NOとO 2 .-産生を測定するために開発されています。しかしながら、いずれかの非感受性、または非特異的な、または技術的に要求され、特別な装置を必要とします。ここでは、適応を説明します顔を同時に検出し、細胞内のNOとO 2の可視化エン .-誘発性肥満マウスモデルの無傷の大動脈で、それぞれ、細胞透過性ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用するための蛍光色素法の高脂肪食負荷によって。我々は、細胞内のNOを減少し、コントロールリーンマウスと比較して、O 2 .-肥満マウスの新たに単離された無傷の大動脈内のレベルを高め実証できました。我々は、この方法は、NOとO 2の直接検出と可視化.-無傷の血管のための簡単な技術であり、広く（生理）病理学的条件下での内皮（DYS）関数の調査のために適用することができることを実証しています。
Introduction
血管内皮細胞は、血管作動性因子1を放出することによって血管の機能的および構造的完全性を維持します。これらの要因の中では、内皮NOシンターゼ（eNOSの）を介して、L-アルギニンから生成された内皮由来一酸化窒素（NO）は、心臓血管生理学2の中で最も重要かつ最もよく特性要因です。 NOは、平滑筋の弛緩を引き起こし、細胞増殖を阻害し、したがって血管疾患の発達3に対する保護、内皮下の空間に血小板凝集、および炎症性細胞接着および浸潤を抑制する。加齢、高血圧、糖尿病、高脂血症などを含む多くの生理学的および病理学的条件下では、することを特徴と内皮機能障害は、NO生物学的利用能を低下させず、O 2を増加させた .-生産が存在し、アテローム性動脈硬化症2の病因を促進します。近年の研究では、eNOSのの脱共役であることを実証しています様々な上記条件1,4の下でのeNOSの酵素は、O 2を生成する内皮機能不全、.-代わりにNOのための重要なメカニズム。したがって、内皮機能の分析は、特に、NO産生を内皮ず、O 2 .-世代は、心血管疾患や合併症に関する実験的研究のために極めて重要です。
生物学的サンプル中のNO産生を分析せず、測定するために開発されてきた多数の方法論的アプローチがあります。容易にNO 2に酸化されるNOの極めて不安定な性質のために–及びNO 3 – 3〜6秒の半減期で、直接測定しないことは困難です。したがって、NO 2の決意– / NO 3 –流体サンプル中の細胞または組織5から放出されたNOの指標としました。手順は比較的容易であるが、この方法は、しかしながら、EA/ NO 3 – –溶液中に含まれるsily安定したNO 2の高いバックグラウンドによって影響を受けます。 NOは、環状グアノシン一リン酸（cGMP）6を生成するために可溶性グアニル酸シクラーゼを刺激するため、細胞のcGMPレベルはまた、NO放出7を推定しないと判定されました。繰り返しますが、これは間接的な推定値であり、そのようなC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）のようないくつかの内皮由来の要因も、粒子状グアニル酸シクラーゼ8の活性化を介してcGMPレベルを高める可能性があるので、特定できない場合があります。 NOは、副生成物9、L-シトルリン生産の測定は、したがって、NO産生を推定しないように間接的な方法として使用されているように、L-シトルリンの生成とL-アルギニンから生成されます。この方法の主な欠点は、それが放射性であり、それは、生物活性NOレベルを測定しないことがあり、O 2によってNOが急速に不活性化することができた解放以来.-。また、L-シトルリンは、L-ためにリサイクルすることができます10アルギニン 。このような化学発光検出11、電子スピン共鳴12、または電気化学ポルフィリンNOセンサ13などの他の化学的方法は、いくつかの研究者によって使用されています。これらの方法は、通常、検出手順の動作が容易ではなく、特殊な装置を必要とします。これは、多くの研究は、内皮機能を評価し、間接的に内皮由来NO媒介血管弛緩を測定するために、内皮の有無にかかわらず、単離された血管と器官槽実験を適用することを言及することもあります。それは生理学的状況に主に近いですが、厳密に言っているが、NO機能を測定しません。しかし、この方法では、それはむしろeNOSの機能の正味の影響を反映し、一般的に内皮媒介血管運動応答、他の内皮由来弛緩の生産を評価します要因と内皮由来契約要因、O 2 .-の生産、また、平滑筋細胞の応答これらの要因に。 eNOSの機能またはNO産生の具体的な分析は、通常3を必要とされています。
我々を含む多くの研究グループは、近年NO 14〜19の細胞内産生を検出する蛍光色素法を使用しています。この方法では、細胞透過性の蛍光標識ジアミノ-2アセテート（DAF-2DA）は、in vitroまたはex vivo での細胞および生体組織中の遊離NOおよびNOS機能を測定しました。原理は、生きた細胞内で、DAF-2DAは、その後、NOと反応させることにより、DAF-2トリアゾール（DAF-2T）を蛍光性に変換した非蛍光4,5-ジアミノ（DAF-2）に細胞内エステラーゼにより脱アセチル化されていることです。 DAF-2Tからの蛍光は、蛍光顕微鏡または蛍光共焦点顕微鏡14で観察することができます。細胞内の蛍光強度は、したがって、細胞の細胞内NO産生または無傷の血液vesse内の内皮を反映しますリットル。このようなジヒドロ（DHE）のような特定の蛍光染料と組み合わせることで、1は、同時に細胞または血管14に細胞内NOとO 2 .-世代を評価することができます。同様に、DHEはまた、O 2 .-、細胞内で酸化された細胞透過性化合物、および酸化物であるその後、蛍光顕微鏡や蛍光共焦点顕微鏡により定量的に検出可能な鮮やかな赤色を発光する核酸とインターカレー。 DHEは、O 2を検出するための非常に特異的な色素である.-生物学的試料から、それは本質的に、スーパーオキシドラジカルを検出すると、細胞によって十分に保持され、さらに穏やかな固定20を許容することができます。この蛍光色素法の利点の一つは、それが検出され、直接に生体血管の無傷内皮層の面エン NOおよび/ またはO 2を .-可視化することです。
本論文では、我々は、この蛍光色素NOを検出する方法とO 2 .-私たちはNOとO 2の顔検出専用のために適合している.-高脂肪食（HFD）の給電により誘導される肥満モデルマウスの無傷の大動脈でについて説明します。我々は、このメソッドが正常にかつ確実にNOとO 2 .-レベルを測定し、肥満で新たに単離した無傷のマウスの大動脈の内皮層中のeNOS（DYS）機能を評価することができることを実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
NOまたはO 2の検出は、.-蛍光色素で頻繁に組織の凍結切片23にも培養内皮細胞における多くの研究で使用されました。ここでは、 顔のNOの検出とO 2 .-、比較的単純で、かつ直感的に有効であるそれぞれDAF-2DAとDHE、と内皮層におけるレベル途中 、 すなわち 、無傷の生きた血管、この方法を拡張しました。血管の凍結切片での方法と?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
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