Summary
この記事では、 顔を同時に検出し、細胞内の一酸化窒素（NO）とスーパーオキシドアニオン（O 2の可視化エンための蛍光色素ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用して適応が比較的容易な方法を記載しています.- ）は、それぞれ、肥満マウスモデルの新たに単離された無傷の大動脈です。
Abstract
内皮NOシンターゼ（eNOSの）から製造された内皮由来一酸化窒素（NO）は、心臓血管生理学の中で最も重要な血管保護分子の一つです。そのようなのeNOSの脱共役としての機能不全のeNOSは、スーパーオキシドアニオンにおけるNO生物学的利用能および増加の減少につながる（O 2 .-）の生産、ひいては心血管疾患を促進します。したがって、内皮細胞におけるNOとO 2 .-レベルの適切な測定は、心血管疾患や合併症の研究のために極めて重要です。なぜならNO及びO 2 .-の極めて不安定な性質のため、測定及びO 2 .-直接血管内のが困難です。多くの方法は、NOとO 2 .-産生を測定するために開発されています。しかしながら、いずれかの非感受性、または非特異的な、または技術的に要求され、特別な装置を必要とします。ここでは、適応を説明します顔を同時に検出し、細胞内のNOとO 2の可視化エン .-誘発性肥満マウスモデルの無傷の大動脈で、それぞれ、細胞透過性ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用するための蛍光色素法の高脂肪食負荷によって。我々は、細胞内のNOを減少し、コントロールリーンマウスと比較して、O 2 .-肥満マウスの新たに単離された無傷の大動脈内のレベルを高め実証できました。我々は、この方法は、NOとO 2の直接検出と可視化.-無傷の血管のための簡単な技術であり、広く（生理）病理学的条件下での内皮（DYS）関数の調査のために適用することができることを実証しています。
Introduction
血管内皮細胞は、血管作動性因子1を放出することによって血管の機能的および構造的完全性を維持します。これらの要因の中では、内皮NOシンターゼ（eNOSの）を介して、L-アルギニンから生成された内皮由来一酸化窒素（NO）は、心臓血管生理学2の中で最も重要かつ最もよく特性要因です。 NOは、平滑筋の弛緩を引き起こし、細胞増殖を阻害し、したがって血管疾患の発達3に対する保護、内皮下の空間に血小板凝集、および炎症性細胞接着および浸潤を抑制する。加齢、高血圧、糖尿病、高脂血症などを含む多くの生理学的および病理学的条件下では、することを特徴と内皮機能障害は、NO生物学的利用能を低下させず、O 2を増加させた .-生産が存在し、アテローム性動脈硬化症2の病因を促進します。近年の研究では、eNOSのの脱共役であることを実証しています様々な上記条件1,4の下でのeNOSの酵素は、O 2を生成する内皮機能不全、.-代わりにNOのための重要なメカニズム。したがって、内皮機能の分析は、特に、NO産生を内皮ず、O 2 .-世代は、心血管疾患や合併症に関する実験的研究のために極めて重要です。
生物学的サンプル中のNO産生を分析せず、測定するために開発されてきた多数の方法論的アプローチがあります。容易にNO 2に酸化されるNOの極めて不安定な性質のために-及びNO 3 - 3〜6秒の半減期で、直接測定しないことは困難です。したがって、NO 2の決意- / NO 3 -流体サンプル中の細胞または組織5から放出されたNOの指標としました。手順は比較的容易であるが、この方法は、しかしながら、EA/ NO 3 - -溶液中に含まれるsily安定したNO 2の高いバックグラウンドによって影響を受けます。 NOは、環状グアノシン一リン酸（cGMP）6を生成するために可溶性グアニル酸シクラーゼを刺激するため、細胞のcGMPレベルはまた、NO放出7を推定しないと判定されました。繰り返しますが、これは間接的な推定値であり、そのようなC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）のようないくつかの内皮由来の要因も、粒子状グアニル酸シクラーゼ8の活性化を介してcGMPレベルを高める可能性があるので、特定できない場合があります。 NOは、副生成物9、L-シトルリン生産の測定は、したがって、NO産生を推定しないように間接的な方法として使用されているように、L-シトルリンの生成とL-アルギニンから生成されます。この方法の主な欠点は、それが放射性であり、それは、生物活性NOレベルを測定しないことがあり、O 2によってNOが急速に不活性化することができた解放以来.-。また、L-シトルリンは、L-ためにリサイクルすることができます10アルギニン 。このような化学発光検出11、電子スピン共鳴12、または電気化学ポルフィリンNOセンサ13などの他の化学的方法は、いくつかの研究者によって使用されています。これらの方法は、通常、検出手順の動作が容易ではなく、特殊な装置を必要とします。これは、多くの研究は、内皮機能を評価し、間接的に内皮由来NO媒介血管弛緩を測定するために、内皮の有無にかかわらず、単離された血管と器官槽実験を適用することを言及することもあります。それは生理学的状況に主に近いですが、厳密に言っているが、NO機能を測定しません。しかし、この方法では、それはむしろeNOSの機能の正味の影響を反映し、一般的に内皮媒介血管運動応答、他の内皮由来弛緩の生産を評価します要因と内皮由来契約要因、O 2 .-の生産、また、平滑筋細胞の応答これらの要因に。 eNOSの機能またはNO産生の具体的な分析は、通常3を必要とされています。
我々を含む多くの研究グループは、近年NO 14〜19の細胞内産生を検出する蛍光色素法を使用しています。この方法では、細胞透過性の蛍光標識ジアミノ-2アセテート（DAF-2DA）は、in vitroまたはex vivo での細胞および生体組織中の遊離NOおよびNOS機能を測定しました。原理は、生きた細胞内で、DAF-2DAは、その後、NOと反応させることにより、DAF-2トリアゾール（DAF-2T）を蛍光性に変換した非蛍光4,5-ジアミノ（DAF-2）に細胞内エステラーゼにより脱アセチル化されていることです。 DAF-2Tからの蛍光は、蛍光顕微鏡または蛍光共焦点顕微鏡14で観察することができます。細胞内の蛍光強度は、したがって、細胞の細胞内NO産生または無傷の血液vesse内の内皮を反映しますリットル。このようなジヒドロ（DHE）のような特定の蛍光染料と組み合わせることで、1は、同時に細胞または血管14に細胞内NOとO 2 .-世代を評価することができます。同様に、DHEはまた、O 2 .-、細胞内で酸化された細胞透過性化合物、および酸化物であるその後、蛍光顕微鏡や蛍光共焦点顕微鏡により定量的に検出可能な鮮やかな赤色を発光する核酸とインターカレー。 DHEは、O 2を検出するための非常に特異的な色素である.-生物学的試料から、それは本質的に、スーパーオキシドラジカルを検出すると、細胞によって十分に保持され、さらに穏やかな固定20を許容することができます。この蛍光色素法の利点の一つは、それが検出され、直接に生体血管の無傷内皮層の面エン NOおよび/ またはO 2を .-可視化することです。
本論文では、我々は、この蛍光色素NOを検出する方法とO 2 .-私たちはNOとO 2の顔検出専用のために適合している.-高脂肪食（HFD）の給電により誘導される肥満モデルマウスの無傷の大動脈でについて説明します。我々は、このメソッドが正常にかつ確実にNOとO 2 .-レベルを測定し、肥満で新たに単離した無傷のマウスの大動脈の内皮層中のeNOS（DYS）機能を評価することができることを実証します。
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Protocol
動物の作業はフリブール、スイスの獣医事務所の倫理委員会によって承認されました。プロトコルは、私たちの施設で動物のケアと実験のガイドラインに従います。
単離された動脈のインキュベーションのためのセットアップの調製
- 37℃に加熱し、炭素ガスタンクから95％O 2および5％CO 2を通気することができる器官浴システムを構築します。
- 以下の組成物の濃度に必要な量のクレブス-リンガー重炭酸緩衝液を準備します（118のNaCl、4.7のKCl、2.5mMのCaCl 2を、1.2 mMの硫酸マグネシウム、1.2 mMのKH 2 PO 4、25mMのNaHCO 3を、0.026 mMのEDTA、および11.1 mMのD-グルコース）。
- 氷上ストック緩衝を維持し、95％O 2および5％CO 2でバッファを通気。
- オーガンバスシステム上のスイッチ、37℃に温度を設定し、各チャンバーにすぐに使用できるバッファの5ミリリットルを追加95％O 2および5％CO 2でバッファを通気保ちます。
- 30分間クレブス - リンガー緩衝液で1回チャンバーを洗浄します。
- 各チャンバーに5ミリリットルクレブス - リンガー緩衝液を添加し、蒸発を避けるために、チャンバーをカバーしています。
マウス大動脈の2の単離
- マウスを犠牲にする150 10mg / kgの濃度で腹腔内の0.9％NaClに溶解されたペントバルビタールを注入します。
- 手術用ボードに無気力にマウスを置きます。
- 消毒や水分の目的のために70％エタノールで胸部の毛スプレー。
- 心臓や肺を露出させ、肺を除去するために、リブの周りに切断してオープン胸腔。
- ティッシュペーパーで軽く胸腔内の血液を除去します。
- ピンセットでそっと心をつかみ、手術用ハサミで大動脈と背骨の間の血管周囲脂肪組織を切断することにより、胸部大動脈を切り離します。
- すぐにwholを浸します氷冷（4℃）クレブス - リンガー緩衝の電子組織。
- 解剖顕微鏡下で心臓や大動脈弓を削除し、バッファに胸部大動脈セグメントを保ちます。
- 手術用ハサミやピンセットで顕微鏡下で血管周囲の組織を接着するから無料大動脈を解剖。
- 鉗子で大動脈の端縁をつかみ、ゆっくり26 G×1 / 2"シリンジでクレブス - リンガーバッファをフラッシュすることにより、血管の内腔に血液を洗い流します。
- 3ミリメートル長いセグメントに洗浄大動脈輪をカットします。
注：内皮層に損傷を与えないために、この段階で注意を払ってください。
3. DHEとDAF-2DA染色
- 37℃のクレブス-リンガー緩衝液で満たされた臓器槽チャンバに鉗子で洗浄大動脈セグメントを転送するには、95％O 2および5％CO 2を通気。
鉗子で大動脈環のタッチだけ外膜側をaとbを固定しないでください注：lood船。 - 30分間器官槽チャンバ内の動脈を平衡化します。
- 最終濃度1μMの器官槽にアセチルコリン（AChの）を追加し、10分間動脈をインキュベートします。
- 1.5ミリリットルマイクロチューブに予め温めたクレブス - リンガー緩衝液で（千×ストックから希釈した各色素の5μM）DHE / DAF-2DA溶液1mlを準備します。光暴露を避けるためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。
- 刺激後、37℃でマイクロ遠心チューブにDHE / DAF-2DA溶液に器官浴から大動脈環を転送、95％O 2および5％CO 2を通気し、30分間大動脈環をインキュベートします。
注：このステップから、暗闇の中で常に大動脈を保ちます。 - 洗浄のためにクレブス - リンガー緩衝液で新しいマイクロチューブに大動脈輪を移し、1分以内に洗浄を3回繰り返します。
- 30固定のために4％パラホルムアルデヒド溶液に大動脈環を転送します分。
- 準備1ミリリットル4 '、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内のバッファを持つ（千×ストックから希釈した300 nMの、）6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）ソリューション。 3分間の大動脈を対比染色。
- 1分間の洗浄のためにPBS緩衝液で新しいマイクロチューブに大動脈を転送します。洗浄を3回繰り返します。
注：大動脈輪をクランプまたは内皮層を傷つけないよう注意してください。
4. アンフェイスマウント
- スライドにマウンティング培地のドロップを追加します。
- ロールアップ大動脈を平らにし、スライドガラス上に下向きに内皮とマウンティング媒体に顔エンそれをマウントし、顕微鏡下で顕微はさみで縦方向に大動脈リングをカット。前後に大動脈を移動しないでください。
- カバースリップとスライドを覆い、マニキュアとスライドを封印。
- 光保護下に空気乾燥した後、悲惨な画像化するためのスライドを使用CTLY時間以内または今後数日間、-20℃で保管してください。
5.共焦点顕微鏡イメージング
- 蛍光シグナルを検出するために、共焦点顕微鏡を使用してください。マシンに切り替えて、このような倍率、スキャン速度、分解能、Zスタックなどの画像設定を最適化。
- このプロトコルでは、200 Hzの走査速度、1024×1024ピクセルの解像度および0.25μmでのZ-ステップサイズを使用します。一方、514 nmでのDHEから蛍光を励起し、605 nmの発光で検出し、488nmのアルゴンレーザーをDAF-2DAから蛍光を励起し、515 nmで検出します。
- DAPI信号が紫外線を透明になるまで、サンプルに焦点を当てる10X倍率を使用し、その後、40倍の倍率に目標を調整します。
- コントロールパネル上のZ位置を調整することにより、内皮層の範囲を定義します。 DAPI染色された核の信号は、内皮層における楕円形や円形のドットです。
- 上からスキャン内皮信号と記録画像の全厚を通る試料の（内腔の境界線上に内皮層）。各サンプルを走査するための少なくとも3つの異なるフィールドを選択してください。
画像の6.分析
- 共焦点顕微鏡によってスキャンしたデータを開くためにソフトウェアを使用してください。分析のためのフィールドごとに3つの連続した画像を選択し、サンプルあたり少なくとも3つの異なるフィールドを評価します。選択した画像をエクスポートし、JPEGファイルとして保存します。
- 画像処理ソフトでDAF-2DA、DHE及びDAPI染色から画像を定量化します。 DAPI染色からの画像は、DAPI陽性の核の数をカウントする「プラグイン」→「分析」→「セルカウンター 'を選択します。
- DAF-2DAとDHE染色からの画像では、信号の強度を分析し、相対シグナル強度として「平均」の値を取る→「メジャー ''を分析する」を選択します。 DAF-2DAの比にとして存在し、結果DAPI陽性核またはDAPIに対するDHEの比率。各サンプルについて、すべての画像およびフィールドの平均値をとります。
- 倍の変化を取得するには、対照群の平均値で各サンプルの結果を割ります。統計分析は、ダネットまたはボンフェローニ事後検定を用いて不対スチューデントt検定またはANOVAを用いて行きました。平均±SEMとしてデータを与えます。 p <0.05の14で有意で、平均値の差を考慮してください。
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Representative Results
肥満は虚血性冠動脈性心疾患の重要な危険因子であり、関連するとNOの生物学的利用能、アテローム性動脈硬化性血管疾患21の特徴を内皮ない減少します。 eNOSの-脱共役内 皮22老化を含む多くの生理学的および病理学的条件下での機能不全、アテローム性動脈硬化症、及び肥満14の重要なメカニズムであることが示されています。そこで、ここではNOとO 2の代表的な結果.-大動脈内のレベルを示すためにリーンと肥満マウスを比較します。
10.6％の脂肪、27.6パーセントのタンパク質、および57％の炭水化物、繊維4.8％：エネルギー量; 7週齢で開始し、雄マウス（C57BL / 6J）は、通常の固形飼料（NCのいずれかに14週の間の自由なアクセスを与えられました）または高脂肪食（HFD、エネルギー含有量：55％脂肪、21％のタンパク質、および24％炭水化物）。 HFDマウスの14週間であった後に犠牲にし、胸部大動脈を切開し、および付着組織を洗浄しました。 DAF-2DAとDHE染色工程の前に、eNOSのLN G阻害剤-Nitroarginineメチルエステル（L-NAME）（1 mm）をeNOSの活動14を遮断するために1時間風呂のチャンバーに加えました。代表的な共焦点蛍光結果は、 図1に示された上部パネルの青色はDAPIにより染色された内皮細胞の核を表します。中央のパネルでは、緑色はDAF-2Tからの蛍光シグナルは、緑色の信号の強度が高ければ、より多くのNOが細胞であることを意味NOで非蛍光DAF-2から変換されます。同様に、下のパネルの赤い色は、O 2 .-により酸化DHEからの蛍光シグナルであるので、より多くの赤色を示すサンプルは、複数のO 2 .-細胞内があります。
減少を明らかにした共焦点蛍光顕微鏡Dマウスの大動脈内皮層におけるNO産生（DAF-2DA染色）と増加したL-NAMEに敏感なO 2 .-世代（DHE染色）は、マウスのものがNC（ 図1）14供給に比べてHFDを与えません肥満でのeNOS-脱共役を示唆しています。信号は、バーグラフ14で定量化し、提示されました。
それぞれ図1のeNOS-脱共役肥満インチ NOとO 2の顔検出エン共焦点顕微鏡.- DAF-2DAとDHE染色により、。 N = 5。 ***はp <NC対0.005;†††のp <HFD群対0.005。スケールバー= 0.1ミリメートル。 （データが参照14からのものであった） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
NOまたはO 2の検出は、.-蛍光色素で頻繁に組織の凍結切片23にも培養内皮細胞における多くの研究で使用されました。ここでは、 顔のNOの検出とO 2 .-、比較的単純で、かつ直感的に有効であるそれぞれDAF-2DAとDHE、と内皮層におけるレベル途中 、 すなわち 、無傷の生きた血管、この方法を拡張しました。血管の凍結切片での方法と比較して、この方法は、より低いバックグラウンドを示し、動脈のメディアにおける弾性繊維の凍結切片において、特に大動脈が特定NOまたはO 2と干渉する可能性が非常に強い自己蛍光シグナルを与えるので、より定量的です。 -内皮細胞で生成された信号。また、内側平滑筋細胞におけるNADPHオキシダーゼまたはその他の酵素によって特異的O 2 .-生成も妨害する可能性が血管の凍結切片を用いる方法の欠点を表し、血管のセクション、中の内皮細胞内シグナルと。対照的に、 アン顔染色方法は、無傷の血管セグメントの内皮層からの特異的シグナルを検出し、したがって、より正確な分析を与えます。凍結切片の調製のためのクライオスタット機も高価な投資です。他の生化学的方法と比較すると、この方法の主な制限はあまり定量的であるが、それはサンプル間の相対的な比較のために良い選択です。また、高価な共焦点顕微鏡の要件は、この方法の制限であってもよいです。多臓器チャンバーシステムは便利であり、これはラボで利用できない場合、チューブ内の血管があるように、人は簡単、水浴や規制制度と炭素ガスのタンクに接続されているチューブを使用してシステムを構築することができます37℃に保ち、95％O 2および5％COで通気 一つは注意を払う必要があるいくつかの重要なステップがあります。血管周囲の組織は簡単に取り付けのために洗浄されることを確認してください。彼らは人工的な信号を発生させ、蛍光シグナルを阻害するおそれがありますので、血管内腔における血塊は、洗い流されなければなりません。血管の準備、インキュベーション、洗浄、切断および取付けの全手順の間に、1は、血管の内皮層を損傷しないように非常に慎重でなければなりません。準備の全手順の間の血管乾燥させてはいけません。 DHEとDAF-2DAはそう大動脈が常に光の暴露から保護されるべきである染色工程から開始し、両方の蛍光プローブです。固定前に大動脈の内皮細胞が生きている必要があり、ステップので、大動脈は、常に95％O 2および5％CO 2で曝気クレブス-リンゲル緩衝液中で維持されるべきです。サンプルの画像は、調製後できるだけ早く取られるべきです。蛍光を発しますNCE信号があっても結果の精度に影響を与える可能性封入剤の保護、と数日中に弱くなります。この方法は、厚すぎる血管壁と血管のために適用されない場合があります。 この方法は、NOとO 2の同時想像を可能.-生産を完全な血管の内皮層に、2つの色素が一緒に血管に追加された場合。 1つはまた、単離された血管のin vitroでの NOとO 2 .-生産に対する薬物の薬理効果を評価するために、このメソッドを使用することができます。この目的のために、洗浄大動脈は、通常、一つの制御用であり、もう一つは、薬物治療のためのものであり、DAF-2DAとDHEステップを染色する前に薬剤が平衡した後、インキュベーション緩衝液に添加する必要があり、二つの部分に切断されます。この方法は、単離された血液vの血管運動応答の分析を、 例えば 、他の方法と一緒に使用される場合に、特に有用ですessels、内皮細胞の生理学的機能を確認することができます。この方法はまた、疾患モデルと機序の完全な血管の任意の内皮（DYS）関数の分析に適していなければなりません。 要約すると、我々は同時に、蛍光共焦点顕微鏡を用いて、無傷の血管の内皮層にNOとO 2 .-産生を検出するための単純なプロトコルを提示しました。我々は、このメソッドが正常に肥満のマウスモデルで働いていた方法を示しています。この方法は、多くの血管疾患条件下での内皮NOの調査とO 2 .-生産に有用な技術です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) | Sigma-aldrich | N5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health (NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| Coverslip round diameter 15 mm | VWR | 631-1579 | |
| Tips 1 ml | VWR | RFL-1200c | |
| Tips 200 μl | VWR | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
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