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Biology

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Published: February 25, 2016 doi: 10.3791/53718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert.

Abstract

Endothelium-derived Stickstoffmonoxid (NO) aus endothelialen NO-Synthase (eNOS) ist einer der wichtigsten vasoprotektiven Moleküle in kardiovaskulären Physiologie. Dysfunktionalen eNOS wie Entkopplung von eNOS führt in NO Bioverfügbarkeit und Erhöhung Superoxidanion (O 2 .-) Produktion und fördert wiederum kardiovaskulären Erkrankungen zu verringern. Daher sind entsprechende Messung von NO und O 2 .- Ebenen in den Endothelzellen entscheidende für die Erforschung von Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Aufgrund der extrem labile Natur von NO und O 2 .-, ist es schwierig zu messen , NO und O 2 .- direkt in ein Blutgefäß. Es wurden zahlreiche Verfahren NO zu messen entwickelt und O 2 .- Produktion. Es ist jedoch entweder insensitive oder unspezifisch, oder technisch anspruchsvoll und erfordert eine spezielle Ausrüstung. Hier beschreiben wir eine Anpassungdes Fluoreszenzfarbstoffs Verfahren für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären NO und O 2 .- Die zellpermeabel Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) mit jeweils in intakten Aorten von einer Adipositas - Mausmodell induziert von hohem Fettgehalt-Diät Fütterung. Wir zeigen , könnten intrazellulären NO verringert und eine verbesserte O 2 .- Ebenen in den frisch isolierten intakten Aorten von Maus Fettleibigkeit zur Kontroll lean Maus verglichen. Wir zeigen , dass diese Methode ist eine einfache Technik für die direkte Erfassung und Visualisierung von NO und O 2 .- in den intakten Blutgefäßen und kann in weiten Bereichen für die Untersuchung der endothelialen (dys) Funktion unter (Physio) pathologischen Bedingungen angewendet werden.

Introduction

Die vaskulären Endothelzellen halten Gefäß funktionelle und strukturelle Integrität von vasoaktiven Faktoren 1 freigibt . Unter diesen Faktoren Endothelium derived Stickstoffmonoxid (NO) , hergestellt aus L-Arginin durch endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist das wichtigste und am besten charakterisierte Faktor in kardiovaskulären Physiologie 2. NO verursacht Entspannung der glatten Muskulatur und hemmt die Zellproliferation hemmt die Thrombozytenaggregation und entzündliche Zelladhäsion und Infiltration in den subendothelialen Raum, also Gefäßerkrankung Entwicklung 3 zum Schutz vor. Unter vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, einschließlich der alternden Gesellschaft, Hypertonie, Diabetes, Hyperlipidämie, usw., verringert dadurch die endotheliale Dysfunktion durch NO Bioverfügbarkeit und erhöhte O 2 .- Produktion vorhanden ist , und fördert die Pathogenese der Atherosklerose 2. Studien aus den letzten Jahren zeigen, dass Entkopplung von eNOS ist einwichtiger Mechanismus für die endotheliale Dysfunktion, in dem das eNOS - Enzym erzeugt O 2 .- anstelle von NO, unter den verschiedenen zuvor erwähnten Bedingungen 1,4. Daher Analyse der Endothelfunktion, insbesondere endotheliale NO - Produktion und 2 O .- Generation ist von zentraler Bedeutung für die experimentelle Forschung auf Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen.

Es gibt zahlreiche methodische Ansätze, die NO-Produktion zu analysieren und zu messen in biologischen Proben entwickelt wurden. Aufgrund der extrem labile Art von NO zu NO , das leicht oxidiert wird 2 - und NO 3 - mit einer Halbwertszeit von 3 bis 6 sec, ist es schwierig , NO direkt zu messen. Daher Bestimmung der NO 2 - / NO 3 - in den Flüssigkeitsproben wurde als ein Index von NO aus Zellen oder Geweben freigesetzt 5 verwendet. Obwohl das Verfahren relativ einfach ist, ist das Verfahren jedoch easily durch hohe Hintergrund des stabilen NO betroffen 2 - / NO 3 - in der Lösung enthalten ist . Da NO löslichen Guanylatcyclase stimuliert zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) 6, die zellulären cGMP - Spiegels zu erzeugen , hat sich auch die NO - Freisetzung zu schätzen 7 bestimmt ist. Auch dies ist eine indirekte Schätzung und nicht spezifisch sein kann, da auch die Aktivierung cGMP - Spiegel durch von cyclase partikulären Guanylat verbessern könnten einige Endothel-abgeleitete Faktoren, wie C-Typ natriuretischen Peptid (CNP) 8. NO wird aus L-Arginin mit der Erzeugung von L-Citrullin als einem Nebenprodukt 9 Messung von L-Citrullin Produktion produziert daher auch als indirekte Verfahren verwendet wird , die NO - Produktion zu schätzen. Die Hauptnachteile dieses Verfahrens sind , dass es radioaktiv ist und es nicht bioaktiven NO Ebenen messen, da NO rasch freigesetzt durch O 2 .- inaktiviert werden könnten; Darüber hinaus kann L-Citrullin recycelt werden, um L-Arginin 10. Andere chemische Methoden wie Chemolumineszenznachweise 11, Elektronenspinresonanz - 12, oder elektro Porphyrin - NO - Sensor 13 werden von mehreren Forschern verwendet. Diese Methoden sind in der Regel nicht einfach in Betrieb, Erkennung Verfahren und erfordern spezielle Ausrüstung. Es ist auch zu erwähnen, dass viele Studien Organbad Experimente mit isolierten Blutgefäße mit oder ohne Endothelium anwenden Endothelfunktion zu bewerten und indirekt Endothelium derived NO vermittelten vaskulären Relaxationen messen. Dieses Verfahren ist jedoch, obwohl sie meist in der Nähe der physiologischen Situation ist, aber streng zu sagen, nicht messen keine Funktion, er bewertet, eher Endothel-vermittelte vasomotorischen Reaktionen im Allgemeinen, die Nettoeffekte der eNOS Funktion widerspiegeln, die Produktion von anderen Endothel-derived relaxing Faktoren und Endothel-abgeleiteten Auftraggeber Faktoren, die Produktion von O 2 .-, und auch die Reaktionen von glatten Muskelzellenzu diesen Faktoren. Eine spezifische Analyse der eNOS - Funktion oder die NO - Produktion ist in der Regel 3 erforderlich.

Viele Forschungsgruppen einschließlich der unsrigen haben in den letzten Jahren die Fluoreszenzfarbstoff - Methode verwendet , um die intrazelluläre Produktion von NO 14-19 erkennen. Bei diesem Verfahren wurde die zellpermeabel Fluoreszenzindikator Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) verwendet , um freie NO und NOS - Funktion in lebenden Zellen und Geweben in vitro oder ex vivo zu messen. Das Prinzip ist, dass in den lebenden Zellen, DAF-2DA wird durch intrazelluläre Esterase zu nicht fluoreszierenden 4,5-Diaminofluorescein (DAF-2) deacetyliert die dann umgewandelt DAF-2 Triazol fluoreszierend (DAF-2T), indem Sie mit NO reagieren . Die Fluoreszenz von DAF-2T können unter einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenz konfokalen Mikroskop 14 beobachtet werden. Die intrazelluläre Fluoreszenzintensität spiegelt daher die intrazelluläre NO-Produktion in den Zellen oder das Endothel eines in intakten Blut vessel. In Kombination mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff wie Dihydroethidium (DHE), kann man gleichzeitig intrazellulären NO und O 2 .- Erzeugung in den Zellen oder in Blutgefäßen 14 beurteilen. In ähnlicher Weise ist auch eine DHE zellpermeablen Verbindung , die durch 2 O oxidiert wird .- innerhalb der Zellen, und das Oxidationsprodukt dann interkaliert mit Nukleinsäuren durch Fluoreszenz - Mikroskop oder Fluoreszenz konfokalen Mikroskop eine leuchtend rote Farbe nachweisbar quantitativ zu emittieren. DHE ist ein sehr spezifischer Farbstoff zum Nachweis von O 2 .- aus biologischen Proben, wie sie im wesentlichen Superoxidradikalen erkennt, zurückgehalten wird und durch die Zellen, und sogar leichte Fixierung 20 tolerieren kann. Einer der Vorteile dieses Fluoreszenzfarbstoffes Verfahrens ist , dass es erkennt und visualisiert NO und / oder O 2 .- en face direkt auf der intakten Endothelschicht eines lebenden Blutgefßes.

In diesem Papier,Wir beschreiben diese Methode Fluoreszenzfarbstoff NO und O 2 zu erkennen .- , die wir für en Gesichtserkennung von NO und O 2 angepasst .- in intakten Aorten von einer Adipositas - Maus - Modell von hohem Fettgehalt-Diät (HFD) Fütterung induziert. Wir zeigen , dass diese Methode erfolgreich konnte und zuverlässig messen NO und O 2 .- Ebenen und eNOS (dys) -Funktion in der Endothelschicht frisch isolierten intakten Maus Aorten in Fettleibigkeit zu bewerten.

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Protocol

Tier Arbeit wurde von der Ethikkommission der Veterinäramt Fribourg, Schweiz genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien für die Tierpflege und Experimentieren an unserer Hochschule.

1. Herstellung eines Set-up für die Inkubation von isolierten Arterien

  1. Konstrukt ein Organbad System , das auf 37 ° C erhitzt werden kann und belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 aus einem Kohlenstoffgastank.
  2. Bereiten so viel Krebs-Ringer - Bicarbonat - Puffer , wie mit der Konzentration der folgenden Zusammensetzung benötigt: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0,026 mM EDTA und 11,1 mM D-glucose).
  3. Halten Sie die Lager - Puffer auf Eis und belüften den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2.
  4. Schalten Sie das Organbad System, stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C, 5 ml der ready-to-use-Puffer zu jeder Kammerund halten Sie den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2 Belüften.
  5. Waschen Sie die Kammern einmal mit Krebs-Ringer-Puffer für 30 min.
  6. 5 ml Krebs-Ringer-Puffer in jeder Kammer und die Abdeckung die Kammer Verdampfung zu vermeiden.

2. Isolierung von Maus-Aorten

  1. Injizieren Pentobarbital, die in 0,9% NaCl intraperitoneal in einer Konzentration von 150 mg / kg, gelöst wird, um die Mäuse zu opfern.
  2. Legen Sie die Maus supinely auf einem OP-Brett.
  3. Besprühen das Fell des Brustbereich mit 70% Ethanol für die Zwecke der Hygienisierung und Feuchtigkeit.
  4. Offenen Brusthöhle um die Rippe durch Schneiden des Herzens und der Lunge, zu belichten und die Lungen zu entfernen.
  5. Entfernen Sie die Blut in den Brustraum leicht mit einem Papiertuch.
  6. Fassen Sie das Herz vorsichtig mit einer Zange und entfernen Sie die thorakalen Aorta durch die perivaskulären Fettgewebe zwischen der Aorta und der Wirbelsäule mit einer chirurgischen Schere schneiden.
  7. Tauchen Sie sofort die whole Gewebe in eiskaltem (4 ° C) Krebs-Ringer-Puffer.
  8. Entfernen Sie das Herz und Aortenbogen unter einem Präpariermikroskop und halten den thorakalen Aorta-Segment im Puffer.
  9. Präparieren Sie die Aorta frei von anhaftenden perivaskulären Gewebe unter dem Mikroskop mit einer chirurgischen Schere und Pinzette.
  10. Fassen Sie die Stirnkante der Aorta mit einer Zange, und spülen das Blut in das Gefäßlumen entfernt durch sanftes Spülen Krebs-Ringer-Puffer mit einem 26 G × 1 / 2" Spritze.
  11. Schneiden Sie die gereinigten Aorten-Ringe in 3 mm lange Segmente.
    Hinweis: Achten Sie bei diesem Schritt nicht Endothelschicht zu beschädigen.

3. DHE und DAF-2DA Anfärben

  1. Übertragen die gereinigten Aorten - Segmente mit einer Pinzette in das Organbad Kammern gefüllt mit Krebs-Ringer - Puffer bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2.
    Hinweis: Berühren Sie nur die adventitiellen Seite der Aorten-Ringe mit einer Pinzette und sie klemmen nicht blood Gefäße.
  2. Äquilibrieren die Arterien im Organbad Kammer für 30 min.
  3. Hinzufügen Acetylcholin (ACh) in das Organbad auf die Endkonzentration 1 uM, und inkubiere die Arterien für 10 min.
  4. Bereiten Sie 1 ml DHE / DAF-2DA-Lösung (5 & mgr; M jedes Farbstoffs, von 1000 × Lager verdünnt) mit vorgewärmten Krebs-Ringer-Puffer in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wickeln Sie das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie gegen Licht zu vermeiden.
  5. Nach der Stimulation übertragen die Aortenringen von Organbad zur DHE / DAF-2DA Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 und der Aortenringen für 30 min inkubieren.
    Hinweis: Von diesem Schritt halten die Aorten immer in Dunkelheit.
  6. Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit Krebs-Ringer-Puffer zum Waschen und wiederholen Sie die Wäsche dreimal innerhalb von 1 min.
  7. Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf 4% Paraformaldehydlösung zur Fixierung für 30Minute
  8. Vorbereitung 1 ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Lösung (300 nM, von 1000 × Vorrat verdünnt) mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) -Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Gegenfärbung der Aorten 3 min.
  9. Übertragen Sie die Aorten auf neue Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS-Puffer zum Waschen für 1 min. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
    Hinweis: Achten Sie darauf, nicht die Aorten-Ringe zu klemmen oder die endotheliale Schicht beschädigt werden.

4. En Face Montage

  1. Fügen Sie einen Tropfen Medium auf den Schlitten der Montage.
  2. Schneiden Sie die Aorten - Ringe in Längsrichtung mit mikro Schere unter dem Mikroskop, machen die zusammengerollten Aorten flach und montieren es en face auf dem Eindeckmedium mit dem Endothel auf dem Glasträger nach unten zeigt . Sie nicht die Aorten hin und her bewegen.
  3. Decken Sie die Folie mit Deckglas und versiegeln Sie die Folie mit Nagellack.
  4. Nach dem Trocknen an der Luft unter Lichtschutz, verwenden Sie die Folien für dire Abbildenctly innerhalb von Stunden oder lagern Sie sie bei -20 ° C für den nächsten paar Tage.

5. Konfokalmikroskopische Imaging

  1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop die Fluoreszenzsignale zu erkennen. Schalten Sie die Maschine und optimieren die Abbildungseinstellungen wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stack.
    1. Für dieses Protokoll verwenden, um eine 200 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 1.024 × 1.024 Pixeln und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Excite Fluoreszenz von DAF-2DA mit 488 nm Argonlaser und erfassen bei 515 nm, während erregen Fluoreszenz von DHE bei 514 nm und erfassen bei 605 nm Emission.
  2. Verwenden 10x Vergrößerungen auf die Probe zu konzentrieren, bis das DAPI-Signal mit ultravioletten Strahlen klar ist, und stellen Sie dann das Ziel zu 40X Vergrößerung.
  3. Definieren Sie den Bereich der endothelialen Schicht durch Einstellen der Z-Position auf dem Bedienfeld. Die Signale von DAPI-gefärbten Kerne sind oval oder rund Punkten in der Endothelschicht.
  4. Scannen von oben(Endothelschicht auf der Lumen Grenze) der Probe durch die gesamte Dicke der endothelialen Signal und Aufzeichnen von Bildern. Wählen mindestens 3 verschiedene Felder für jede Probe abtastet.

6. Analyse der Bilder

  1. Verwenden Sie Software, um die Daten zu öffnen, durch konfokale Mikroskop gescannt. Wählen Sie drei aufeinander folgende Bilder pro Feld für die Analyse und Bewertung von mindestens 3 verschiedenen Feldern pro Probe. Exportieren Sie die ausgewählten Bilder und speichern Sie sie als JPEG-Dateien.
  2. Quantifizieren Sie die Bilder von DAF-2DA, DHE und DAPI Färbung mit Bildverarbeitungs-Software. Für das Bild von DAPI-Färbung, wählen Sie "Plugins" → "Analysieren" → "Zellzähler" die Anzahl der DAPI positiven Kern zu zählen.
    1. Für die Bilder von DAF-2DA und DHE-Färbung, wählen Sie "Analysieren" → "Maßnahme" die Intensität der Signale zu analysieren, und nehmen Sie die "mittlere" Wert als die relative Signalintensität. Vorhanden dann die Ergebnisse als Verhältnis von DAF-2DA zuDAPI positiven Kerne oder das Verhältnis von DHE zu DAPI. Für jede Probe nehmen Sie den Mittelwert von jedem Bild und Feld.
  3. Teilen Sie das Ergebnis jeder Probe durch den Mittelwert der Kontrollgruppe die Falte Änderung zu erhalten. Die statistische Analyse wurde mit ungepaarten Student t-Test oder ANOVA mit Dunnett oder Bonferroni post-Test durchgeführt. Geben Daten als Mittelwert ± SEM. Betrachten wir Unterschiede in der Mittelwerte als signifikant bei p <0,05 14.

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Representative Results

Adipositas ist ein wichtiger Risikofaktor für ischämische koronare Herzkrankheit und ist assoziiert mit einer verminderten NO - Bioverfügbarkeit Endothelzellen, ein Markenzeichen von atherosklerotischen Gefäßerkrankung 21. eNOS-Entkopplung wurde gezeigt , einen wichtigen Mechanismus der endothelialen Dysfunktion bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Zuständen zu sein , einschließlich der Alterungs 22, Atherosklerose und Adipositas 14. Daher hier vergleichen wir die schlanken und fettleibigen Mäusen die repräsentatives Ergebnis von NO zu zeigen und O 2 .- Ebenen in den Aorten.

10,6% Fett, 27,6% Protein und 57% Kohlenhydrate, Ballaststoffe 4,8%: Energiegehalt, ab dem Alter von 7 Wochen die männliche Mäuse (C57BL / 6J) hatten freien Zugang während 14 Wochen entweder mit einem normalen Futter (NC gegeben ) oder eine fettreiche Ernährung (HFD, Energiegehalt: 55% Fett, 21% Protein und 24% Kohlenhydrate). Nach 14 Wochen der HFD-Mäuse warengetötet und thorakalen Aorten seziert und von anhaftendem Gewebe gereinigt. Vor DAF-2DA und DHE Schritt Anfärben Inhibitor die eNOS LN G -Nitroarginine methylester (L-NAME) (1 mM) wurde 1 h zum Badkammer hinzugefügt eNOS - Aktivität 14 zu blockieren. Die repräsentativen konfokalen Fluoreszenz Ergebnisse wurden in Abbildung 1 dargestellt. Die blaue Farbe in der oberen Platte stellt den Kern von Endothelzellen gefärbt durch DAPI. Im mittleren Bereich werden die grüne Farbe der Fluoreszenz-Signal von DAF-2T von der nicht-fluoreszierenden DAF-2 durch NO, die, wenn die Intensität der grünen Signaleinrichtung umgewandelt wird, höher ist, gibt es mehr NO in den Zellen. In ähnlicher Weise ist die rote Farbe in der unteren Platte das Fluoreszenzsignal von DHE oxidiert durch O 2 .-, so dass die Probe mehr rote Farbe hat mehr O zeigt 2 .- in den Zellen.

Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigte, Abnahmed NO - Produktion (DAF-2DA Färbung) und eine erhöhte L-NAME empfindlichen O 2 .- Generation (DHE - Färbung) in der Aorta Endothelschicht der Mäuse gefüttert HFD im Vergleich zu derjenigen der Mäuse gefüttert NC (Abbildung 1) 14, was darauf hindeutet, eNOS-Entkopplung der Fettleibigkeit. Die Signale wurden in den Balkendiagrammen 14 quantifiziert und dargestellt.

Abbildung 1
Abbildung 1. eNOS-Entkopplung der Fettleibigkeit. Konfokalmikroskopische en Gesichtserkennung von NO und O 2 .- von DAF-2DA und DHE - Färbung auf. n = 5; *** p <0,005 vs NC; ††† p <0,005 vs HFD - Gruppe. Maßstabsbalken = 0,1 mm. ( Die Daten wurden von Referenz 14) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Der Nachweis von NO oder O 2 .- mit Fluoreszenzfarbstoffen wurde in vielen Studien in kultivierten Endothelzellen und auch in Gewebe Kryoabschnitte 23 häufig verwendet. Hier erweiterten wir diese Methode , um intakte lebende Blutgefäße, dh en Gesichtserkennung von NO und O 2 .- Ebenen in der Endothelschicht mit DAF-2DA und DHE verbunden, die wirksam ist, relativ einfach und intuitiv. Im Vergleich mit dem Verfahren in vaskulären Kryoschnitte zeigt diese Methode niedrigeren Hintergrund und ist quantitativ, da elastischen Fasern in den Medien einer Arterie insbesondere der Aorta in den Kryoschnitten sehr starke Autofluoreszenzsignale ergeben , die mit dem spezifischen NO oder O 2 stören könnten. - Signale in Endothelzellen erzeugt. Darüber hinaus spezifische O 2 .- Generation von NADPH - Oxidase oder andere Enzyme in den medialen glatten Muskelzellen könnte auch störenmit den Signalen in Endothelzellen im Gefäßabschnitt, der den Nachteil des Verfahrens mit vaskulären Kryoschnitte darstellt. Im Gegensatz dazu erkennt die en face Färbemethode Signale gezielt von der endothelialen Schicht eines Blutgefäßsegment intakt und daher gibt genauere Analyse. Kryostat Maschine für Kryoschnittes Vorbereitung ist auch eine teure Investition. Im Vergleich zu anderen biochemischen Verfahren ist die Hauptbeschränkung dieses Verfahrens weniger quantitativ, aber es ist eine gute Wahl für einen relativen Vergleich zwischen den Proben. Darüber hinaus, die die Anforderung eines konfokalen Mikroskops teuer ist, kann auch eine Beschränkung dieses Verfahrens sein. Die Multi-Organ-Kammer-System ist praktisch und, wenn dies nicht im Labor ist, kann man leicht ein System mit Wasserbad und Rohre herzustellen, die an ein Kohlenstoffgastank mit Regulierungssystem verbunden sind, so dass die Blutgefäße in den Rohren sind bei 37 ° C und belüftet mit 95% O 2 und 5% CO gehalten

Es gibt einige wichtige Schritte, die man Aufmerksamkeit zu zahlen hat. Achten Sie darauf, dass das perivaskuläre Gewebe für eine einfache Montage gereinigt. Die Blutgerinnsel in das Gefäßlumen muss weggespült werden, da sie künstliche Signale verursachen kann und mit den Fluoreszenzsignale stören. Während der gesamten Prozedur der Blutgefäß Vorbereitung, Inkubation, Waschen, Schneiden und Montage muss man sehr vorsichtig sein, nicht die endotheliale Schicht der Blutgefäße zu beschädigen. Nicht das Blutgefäß trocken während des gesamten Verfahrens der Vorbereitung lassen. DHE und DAF-2DA sind beide Fluoreszenzsonden, so aus dem Färbeschritt beginnen die Aorten sollte immer von Lichtbestrahlung geschützt werden. Vor der Fixierung die Endothelzellen von Aorten Schritt am Leben sein müssen, so sollten die Aorten immer in der mit 95% O 2 und 5% CO 2 begast Krebs-Ringer - Puffer gehalten werden. Bilder der Proben sollten so bald wie möglich nach ihrer Herstellung zu entnehmen. Die fluoreszierennce Signal wird schwächer werden in wenigen Tagen auch mit dem Schutz der Befestigungsmittel, das die Genauigkeit der Ergebnisse auswirken können. Das Verfahren kann nicht für Blutgefäße mit zu dick Gefäßwand an.

Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Phantasie von NO und O 2 .- Produktion in der endothelialen Schicht der intakten Blutgefäßen, wenn die zwei Farbstoffe an den Blutgefäßen zusammen addiert wurden. Man kann auch diese Methode verwenden , um die pharmakologischen Wirkungen von Drogen auf NO und O 2 .- Produktion in vitro in isolierten Blutgefäßen zu bewerten. Zu diesem Zweck wird das gereinigte Aorta in der Regel in zwei Teile geschnitten, einer ist für die Steuerung und die andere ist für die medikamentöse Behandlung und das Arzneimittel sollte dem Inkubationspuffer nach Äquilibrierung hinzugefügt werden, bevor DAF-2DA und DHE Schritt Anfärbung. Es ist besonders nützlich, wenn dieses Verfahren mit einem anderen Verfahren verwendet wird , zusammen, beispielsweise mit der Analyse von vasomotorischen Reaktionen von isolierten Blut vessels, eine physiologische Funktion von Endothelzellen bestätigt werden kann. Dieses Verfahren ist für die Analyse von jedem endothelial (dys) Funktion in intakten Blutgefäßen von Krankheitsmodellen und die zugrunde liegenden Mechanismen auch geeignet sein.

Zusammenfassend stellten wir ein einfaches Protokoll , um gleichzeitig NO erkennen und O 2 .- Produktion in Endothelschicht intakten Blutgefäßen mit einem Fluoreszenz - konfokalen Mikroskop. Wir zeigen, wie diese Methode erfolgreich bei Adipositas Mausmodell gearbeitet. Dieses Verfahren ist eine nützliche Technik bei der Untersuchung der endothelialen NO und O 2 .- Produktion unter vielen vaskulären Krankheitszuständen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

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References

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Molecular Biology Ausgabe 108 Arterien konfokale Mikroskopie DHE DAF-2DA Endothel Stickstoffoxid Superoxid-Anion Gefäßbiologie
<em>En Gesichtserkennung</em> von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien
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Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P.,… More

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

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