Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En Face Detection оксида азота и супероксид в эндотелиальный слой малонарушенных артериях

Published: February 25, 2016 doi: 10.3791/53718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

Summary

В этой статье мы опишем , приспособленный относительно простой метод с использованием флуоресценции красителя diaminofluorescein-2 диацетат (DAF-2DA) и dihydroethidium (DHE) для фас одновременного обнаружения и визуализации внутриклеточного оксида азота (NO) и супероксиданиона (O 2 .- ) соответственно, в свежевыделенные неповрежденные аортах модели ожирения мыши.

Abstract

Эндотелием оксида азота (NO), произведенный из эндотелиальной NO-синтазы (Енос) является одним из наиболее важных вазопротективных молекул в сердечно-сосудистой физиологии. Неблагополучные Енос , такие как разобщение Эноса приводит к снижению NO биодоступности и увеличением супероксиданиона (O 2 .-) производства, а также в свою очередь , способствует сердечно - сосудистых заболеваний. Поэтому, соответствующее измерение NO и O 2 .- уровней в эндотелиальных клетках являются ключевыми для исследования сердечно - сосудистых заболеваний и осложнений. Из-за чрезвычайно лабильный характер NO и О 2 .-, что трудно измерить НЕТ и O 2 .- непосредственно в кровеносный сосуд. Многочисленные методы были разработаны для измерения NO и O 2 .- производство. Это, однако, либо нечувствительным или неспецифический, или технически сложных и требует специального оборудования. Здесь мы опишем адаптациюметода флуоресцентного красителя для фас одновременного обнаружения и визуализации внутриклеточного NO и O 2 .- с использованием клеточной проницаемой diaminofluorescein-2 диацетат (DAF-2DA) и dihydroethidium (ДНЕ), соответственно, в неповрежденных аортах модели ожирения мыши индуцированных путем кормления с высоким содержанием жиров-диеты. Мы могли бы продемонстрировать снизился внутриклеточного NO и повышение O 2 .- уровней в свежеизолированных неповрежденных аорте ожирения мышей по сравнению с контрольной постного мыши. Показано , что этот метод является простым методом для непосредственного обнаружения и визуализации NO и O 2 .- в неповрежденных кровеносных сосудов и может широко применяться для исследования эндотелиальной функции (DYS) при (физио) патологических состояний.

Introduction

Сосудистые эндотелиальные клетки сосудов сохранить функциональную и структурную целостность путем высвобождения вазоактивных факторов 1. Среди этих факторов, эндотелием оксида азота (NO) , полученного из L-аргинина с помощью эндотелиальной NO-синтазы (Енос) является наиболее важным и лучше всего характеризуется фактором в сердечно - сосудистой физиологии 2. НЕТ вызывает расслабление гладких мышц и ингибирует клеточную пролиферацию, ингибирует агрегацию тромбоцитов и воспалительную клеточную адгезию и проникновение в субэндотелиальном пространство, следовательно , защита против развития сосудистого заболевания 3. При многих физиологических и патологических состояний, в том числе старение, гипертензия, диабет, гиперлипидемия и т.д., дисфункция эндотелия характеризуется сниженная биодоступностью и увеличение O 2 .- производство присутствует и способствует патогенеза атеросклероза 2. Исследования, проведенные в последние годы, показывают, что разобщение Эноса являетсяВажным механизмом эндотелиальной дисфункции, в котором фермент Енос генерирует O 2 .- вместо NO, при различных вышеуказанных условиях 1,4. Таким образом, анализ эндотелиальной функции, в частности, эндотелиальной NO производства и O 2 .- поколение имеет ключевое значение для экспериментальных исследований сердечно - сосудистых заболеваний и осложнений.

Существуют многочисленные методологические подходы, которые были разработаны для анализа и не измерить никакого производства в биологических образцах. Из - за чрезвычайно лабильный характер NO , который легко окисляется до NO 2 - и NO 3 - с периодом полураспада от 3 ​​до 6 сек, то измерить трудно NO напрямую. Поэтому определение NO 2 - / NO 3 - в жидких образцах использовали в качестве показателя NO высвобождаемого из клеток или тканей 5. Хотя процедура относительно легко, метод, однако, Э.А.Sily воздействию высокой фоне стабильного NO 2 - / NO - 3 , содержащегося в растворе. Поскольку NO стимулирует растворимую гуанилатциклазу для получения циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) 6, клеточный уровень цГМФ также установлено , чтобы оценить не высвобождают 7. Опять же , это косвенной оценки и не может быть специфическим, так как некоторые эндотелием факторы , такие , как С-типа натрийуретического пептида (CNP) также может повысить уровни цГМФ путем активации частиц гуанилатциклазы 8. ОТСУТСТВИЕ получают из L-аргинина с генерацией L-цитруллина в качестве побочного продукта , 9, измерение L-цитруллин производства, следовательно , также используется как косвенный метод, чтобы оценить продукцию NO. Основными недостатками этого метода является то, что он является радиоактивным и он не измеряет биоактивные уровни NO, так как НЕТ Наличие релиза может быть быстро инактивируется O 2 .-; Кроме того, L-цитруллин может быть переработана в L-Аргинин 10. Другие химические методы , такие как обнаружение хемилюминесценции 11, электронного спинового резонанса 12 или электрохимического порфиринового NO датчика 13 используются несколькими исследователями. Эти методы, как правило, не так просто в эксплуатации, процедуры обнаружения и требуют специального оборудования. Следует также отметить, что во многих исследованиях применяются эксперименты ванночку с изолированными кровеносных сосудов с или без эндотелием для оценки эндотелиальной функции и косвенного измерения эндотелием NO опосредованную сосудистых релаксаций. Тем не менее, этот метод, хотя он в основном близок к физиологической ситуации, но строго говоря, не не измеряет NO функции, она скорее оценивает эндотелий-опосредованные ответы вазомоторные в целом, отражающие характер влияния функции Enos, производство другой эндотелием отдыха факторы и эндотелием факторы Тунинг, производство O 2 .-, а также ответы клеток гладкой мускулатурык этим факторам. Конкретный анализ функции ENOS или NO производства, как правило , требуется 3.

Многие исследовательские группы , включая наши в последние годы использовали метод флуоресцентной красителя для обнаружения внутриклеточных производства NO 14-19. В этом методе индикаторный элемент проницаемой флуоресценции diaminofluorescein-2 диацетат (DAF-2DA) использовали для измерения NO и свободную функцию NOS в живых клетках и тканях в пробирке или экс естественных условиях. Принцип, что в живых клетках, ДАФ-2DA является деацетилируется внутриклеточным эстеразы к нефлуоресцентном 4,5-diaminofluorescein (DAF-2), который затем превращают в флуоресцентный DAF-2 триазола (DAF-2t) путем взаимодействия с NO , Флуоресценцию от DAF-2T можно наблюдать под флюоресцентным микроскопом или флуоресцентного конфокального микроскопа 14. В связи с этим интенсивность флуоресценции внутриклеточного отражает внутриклеточную продукцию NO в клетках или эндотелий показа в неповрежденной Вессе кровил. В сочетании со специфическим флуоресцентным красителем , такие как dihydroethidium (ДНЕ), можно одновременно оценить внутриклеточного NO и O 2 .- поколение в клетках или в кровеносных сосудах 14. Точно так же, ДНЕ также клетка-проницаема соединение , которое окисляется О 2 .- внутри клеток, и окислительное продукт затем встраивается с нуклеиновыми кислотами , чтобы излучать ярко - красный цвет обнаруживаемого количественно с помощью флуоресцентного микроскопа или флуоресцентного конфокального микроскопа. ДНЕ очень специфический краситель для обнаружения O 2 .- из биологических образцов, как она обнаруживает , по существу супероксидных радикалов, сохраняется хорошо клетками, и , возможно , даже переносят умеренную фиксацию 20. Одним из преимуществ этого метода флуоресценции красителя является то , что он обнаруживает и визуализирует NO и / или О 2 .- фас непосредственно на интактной эндотелиальной слой живой кровеносного сосуда.

В этой статье,мы опишем этот метод флуоресценции красителя для обнаружения NO и O 2 .- которую мы приспособили для собственной функции распознавания лиц от NO и O 2 .- в интактных аортах модели мышей с ожирением , вызванной высоким содержанием жира диета (HFD) кормления. Показано , что этот метод может успешно и надежно измерять NO и O 2 .- уровней и оценки функции Енос (DYS) в эндотелиальной слое свежеизолированных неповрежденных аорте мышей при ожирении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Работа животных была одобрена Комитетом по этике ветеринарной службы Фрибурга, Швейцарии. Протокол следует рекомендациям по уходу за животными и экспериментов в нашем институте.

1. Подготовка установки для Инкубация изолированных артериях

  1. Построить систему ванны органа , который может быть нагрет до 37 ° С и продувают 95% O 2 и 5% СО 2 из резервуара углерода газа.
  2. Приготовьте столько Кребса-Рингера бикарбонатный буфер при необходимости с концентрацией следующего состава: (118 мМ NaCl, 4,7 мМ КСl, 2,5 мМ CaCl 2, 1,2 мМ MgSO 4, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 25 мМ NaHCO 3, 0,026 мМ ЭДТА, и 11,1 мМ D-глюкозы).
  3. Держите фондовый буфер на льду и проветрить буфер с 95% O 2 и 5% CO 2.
  4. Включение системы органов ванны, установить температуру при 37 ° С, добавляют 5 мл готового к использованию буфера в каждую камеруи держать аэрацию буфер с 95% O 2 и 5% CO 2.
  5. Промыть камеры один раз буфером Кребса-Рингера в течение 30 мин.
  6. Добавьте 5 мл Кребса-Рингера буфера в каждую камеру и крышку камеры, чтобы избежать испарения.

2. Выделение мыши аорте

  1. Вводят фенобарбитал, который растворяют в 0,9% NaCl внутрибрюшинно в концентрации 150 мг / кг, чтобы принести в жертву мышей.
  2. Положите мышь безвольно на хирургической доске.
  3. Спрей мех области груди с 70% -ным этанолом для целей санитарной обработки и влаги.
  4. Открытый грудной полости путем разрезания вокруг ребра, чтобы обнажить сердце и легкие, а также удалить легкие.
  5. Удалите кровь в грудной полости аккуратно бумажной салфеткой.
  6. Возьмитесь сердце осторожно пинцетом и разделиться грудного отдела аорты путем разрезания периваскулярной жировой ткани между аортой и позвоночника с хирургическими ножницами.
  7. Немедленно погрузите Wholе ткани в охлажденной льдом (4 ° C) Кребса-Рингера буфера.
  8. Удалить сердце и дуги аорты под микроскопом рассечение и держать грудного отдела аорты сегмент в буфере.
  9. Рассеките аорту свободное от присоединения периваскулярной ткани под микроскопом с хирургическими ножницами и пинцетом.
  10. Возьмитесь за концевой край аорты с пинцетом, и смыть кровь в просвет сосудов, осторожно промывке Кребса-Рингера буфер с 26 G × 1 / 2" шприца.
  11. Нарежьте очищенные аортального кольца на длинные сегменты 3 мм.
    Примечание: Обратите внимание на этот шаг , чтобы не повредить эндотелиальную слой.

3. ДНЕ и DAF-2DA Окрашивание

  1. Передача вылеченных аортальных сегментов с пинцетом в орган ванны камер , заполненных Кребса-Рингера буфере при 37 ° C продувают 95% O 2 и 5% CO 2.
    Примечание: только прикоснуться к адвентициальных сторону колец аорты с пинцетом и не зажимать бLOOD судов.
  2. Равновесие артерии в ванне камере органа в течение 30 мин.
  3. Добавить ацетилхолин (АХ) в ванночку до конечной концентрации 1 мкМ и инкубировать артерии в течение 10 мин.
  4. Подготовка 1 мл раствора ДНЕ / ДАФ-2DA (5 мкМ каждого красителя, разведенного из 1000 × запаса) с предварительно подогретой буфером Кребса-Рингера в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Оберните микроцентрифужных трубку с алюминиевой фольгой, чтобы избежать попадания света.
  5. После стимуляции передачи колец аорты от органа ванны в раствор ДНЕ / DAF-2DA в микроцентрифужных трубки при 37 ° C продувают 95% O 2 и 5% СО 2 и инкубировать колец аорты в течение 30 мин.
    Примечание: С этого шага, держать всегда в аорты темноте.
  6. Передача колец аорты в новую пробирку микроцентрифужных с буфером Кребса-Рингера для промывки и промывку повторно три раза в течение 1 мин.
  7. Передача аортального кольца до 4% -ного раствора параформальдегида для фиксации в течение 30 минутминимум
  8. Готовят 1 мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) раствор (300 нМ, разбавляется от 1000 × запаса) с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) буфере в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Контрастное аорты в течение 3 мин.
  9. Передача в новой аорты микроцентрифужных трубки с буфером PBS для промывания в течение 1 мин. Промывку повторно три раза.
    Примечание: Обратите внимание, чтобы не зажать аортального кольца или повредить эндотелиальную слой.

4. фас Монтаж

  1. Добавьте каплю монтажа среды на слайд.
  2. Нарезать аортального кольца в продольном направлении с микрохирургической ножницами под микроскопом, делают свернутые Аорты плоский и смонтировать его в фас на монтажной среде с эндотелием стороной вниз на стекле. Не перемещайте аорты взад и вперед.
  3. Накройте слайд с покровным и запечатать слайд с лаком для ногтей.
  4. После сушки на воздухе под действием света защиты, использовать слайды для визуализации плачевнымиctly в течение нескольких часов или хранить их при температуре -20 ° С в течение следующих нескольких дней.

5. конфокальной микроскопических изображений

  1. С помощью конфокальной микроскопии для обнаружения сигналов флуоресценции. Включите машину и оптимизировать параметры обработки изображений, такие как увеличение, скорость сканирования, разрешение, Z-стек.
    1. Для этого протокола, используйте 200 Гц скорость сканирования, разрешение 1024 × 1024 пикселей и Z-размер шага 0,25 мкм. Excite флуоресценцию от DAF-2DA с аргоновым лазером 488 нм и обнаружение при 515 нм, в то время как возбуждают флуоресценцию от ДНЕ при 514 нм и обнаружения при 605 нм излучения.
  2. Используйте 10X увеличениях, чтобы сосредоточиться на образце, пока сигнал DAPI не ясно, с ультрафиолетовыми лучами, а затем отрегулировать задачу 40X увеличениях.
  3. Определить диапазон эндотелиальной слоя путем регулировки положения Z на панели управления. Сигналы DAPI-окрашенных ядер овальные или круглые точки в эндотелиальной слое.
  4. Сканирование с верхней(Эндотелиальный слой на границе светового потока) образца через всю толщину эндотелиальных сигнала и запись изображений. Выберите по крайней мере, 3 различных полей для сканирования каждого образца.

6. Анализ изображений

  1. Используйте программное обеспечение, чтобы открыть данные отсканированного с помощью конфокальной микроскопии. Выберите три последовательных изображений в поле для анализа и оценки, по меньшей мере 3 различных полей для каждой пробы. Экспорт выбранные изображения и сохранять их в виде файлов JPEG.
  2. Количественно изображения с DAF-2DA, ДНЕ и DAPI окрашивание с программным обеспечением для обработки изображений. Для получения изображения от DAPI окрашивания, выберите 'Плагины' → 'Анализ' → 'Счетчик клеток', чтобы подсчитать количество DAPI положительного ядра.
    1. Для получения изображений с DAF-2DA и DHE окрашивания, выберите 'Анализ' → 'Measure' для анализа интенсивности сигналов, и принимает значение '' означает, как относительной интенсивности сигнала. Присутствуют тогда результаты как отношение DAF-2DA кDAPI положительных ядер или отношение ДНЕ к DAPI. Для каждого образца принимают среднее значение каждого изображения и поля.
  3. Разделить результат каждого образца на среднее значение контрольной группы, чтобы получить кратное изменение. Статистический анализ проводили с непарный тест Стьюдента или дисперсионного анализа с Dunnett или Бонферрони послетестовом. Дайте данные в виде среднего значения ± SEM. Рассмотрим различия в средних значениях как значимыми при р <0,05 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ожирение является важным фактором риска развития ишемической ишемической болезни сердца и связано с уменьшением эндотелиальной биодоступности, отличительной чертой атеросклеротических сосудистых заболеваний 21. Енос-разобщение было показано, что является важным механизмом эндотелиальной дисфункции при многочисленных физиологических и патологических состояний , в том числе старение 22, атеросклероза и ожирения 14. Поэтому здесь мы сравним худых и тучных мышей , чтобы показать представительный результат NO и O 2 .- уровней в аорте.

Начиная с возраста 7 недель, самцы мышей (C57BL / 6J) имели свободный доступ в течение 14 недель, либо обычный чау (NC, содержание энергии: 10,6% жира, 27,6% белка и 57% углеводов, волокна 4,8% ) или высоким содержанием жиров (HFD, содержание энергии: 55% жира, 21% белка и 24% углеводов). Через 14 недель мышей HFD былиумерщвляли и грудные аорты были вскрыты, и очищены от прилипших тканей. Перед тем, ДАФ-2DA и ДНЕ шаг окрашивания, ингибитор Енос LN G -Nitroarginine Метиловый эфир (L-NAME) (1 мМ) добавляют в ванну камере в течение 1 ч , чтобы блокировать активность Enos 14. Представительные результаты конфокальной флуоресцентной были показаны на рисунке 1. Синий цвет в верхней панели представляет собой ядро эндотелиальных клеток , окрашенных DAPI. В средней панели, зеленый цвет сигнал флуоресценции от DAF-2T, преобразованного из нефлуоресцентной DAF-2 по NO, что означает, если интенсивность зеленого сигнала выше, есть больше NO в клетках. Кроме того , красный цвет в нижней панели является сигнал флуоресценции от ДНЕ окисляется О 2 .-, так что образец показывает более красный цвет имеет больше O 2 .- в клетках.

Конфокальной флуоресцентной микроскопии показали снижениеd NO производства (DAF-2DA окрашивание) и увеличение L-NAME-чувствительных O 2 .- поколения (ДНЕ окрашивание) в аортальном эндотелиальной слоя мышей кормили HFD по сравнению с мышей кормили NC (Рисунок 1) 14, предлагая ENOS-разъединение при ожирении. Сигналы были количественно определены и представлены в виде гистограмм 14.

Рисунок 1
Рисунок 1. Енос-разъединение при ожирении. Конфокальной микроскопическое ан обнаружения лица из NO и O 2 .- по DAF-2DA и DHE окрашивания соответственно. п = 5; *** р <0,005 против NC; ††† р <0,005 против группы HFD. Шкала бар = 0,1 мм. (Данные были из ссылки 14) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Обнаружение NO или O 2 .- с помощью флуоресцентных красителей часто используется во многих исследованиях в культивируемых эндотелиальных клетках , а также в ткани криосрезах 23. Здесь мы расширили этот метод неповрежденными живых кровеносных сосудов, то есть, еп обнаружения лица из NO и O 2 .- уровней в эндотелиальный слой с DAF-2DA и ДНЕ, соответственно, что является эффективным, относительно простой и интуитивной. По сравнению с методом сосудистых криосрезах, этот метод показывает более низкий фон и более количественный характер , так как упругие волокна в средствах массовой информации артерии особенно аорта в криосрезах дают очень сильные автофлюоресценции сигналы , которые могут помешать конкретным NO или O 2. - сигналы , генерируемые в эндотелиальных клетках. Кроме того, конкретные O 2 .- генерация NADPH - оксидаза или другими ферментами в медиальных клеток гладких мышц может также мешатьс сигналами в эндотелиальных клетках в сосудистой секции, которая представляет собой недостаток метода с сосудистыми криосрезах. В противоположность этому , фас метод окрашивания обнаруживает сигналы конкретно от эндотелиальный слой неповрежденного сегмента кровеносного сосуда и , следовательно , дает более точный анализ. Криостат машина для приготовления cryosection также дорогие инвестиции. По сравнению с другими биохимическими методами, главным ограничением этого метода является менее количественный, но это является хорошим выбором для относительного сравнения между образцами. Кроме того, требование конфокальный микроскоп, который является дорогостоящим, может также быть ограничением этого метода. Система полиорганной камера удобно и, если его нет в наличии в лаборатории, можно легко установить систему с водяной бани и трубок, которые соединены с резервуаром углерода газа с регулирующей системой, таким образом, что кровеносные сосуды в пробирки выдерживали при температуре 37 ° с и газированная с 95% O 2 и 5% CO

Есть несколько важных шагов, которые нужно обратить внимание. Убедитесь, что периваскулярная ткань очищается для легкого монтажа. Сгустки крови в просвет сосудов должен быть смыта, так как они могут вызвать искусственные сигналы и мешать флуоресцентных сигналов. В течение всей процедуры подготовки кровеносных сосудов, инкубации, промывки, резки и монтажа, необходимо быть предельно осторожными, чтобы не повредить эндотелиальную слой кровеносных сосудов. Не позволяйте сухой кровеносных сосудов в течение всей процедуры подготовки. ДНЕ и DAF-2DA являются флуоресцентные зонды, так что, начиная со стадии окрашивания аорты всегда должны быть защищены от воздействия света. Перед фиксацией шаг эндотелиальные клетки аорты должны быть живыми, поэтому Аорты должны быть всегда хранятся в буфере Кребса-Рингера с аэрированной 95% O 2 и 5% CO 2. Изображения образцов должны быть приняты как можно скорее после приготовления. флуоресцируетСигнал сть станет слабее в течение нескольких дней, даже с защитой монтажной среды, которые могут повлиять на точность результатов. Метод не может применяться для кровеносных сосудов слишком толстой стенки сосудов.

Этот метод позволяет одновременно воображение NO и O 2 .- производство в эндотелиальный слой интактных кровеносных сосудов, если две краски были добавлены к кровеносным сосудам вместе. Можно также использовать этот метод для оценки фармакологические эффекты препаратов на NO и O 2 .- производства в пробирке в изолированных кровеносных сосудов. Для этого очищенный аорта обычно разрезают на две части, одна для управления, а другой предназначен для лечения наркомании, а также препарат должен быть добавлен в инкубационном буфере после уравновешивания перед тем ДАФ-2DA и ДНЕ шаг окрашивания. Это особенно полезно, если этот метод используется вместе с другим методом, например, при анализе вазомоторных реакций изолированной крови Vessels, физиологические функции эндотелиальных клеток может быть подтверждено. Этот метод должен быть также пригоден для анализа любой функции эндотелия (DYS) в неповрежденных кровеносных сосудах моделей заболеваний и основных механизмов.

Таким образом, мы представили простой протокол для одновременного обнаружения NO и O 2 .- производство в эндотелиальной слое неповрежденных кровеносных сосудов с флуоресцентной конфокальной микроскопии. Мы покажем, как успешно работает этот метод в модели мыши с ожирением. Этот метод является полезным методом при исследовании эндотелиальной NO и O 2 .- производства при многих сосудистых заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
  2. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  3. Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
  4. Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
  5. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
  6. Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
  7. Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
  8. Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
  9. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
  10. Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
  11. Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
  12. Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
  13. Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
  14. Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
  15. Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
  16. Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
  17. Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
  18. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
  19. Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
  20. Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
  21. Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
  22. Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
  23. Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).

Tags

Молекулярная биология выпуск 108 Артерии конфокальной микроскопии ДНЕ DAF-2DA эндотелий оксид азота супероксиданиона сосудистой биологии
<em>En Face</em> Detection оксида азота и супероксид в эндотелиальный слой малонарушенных артериях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P.,… More

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter