Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Published: February 25, 2016 doi: 10.3791/53718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

Summary

في هذه المقالة وصفنا طريقة سهلة نسبيا تكييفها باستخدام صبغ مضان diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) وdihydroethidium (DHE) للأون كشف الوجه في وقت واحد وتصور أكسيد النيتريك داخل الخلايا (NO) وأنيون الفائق (O 2 .- ) على التوالي، في طازجة معزولة aortas سليمة من نموذج السمنة الماوس.

Abstract

المستمدة من البطانة أكسيد النيتريك (NO) المنتجة من البطانية NO-سينسيز (أنوش) هي واحدة من الجزيئات vasoprotective الأكثر أهمية في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية. مختلة أنوش مثل فك ربط أنوش يؤدي إلى انخفاض في NO التوافر البيولوجي وزيادة في أنيون الفائق (O 2 .-) الإنتاج، وهذا بدوره يعزز أمراض القلب والأوعية الدموية. لذلك، قياس مناسب من NO و O 2 .- المستويات في الخلايا البطانية تقوم بدور محوري للأبحاث حول أمراض القلب والأوعية الدموية ومضاعفات. بسبب طبيعة عطوب للغاية من NO و O 2 .-، فإنه من الصعب قياس NO و O 2 .- مباشرة في الأوعية الدموية. وقد وضعت طرق عديدة لقياس NO و O 2 .- الإنتاج. غير أنه، إما غير مبال، أو غير محددة، أو يتطلب تقنية عالية ويتطلب معدات خاصة. نحن هنا وصف والتكيفمن طريقة مضان صبغ للأون كشف في وقت واحد وجه والتصور من الخلايا NO و O 2 .- باستخدام خلية قابلة للاختراق diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) وdihydroethidium (DHE)، على التوالي، في aortas سليمة من نموذج السمنة التي يسببها الماوس عن طريق تغذية عالية الدهون النظام الغذائي. نحن يمكن ان يظهر نقص الخلايا NO وتعزيز O 2 .- المستويات في aortas سليمة المعزولة حديثا من الماوس السمنة بالمقارنة مع السيطرة الماوس العجاف. علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب هو أسلوب سهل للكشف المباشر والتصور من NO و O 2 .- في الأوعية الدموية سليمة، ويمكن تطبيقها على نطاق واسع للتحقيق في (DYS) وظيفة بطانة الأوعية الدموية تحت (طبيب) الحالات المرضية.

Introduction

خلايا بطانة الأوعية الدموية الحفاظ على سلامة الوظيفية والهيكلية الأوعية الدموية عن طريق الإفراج عن عوامل فعال في الأوعية 1. ومن بين هذه العوامل، المستمدة من البطانة أكسيد النيتريك (NO) المنتجة من L-أرجينين عبر البطانية NO-سينسيز (أنوش) هو العامل الأكثر أهمية وأفضل وصف في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية 2. لا يسبب استرخاء العضلات الملساء ويمنع تكاثر الخلايا، ويحول دون تراكم الصفائح الدموية والتصاق الخلايا الالتهابية والتسلل في الفضاء تحت البطانة، وبالتالي حماية ضد تطور أمراض الأوعية الدموية 3. في ظل العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك الشيخوخة، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري، وفرط شحميات الدم، وما إلى ذلك، الخلايا البطانية التي تتميز انخفض NO التوافر البيولوجي وزيادة O 2 .- الإنتاج الحالي ويعزز التسبب في تصلب الشرايين 2. وتبين دراسات من السنوات الأخيرة أن فك ربط أنوش هوآلية هامة لاختلال وظيفي البطانية، التي الإنزيم أنوش يولد O 2 .- بدلا من NO، تحت مختلف الظروف المذكورة أعلاه 1،4. لذلك، وتحليل وظيفة بطانة الأوعية الدموية، على وجه الخصوص، البطانية أي إنتاج وO 2 .- الجيل أمرا حيويا من أجل البحوث التجريبية على أمراض القلب والشرايين والمضاعفات.

هناك مقاربات منهجية العديدة التي تم تطويرها لتحليل وقياس أي إنتاج في العينات البيولوجية. ونظرا لطبيعة عطوب للغاية من NO الذي يتأكسد بسهولة إلى NO 2 - وNO 3 - وله عمر نصف من 3-6 ثانية، فإنه من الصعب قياس NO مباشرة. وقد استخدم في عينات السائل بمثابة مؤشر للNO صدر من الخلايا أو الأنسجة 5 - وبالتالي تحديد NO 2 - / NO 3. على الرغم من أن هذا الإجراء هو سهل نسبيا، فإن هذه الطريقة، ومع ذلك، عصامتتأثر SILY من خلفية عالية من NO مستقر 2 - / NO 3 - الواردة في الحل. لأنه لا يحفز ذوبان guanylate محلقة لإنتاج دوري غوانوزين الأدينوزين (المركب) 6، كما تم تحديد مستوى المركب الخلوي لتقدير NO إطلاق سراح 7. مرة أخرى، وهذا هو تقدير غير المباشر وقد لا تكون محددة، لأن بعض العوامل المشتقة من البطانة مثل C الببتيد الناتريوتريك نوع (CNP) ويمكن أيضا أن تعزز مستويات المركب من خلال تفعيل الجسيمات guanylate محلقة 8. لا يتم انتاجه من L-أرجينين مع جيل من L-سيترولين كناتج المنتج 9، قياس الإنتاج-L سيترولين ولذلك تستخدم أيضا طريقة غير مباشرة لتقدير أي إنتاج. العوائق الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها المشعة، وأنه لا قياس مستويات لا النشطة بيولوجيا، منذ صدر لا يمكن المعطل بسرعة عن طريق O 2 .-. وعلاوة على ذلك، L-سيترولين يمكن إعادة تدويرها إلى L-أرجينين 10. وتستخدم الطرق الكيميائية الأخرى مثل الكشف عن التوهج 11، والإلكترون تدور الرنين 12، أو porphyrinic الكهروكيميائية NO الاستشعار 13 عدد من الباحثين. وهذه الأساليب هي عادة ليست سهلة في التشغيل، وإجراءات الكشف وتتطلب معدات خاصة. بل هو أيضا الإشارة إلى أن العديد من الدراسات تنطبق التجارب حمام الجهاز مع الأوعية الدموية معزولة مع أو بدون البطانة لتقييم وظيفة بطانة الأوعية الدموية وغير مباشر قياس NO بوساطة الارخاء الأوعية الدموية المستمدة من البطانة. ومع ذلك، هذا الأسلوب، على الرغم من أنها في الغالب بالقرب الوضع الفسيولوجي، ولكن بدقة عن القول، لا قياس أي وظيفة، فإنه بدلا يقيم الردود حركي بوساطة البطانة بشكل عام التي تعكس آثار صافية قدرها وظيفة أنوش، وإنتاج البعض الاسترخاء المستمدة من البطانة العوامل وعوامل التعاقد المستمدة من البطانة، وإنتاج O 2 .-، وأيضا ردود خلايا العضلات الملساءلهذه العوامل. مطلوب تحليل معين من وظيفة أنوش أو أي إنتاج عادة 3.

العديد من المجموعات البحثية بما في بلدنا في السنوات الأخيرة استخدام أسلوب صبغ مضان للكشف عن إنتاج الخلايا من NO 14-19. في هذه الطريقة كانت تستخدم الخلية مؤشر مضان نفاذية diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) لقياس حرة لا وظيفة NOS في الخلايا والأنسجة في المختبر أو خارج الجسم الحي. وأنه في الخلايا الحية، وdeacetylated مبدأ DAF-2DA بواسطة استريز داخل الخلايا لغير الفلورسنت 4،5-diaminofluorescein (DAF-2) الذي تم تحويلها بعد ذلك إلى فلوري DAF-2 التريازول (DAF-2T) عن طريق تفاعل مع NO . مضان من DAF-2T يمكن ملاحظتها تحت المجهر مضان أو مضان المجهر متحد البؤر 14. ولذلك يبين كثافة مضان داخل الخلايا لإنتاج NO الخلايا في الخلايا أو البطانة لفي حالها vesse الدمل. جنبا إلى جنب مع صبغ مضان محددة مثل dihydroethidium (DHE)، ويمكن للمرء أن يقيم في وقت واحد داخل الخلايا NO و O 2 .- جيل في الخلايا أو في الأوعية الدموية 14. وبالمثل، DHE هو أيضا مركب خلية نفاذية أن يتأكسد بواسطة O 2 .- داخل الخلايا، والمنتج الأكسدة ثم intercalates مع الأحماض النووية لتنبعث منها اللون الأحمر الفاتح اكتشاف كميا بواسطة المجهر الفلورسنت أو مضان المجهر متحد البؤر. DHE هو صبغة محددة للغاية للكشف عن O 2 .- من العينات البيولوجية، كما يكشف أساسا هذه الجزيئات، يتم الاحتفاظ بشكل جيد من قبل الخلايا، بل ويمكن أن يتسامح مع تثبيت خفيف 20. واحدة من مزايا هذه الطريقة مضان صبغ هو أنه يكشف ويتصور NO و / أو O 2 .- أون الوجه مباشرة على الطبقة البطانية سليمة من أحد الأوعية الدموية المعيشة.

في هذه الورقة،وصفنا هذه الطريقة مضان صبغ للكشف NO و O 2 .- التي تكيفنا لأون كشف الوجه من NO و O 2 .- في aortas سليمة لنموذج الفأر السمنة الناجمة عن ارتفاع الدهون النظام الغذائي التغذية (HFD). علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب يمكن بنجاح وبشكل موثوق قياس NO و O 2 .- المستويات وتقييم أنوش وظيفة (DYS) في الطبقة البطانية المعزولة حديثا aortas الماوس سليمة في السمنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق العمل الحيوان من قبل اللجنة الأخلاقية للمكتب البيطري فريبورغ، سويسرا. يتبع بروتوكول المبادئ التوجيهية بشأن رعاية الحيوان والتجريب في مؤسستنا.

1. إعداد مجموعة المتابعة لحضانة الشرايين متفرقة

  1. بناء نظام حمام الجهاز الذي يمكن تسخينها إلى 37 درجة مئوية، والغازي مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 من خزان غاز الكربون.
  2. إعداد الكثير من عازلة بيكربونات كريبس الرنين حسب الحاجة مع تركيز على التشكيل التالي: (118 ملي مول كلوريد الصوديوم، 4.7 ملي بوكل، 2.5 ملي CaCl 2، 1.2 ملي MgSO 4، 1.2 مم KH 2 PO 4، 25 مم NaHCO 3، 0،026 ملي EDTA، و 11.1 ملم مد الجلوكوز).
  3. إبقاء المنطقة العازلة الأسهم على الجليد وتهوية المنطقة العازلة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
  4. التبديل على نظام حمام الجهاز، تعيين درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية، وإضافة 5 مل من المخزن المؤقت جاهزة للاستخدام لكل غرفةوالحفاظ على تهوية المنطقة العازلة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
  5. غسل غرف مرة واحدة مع العازلة كريبس الرنين لمدة 30 دقيقة.
  6. إضافة 5 مل العازلة كريبس-قارع الأجراس في كل غرفة، وتغطي الغرفة لتجنب التبخر.

2. عزل Aortas ماوس

  1. حقن بنتوباربيتال الذي يذوب في 0.9٪ كلوريد الصوديوم داخل الصفاق في تركيز 150 ملغم / كغم للتضحية الفئران.
  2. وضع الماوس supinely على لوحة العمليات الجراحية.
  3. رش الفراء من منطقة الصدر مع 70٪ من الإيثانول لأغراض التعقيم والرطوبة.
  4. تجويف الصدر المفتوح عن طريق خفض حول الصدري لفضح القلب والرئتين، وإزالة الرئتين.
  5. إزالة الدم في تجويف الصدر بلطف بمنديل ورق.
  6. فهم قلب بلطف مع ملقط وفصل الشريان الأورطي الصدري عن طريق قطع الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية بين الشريان الأورطي والعمود الفقري مع مقص جراحي.
  7. على الفور تزج مصنعونالأنسجة الإلكترونية في الجليد الباردة (4 ° C) عازلة كريبس الرنين.
  8. إزالة القلب وقوس الأبهر تحت المجهر تشريح والحفاظ على جزء الأبهر الصدري في المخزن المؤقت.
  9. تشريح الشريان الأورطي مجانا من الانضمام الأنسجة المحيطة بالأوعية تحت المجهر مع مقص جراحي وملقط.
  10. فهم على حافة نهاية الشريان الأورطي مع ملقط، وطرد بعيدا عن الدم في تجويف الأوعية الدموية التنظيف بلطف عازلة كريبس-قارع الأجراس مع 26 G × 1 / 2" حقنة.
  11. قطع حلقات الأبهري تنظيفها الى شرائح طويلة 3 مم.
    ملاحظة: انتبه على هذه الخطوة حتى لا تضر طبقة بطانة الأوعية الدموية.

3. DHE وDAF-2DA تلطيخ

  1. نقل شرائح الأورطي تنظيفها مع ملقط لغرف حمام الجهاز مليئة العازلة كريبس الرنين عند 37 درجة مئوية الغازي مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: اللمس فقط الجانب البرانية من حلقات الأبهري مع ملقط ولا المشبك بسفن lood.
  2. تتوازن الشرايين في غرفة حمام الجهاز لمدة 30 دقيقة.
  3. إضافة أستيل كولين (ACH) إلى الحمام الجهاز إلى النهائي تركيز 1 ميكرومتر، واحتضان الشرايين لمدة 10 دقيقة.
  4. إعداد 1 مل من محلول DHE / DAF-2DA (5 ميكرومتر من كل صبغ، مخففة من 1000 × الأسهم) مع العازلة كريبس الرنين قبل تحسنت في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. التفاف أنبوب microcentrifuge مع رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء.
  5. بعد التحفيز، ونقل حلقات الأبهري من حمام الجهاز إلى حل DHE / DAF-2DA في أنبوب microcentrifuge عند 37 درجة مئوية الغازي مع 95٪ O 2 و CO 2 5٪ واحتضان حلقات الأبهري لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة، والحفاظ على aortas دائما في الظلام.
  6. نقل حلقات الأبهري إلى أنبوب microcentrifuge جديد مع العازلة كريبس الرنين لغسيل وتكرار الغسيل ثلاث مرات في غضون 1 دقيقة.
  7. نقل حلقات الأبهري إلى 4٪ حل لامتصاص العرق لتثبيت ل30دقيقة.
  8. إعداد 1 مل 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) حل (300 نانومتر، مخففة من 1000 × الأسهم) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. مباين للaortas لمدة 3 دقائق.
  9. نقل aortas إلى أنبوب microcentrifuge جديد مع العازلة في برنامج تلفزيوني لغسيل لمدة 1 دقيقة. تكرار غسل ثلاث مرات.
    ملاحظة: لا تولي اهتماما لتضييق حلقات الأبهري أو تلف طبقة بطانة.

4. أون الوجه تصاعد

  1. إضافة قطرة من تصاعد المتوسطة إلى الشريحة.
  2. قطع حلقات الأبهري طوليا مع مقص المجهرية تحت المجهر، وجعل aortas تدحرجت متابعة شقة وتركيبها أون الوجه على المتوسطة المتزايدة مع البطانة أسفل على شريحة زجاجية. لا تحرك aortas ذهابا وإيابا.
  3. تغطية الشريحة مع انزلاق الغطاء وختم الشريحة مع طلاء الأظافر.
  4. بعد تجفيف الهواء تحت حماية الخفيفة، استخدم الشرائح لتصوير خيمةctly خلال ساعات أو تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الأيام القليلة المقبلة.

5. متحد البؤر المجهري التصوير

  1. استخدام المجهر متحد البؤر للكشف عن الإشارات مضان. التبديل على الجهاز وتحسين إعدادات التصوير مثل التكبير، سرعة المسح الضوئي، القرار، Z المكدس.
    1. لهذا البروتوكول، واستخدام 200 هرتز سرعة المسح الضوئي، وقرار من 1024 × 1024 بكسل وحجم Z خطوة من 0.25 ميكرون. تثير مضان من DAF-2DA مع 488 نانومتر الأرجون ليزر وكشف في 515 نانومتر، بينما تثير مضان من DHE في 514 نانومتر، وكشف في 605 الانبعاثات نانومتر.
  2. استخدام 10X تكبير للتركيز على عينة حتى إشارة دابي واضحة مع الأشعة فوق البنفسجية، ومن ثم ضبط الهدف 40X تكبير.
  3. تحديد نطاق الطبقة البطانية عن طريق تعديل Z الموقف على لوحة التحكم. إشارات نواة ملطخة دابي هي النقاط بيضاوية أو مستديرة في الطبقة البطانية.
  4. مسح من أعلى(الطبقة البطانية على الحدود التجويف) من العينة من خلال سمك كامل من البطانية إشارة وسجل الصور. اختيار لا يقل عن 3 مجالات مختلفة لفحص كل عينة.

6. تحليل الصور

  1. استخدام برنامج لفتح البيانات الممسوحة ضوئيا بواسطة المجهر متحد البؤر. اختيار ثلاث صور متتالية في المجال لتحليل وتقييم لا يقل عن 3 حقول مختلفة لكل عينة. تصدير الصور المختارة وحفظها كملفات JPEG.
  2. تحديد الصور من DAF-2DA، DHE ودابي تلطيخ مع برامج معالجة الصور. للصورة من تلطيخ دابي، اختر 'الإضافات' → 'تحليل' → "مكافحة خلية" لحساب عدد من دابي نواة إيجابية.
    1. للصور من DAF-2DA وDHE تلطيخ، اختر 'تحليل' → "قياس" لتحليل كثافة الإشارات، وأخذ قيمة 'متوسط' كما كثافة إشارة النسبية. الحالية ثم جاءت النتائج على النحو نسبة DAF-2DA لدابي النوى إيجابية أو نسبة DHE إلى دابي. لكل عينة، واتخاذ متوسط ​​قيمة كل صورة والميدان.
  3. تقسيم النتيجة من كل عينة من متوسط ​​المجموعة الضابطة للحصول على تغيير أضعاف. تم إجراء التحليل الإحصائي مع أونبايريد الطالب اختبار تي أو أنوفا مع Dunnett أو بونفيروني بعد الاختبار. إعطاء البيانات كما يعني ± SEM. النظر في الاختلافات في القيم المتوسطة بالمهم ص <0.05 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

السمنة هي عامل خطر مهم من أمراض القلب والشرايين الدماغية ويترافق مع انخفاض البطانية NO التوافر البيولوجي، وهو السمة المميزة لمرض الأوعية الدموية تصلب الشرايين 21. وقد تبين أنوش-فك ربط ليكون آلية هامة من اختلال وظيفي البطانية تحت العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك كبار السن 22، وتصلب الشرايين، والسمنة 14. لذلك، ونحن هنا مقارنة الفئران الخالية من الدهون والسمنة لتظهر النتيجة تمثيلية من NO و O 2 .- المستويات في aortas.

بدءا من سن 7 أسابيع، أعطيت الفئران الذكور (C57BL / 6J) حرية الوصول خلال 14 أسبوعا إما طعام عادي (NC، محتوى الطاقة: 10.6٪ من الدهون، البروتين 27.6٪، و 57٪ من الكربوهيدرات، الألياف 4.8٪ ) أو اتباع نظام غذائي عالي الدهون (HFD، محتوى الطاقة: 55٪ من الدهون، والبروتين 21٪، و 24٪ من الكربوهيدرات). بعد 14 أسابيع من الفئران HFDضحى وتم تشريح aortas الصدرية، وتنظيفها من الأنسجة الالتزام. قبل DAF-2DA وDHE تلطيخ الخطوة، أنوش المانع LN G -Nitroarginine استر الميثيل (L-NAME) (1 ملم) وأضيف إلى غرفة الحمام لمدة 1 ساعة لمنع النشاط أنوش 14. وقد أظهرت نتائج متحد البؤر مضان ممثل في الشكل 1. اللون الأزرق في لوحة العلوي يمثل نواة الخلايا البطانية ملطخة دابي. في لوحة المتوسطة، واللون الأخضر هو إشارة مضان من DAF-2T تحويلها من DAF-2 غير الفلورسنت التي كتبها NO، وهو ما يعني إذا كانت شدة إشارة خضراء هو أعلى، وهناك أكثر NO في الخلايا. وبالمثل، فإن اللون الأحمر في اللوحة السفلى هو إشارة مضان من DHE المؤكسدة التي كتبها O 2 .-، وبالتالي فإن العينة تظهر اللون الأحمر أكثر ديه المزيد من O 2 .- في الخلايا.

كشفت متحد البؤر المجهري مضان انخفاضد أي إنتاج (DAF-2DA تلطيخ) وزيادة حساسية L-NAME-O 2 .- جيل (DHE تلطيخ) في الطبقة البطانية الأورطي الفئران تغذية HFD بالمقارنة مع تلك الفئران تتغذى NC (الشكل 1) 14، مما يشير إلى أنوش-فك ربط في السمنة. وتم قياس كمية الإشارات وعرضها في الرسوم البيانية 14.

الشكل 1
الشكل 1. أنوش-فك ربط في السمنة. المجهري متحد البؤر أون كشف الوجه من NO و O 2 .- التي DAF-2DA وDHE تلطيخ، على التوالي. ن = 5؛ *** ع <0.005 مقابل NC، ††† ع <0.005 مقابل مجموعة HFD. شريط مقياس = 0.1 مم. (كانت بيانات من مرجع 14) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كشف NO أو O 2 .- مع الأصباغ الفلورية وكثيرا ما تستخدم في العديد من الدراسات في الخلايا البطانية مثقف وأيضا في cryosections الأنسجة 23. نحن هنا تمديد هذه الطريقة إلى الأوعية الدموية المعيشة على حالها، أي أون كشف الوجه من NO و O 2 .- المستويات في الطبقة البطانية مع DAF-2DA وDHE، على التوالي، والتي هي فعالة وبسيطة نسبيا، وحدسي. بالمقارنة مع أسلوب في cryosections الأوعية الدموية، ويظهر هذا الأسلوب أقل الخلفية وأكثر الكمي، لأن الألياف المرنة في وسائل الإعلام من الشريان وخاصة الشريان الأبهر في cryosections تعطي إشارات تألق ذاتي قوية جدا التي يمكن أن تتداخل مع NO أو O 2 محدد. - إشارات ولدت في الخلايا البطانية. وعلاوة على ذلك، يمكن يا معين 2 .- جيل من أوكسيديز NADPH أو إنزيمات أخرى في خلايا العضلات الملساء وسطي أيضا تتداخلمع الإشارات في الخلايا البطانية في قسم الأوعية الدموية، والتي تمثل عيوب الأسلوب مع cryosections الأوعية الدموية. في المقابل، فإن أون الوجه طريقة تلوين بالكشف عن إشارات على وجه التحديد من الطبقة البطانية من شريحة الأوعية الدموية سليمة، وبالتالي يعطي تحليل أكثر دقة. آلة ناظم البرد لإعداد cryosection هي أيضا استثمارا مكلفا. مقارنة مع الطرق الكيميائية الحيوية الأخرى، والقيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو أقل الكمي، وإنما هو خيار جيد للمقارنة نسبية بين العينات. وعلاوة على ذلك، قد يكون شرط المجهر متحد البؤر وهو أمر مكلف أيضا وجود قيود على هذا الأسلوب. نظام غرفة متعددة الجهاز مريحة وإذا كان هذا لا يتوفر في المختبر، ويمكن للمرء أن إنشاء بسهولة نظام مع حمام الماء وأنابيب والتي ترتبط إلى خزان غاز الكربون مع نظام تنظيمي، بحيث الأوعية الدموية في الأنابيب هي أبقى عند 37 درجة مئوية وتهوية مع 95٪ O 2 و 5٪ CO

هناك العديد من الخطوات الهامة التي يتعين على المرء أن تولي اهتماما. تأكد من أن الأنسجة المحيطة بالأوعية يتم تنظيف لسهولة التركيب. يجب مسح جلطات الدم في لمعة الأوعية الدموية بعيدا، لأنها قد تسبب إشارات مصطنعة وتتداخل مع إشارات مضان. خلال الإجراء بأكمله من إعداد الأوعية الدموية، الحضانة، والغسيل، والقطع والتركيب، على المرء أن يكون حذرا للغاية لا تضر بطبقة البطانية للأوعية الدموية. لا تدع الجافة الأوعية الدموية أثناء إجراء كاملة من التحضير. DHE وDAF-2DA كلاهما تحقيقات الفلورسنت، وذلك بدءا من الخطوة تلطيخ aortas يجب أن تكون محمية دائما من التعرض للضوء. قبل تثبيت خطوة الخلايا البطانية من aortas يجب أن يكون على قيد الحياة، وبالتالي فإن aortas يجب أن تبقى دائما في المنطقة العازلة كريبس الرنين الغازي مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. ينبغي أن تؤخذ الصور من العينات في أقرب وقت ممكن بعد الإعداد. ويتألقسوف إشارة الامتحانات التنافسية الوطنية أصبحت أضعف في غضون أيام قليلة حتى مع حماية المتوسطة المتزايدة، والتي قد تؤثر على دقة النتائج. قد لا تنطبق طريقة لالأوعية الدموية مع جدار الأوعية الدموية سميكة جدا.

هذه الطريقة تمكن الخيال في وقت واحد لا وO 2 .- الإنتاج في طبقة بطانة الأوعية الدموية سليمة، وإذا تم إضافة الأصباغ اثنين في الأوعية الدموية معا. يمكن للمرء أيضا استخدام هذا الأسلوب لتقييم التأثيرات الدوائية للأدوية على NO و O 2 .- الإنتاج في المختبر في الأوعية الدموية معزولة. لهذا الغرض، وعادة ما يتم قطع الشريان الأورطي تنظيفها إلى قسمين، واحد هو لمراقبة وأخرى للعلاج من المخدرات، وينبغي أن يضاف المخدرات إلى المخزن المؤقت الحضانة بعد موازنة قبل DAF-2DA وDHE تلطيخ خطوة. انها مفيدة بشكل خاص، إذا تم استخدام هذه الطريقة مع طريقة أخرى، على سبيل المثال، مع تحليل الردود حركي معزولة الدم الخامسessels، ويمكن التأكد من وظيفة فسيولوجية الخلايا البطانية. يجب أن تكون هذه الطريقة مناسبة أيضا لتحليل أي (DYS) وظيفة بطانة الأوعية الدموية في الأوعية الدموية سليمة من نماذج المرض والآليات الكامنة.

وباختصار، قدمنا ​​بروتوكول بسيط للكشف في وقت واحد لا وO 2 .- الإنتاج في طبقة بطانة الأوعية الدموية سليمة مع مضان المجهر متحد البؤر. وتبين لنا كيف نجاح هذه الطريقة بنجاح في نموذج الفأر السمنة. هذا الأسلوب هو تقنية مفيدة في التحقيق في البطانية NO و O 2 .- الإنتاج في ظل العديد من الحالات المرضية الوعائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
  2. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  3. Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
  4. Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
  5. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
  6. Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
  7. Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
  8. Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
  9. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
  10. Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
  11. Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
  12. Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
  13. Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
  14. Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
  15. Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
  16. Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
  17. Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
  18. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
  19. Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
  20. Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
  21. Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
  22. Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
  23. Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 108، الشرايين، متحد البؤر المجهري، DHE، DAF، 2DA، البطانة Endothelium، اكسيد النيتريك، فوق الأكسيد أنيون، علم الأحياء الأوعية الدموية
<em>أون</em> كشف <em>الوجه</em> من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P.,… More

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter