Summary
이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.
Abstract
내피 NO-합성 효소 (eNOS의)에서 생산 내피 세포에서 파생 된 질소 산화물 (NO) 심장 혈관 생리학에서 가장 중요한 vasoprotective 분자의 하나입니다. eNOS의의 언 커플 링이 슈퍼 옥사이드 음이온에서 NO 생체 이용률 및 증가 감소 리드로 장애 eNOS의 예 (O 2 .-) 생산, 차례로 심혈관 질환을 촉진한다. 따라서, 내피 세포에서 NO와 O 2 .- 수준의 적절한 측정이 심혈관 질환과 합병증에 대한 연구를위한 중요한 있습니다. 때문에 NO와 O 2 .-의 매우 불안정한 특성 때문에 NO 측정하고, O 2 .- 직접 혈관에 어렵다. 수많은 방법은 NO 측정 및 O 2 .- 생산하기 위해 개발되었습니다. 이것은, 그러나, 어느 둔감 또는 비특이적 또는 기술적으로 요구하고, 특수 장비를 필요로한다. 여기에 우리가 적응을 설명얼굴의 동시 검출 및 세포 NO와 O 2의 시각화 도중에 .- 유도 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥에 각각 세포 투과성 diaminofluorescein -2- 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하는 형광 염료 방법 높은 지방 다이어트 먹이로. 제어 린 마우스에 비해 우리는 비만 마우스의 갓 고립 그대로 대동맥 2 .- 수준을 세포 내 NO 감소 O를 향상 것을 보여줍니다 수 있습니다. 우리는이 방법은 직접 검출 및 시각화 NO와 O 2를위한 쉬운 기술 .- 그대로 혈관에 널리 (물리 치료사) 병리학 적 조건에서 내피 (DYS) 함수의 조사를 위해 적용 할 수 있다는 것을 보여줍니다.
Introduction
혈관 내피 세포는 혈관 활성 인자 1을 해제하여 혈관 기능 및 구조적 무결성을 유지합니다. 이러한 요인 중 내피 NO 신타 제 (eNOS의)를 통해 L 아르기닌으로부터 생성 내피 - 유도 질소 산화물 (NO)이 심혈관 생리학에서 가장 중요하고 가장 특징 요소이다. NO 따라서 혈관 질환 개발 3 보호에 피하 공간으로 혈소판 응집 및 염증 세포의 부착 및 침윤을 억제 평활근 이완을 유발하고 세포 증식을 억제한다. 등 노화, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 등 많은 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 특징 내피 기능 장애는 NO 생체 이용률을 감소하지 않고 O 2 .- 생산이 존재하고 동맥 경화증 2의 발병을 촉진 증가했다. 최근의 연구에서 eNOS의 언 커플 링이를이 있음을 입증다양한 상기 조건 1,4에서 eNOS의 효소는 O 2를 생성하는 내피 기능 장애, .- 대신 NO의 중요한 메커니즘. 따라서, 혈관 내피 기능의 분석, 특히 NO 생산 내피없고 O 2 .- 생성 심혈관 질병 및 합병증에 대한 실험적 연구에 중요한 것이다.
분석 및 생물학적 샘플에서 NO 생성을 측정하지하기 위해 개발 된 다양한 방법 론적 접근 방법이있다. 및 NO 3 - - 때문에 쉽게 NO 2로 산화되어 NO의 매우 불안정한 특성으로 3 초 6의 반감기, 어떠한 직접 측정하지 어렵다. / NO 3 - - NO 2 판정 따라서 유체 시료는 세포 나 조직을 5 NO 방출의 지표로서 사용 하였다. 절차가 비교적 용이하지만, 상기 방법은, 그러나, EA/ NO 3 - - 솔루션에 포함 된 sily 안정 NO 2의 높은 배경에 의해 영향을. NO가 클릭 구아노 신 모노 포스페이트 (cGMP) 6을 생산하는 가용성 구 아닐 레이트 사이 클라 제를 자극하기 때문에, 세포의 cGMP 수준은 NO 릴리스 7 견적 않음 결정되었다. 다시이 간접적 인 추정 및 C 형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP) 일부 내피 세포 유래 인자는 입자상 아닐 레이트 시클 라제의 활성화를 통해 8의 cGMP 수준을 향상 할 수 있기 때문에, 특정하지 않을 수있다. NO 부산물 (9), L - 시트룰린 생산의 측정 따라서도 NO 생성을 추정하지하는 간접적 인 방법으로 사용되는로 L - 시트룰린의 생성과 L 아르기닌에서 생산되지 않습니다. 이 방법의 주요 단점은 방사성 그것은 생체 활성 NO 수준을 측정하지 않도록하고, O 2 NO 빠르게 불 활성화 될 수있는 해제 이후 .-; 또한, L - 시트룰린은 L- 재활용 할 수있다10 아르기닌. 이러한 화학 발광 검출 (11), 전자 스핀 공명 (12), 또는 전기 포르피린 NO 센서 (13)를 같은 다른 화학적 방법은 여러 연구자에 의해 사용됩니다. 이 방법은 일반적으로 검출 절차 운영에 쉽지 않다 및 특수 장비가 필요합니다. 그것은 많은 연구 또는 내피 기능을 평가하고 간접적으로 내피 세포 유래 NO 매개 혈관 이완을 측정 할 수있는 내피없이 격리 된 혈관과 장기 목욕 실험을 적용 할 것을 언급 할 수도있다. 그것은 주로 생리 학적 상황에 가까운, 그러나 있지만 그러나이 방법은, 엄격하게 말을, 어떠한 기능을 측정하지 않습니다, 오히려의 생산 eNOS의 기능의 순 효과를 반영 일반적으로 내피 세포 매개 성 혈관 운동 반응을 평가 다른 내피 세포 유래 휴식 계수 및 내피 - 유도 수축 인자 O 2 .-의 생산 및 평활근 세포의 응답도이러한 요인이다. eNOS의 기능 또는 NO 생산의 구체적인 분석은 일반적으로 3 필요합니다.
우리 포함한 많은 연구 그룹은 NO 14-19 세포의 생산을 검출하는 형광 염색 방법을 사용 최근있다. 이 방법에서, 세포 투과 형광 표시 diaminofluorescein -2- 아세테이트 (DAF-2DA)은 시험 관내 또는 생체의 조직과 세포를 살아있는 무료 NO 및 NOS 함수를 측정 하였다. 원리는 살아있는 세포에서 DAF-2DA는 비 형광 4,5-diaminofluorescein에 세포 내 에스 테라 제에 의해 탈 아세틸되는 것을 다음 NO와 반응하여 DAF-2 트리아 졸 (DAF-2T)를 형광등으로 전환되었다 (DAF-2) . DAF-2T에서 형광을 형광 현미경 또는 형광 공 초점 현미경 (14)으로 관찰 할 수있다. 세포 내 형광 강도 따라서 세포에서 세포 내 NO의 생산 그대로 혈액 vesse에서의 내피 세포를 반영엘. 이러한 dihydroethidium (DHE)와 같은 특정 형광 염료와 조합 한 동시에 세포 또는 혈관 (14)에 세포 NO와 O 2 .- 발생을 평가할 수있다. 마찬가지로 DHE는 세포 투과성 O 2에 의해 산화되는 화합물 .- 균체 내에하고 핵산과하게 인터 형광 현미경, 형광 공 촛점 현미경으로 정량적 검출 밝은 적색을 방출하는 산화 생성물도이다. 그것은 본질적으로 슈퍼 옥사이드 라디칼 감지 세포에 의해 잘 유지되고, 심지어 가벼운 고정 (20)를 허용 할 수 있으므로 DHE는 O 2 .- 생물학적 시료에서의 검출을위한 매우 구체적인 염료이다. 이 형광 염색 방법의 장점 중 하나는 검출에 직접 생체 혈관 내피 손상 층 en 얼굴 NO 및 / 또는 O 2 .- 가시화한다는 것이다.
본 논문에서는,우리는이 형광 염료 NO를 감지하는 방법 및 O 2 .- 우리가 얼굴 NO의 검출 및 O 2 욕실 개조 한 설명 .- 높은 지방 다이어트 (HFD) 공급에 의해 유도 된 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥에서. 우리는이 방법이 성공적으로 안정적 NO와 O 2 .- 수준을 측정하고 비만에서 갓 고립 그대로 마우스 대동맥의 내피 층에서 eNOS의 (DYS) 기능을 평가할 수 있다는 것을 보여줍니다.
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Protocol
동물 작품은 프리 부르, 스위스의 수의학 사무실의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 우리 기관에서 동물 관리 및 실험에 대한 가이드 라인을 따른다.
격리 된 동맥의 배양을위한 셋업 1. 준비
- 37 ° C로 가열하고, 탄소 가스 탱크 95 % O 2, 5 % CO 2 통기 될 수 기관 욕 시스템을 구축.
- 다음 조성물의 농도가 필요한만큼 크렙스 - 링거 중탄산 버퍼 준비 (118 mM의 염화나트륨, 4.7 mM의 KCl을 2.5 mM의 CaCl2를 1.2 mM의 황산, 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 25 mM의 NaHCO3을, 0.026 mM의 EDTA, 11.1 mM의 글루코오스 D).
- 얼음에 주식 버퍼를 유지하고 95 % O 2 5 % CO 2와 버퍼를 공기에 쐬다.
- 오르간 조 시스템 스위치는 37 ° C의 온도를 설정 한 각 실에 즉시 사용 완충액 5 mL를 추가95 %의 O 2 5 % CO 2와 버퍼를 폭기 유지.
- 30 분 동안 크렙스 - 링거 버퍼에 한 번 실을 씻으십시오.
- 각 실에 5 ml의 크렙스 - 링거 버퍼를 추가하고 증발을 방지하기 위해 챔버 커버.
마우스 대동맥 2. 분리
- 마우스를 희생 150 밀리그램 / kg의 농도로 복강 0.9 % 염화나트륨에 용해 펜토 바르 비탈을 주사.
- 수술 보드 드러 마우스를 놓습니다.
- 위생 및 습기의 목적 70 % 에탄올로 가슴 영역 모피 스프레이.
- 리브 주위에 절단 엽니 다 흉강은 심장과 폐를 노출하고, 폐를 제거합니다.
- 종이 티슈로 부드럽게 흉강에 혈액을 제거합니다.
- 집게로 조심스럽게 마음을 잡고 수술 가위로 대동맥과 척추 사이의 혈관 주위 지방 조직을 절단하여 흉부 대동맥을 분리합니다.
- 즉시도 ë 몰입얼음 감기 (4 °에 C) 크렙스 - 링거 버퍼 전자 조직.
- 해부 현미경으로 심장과 대동맥 궁을 제거하고 버퍼에 흉부 대동맥 세그먼트를 유지합니다.
- 수술 가위와 집게와 현미경으로 혈관 주위 조직을 준수없는 대동맥을 해부하다.
- 집게와 대동맥의 끝 가장자리를 잡고 조심스럽게 26 G × 1 / 2" 주사기 크렙스 - 링거 버퍼를 세척하여 혈관 내강의 혈액을 멀리 세척합니다.
- 3mm 길이 세그먼트로 청소 대동맥 고리를 잘라.
참고 : 내피 층을 손상하지 않도록이 단계에서주의를 기울이십시오.
3. DHE와 DAF-2DA 염색
- 37 ° C에서 크렙스 - 링거 버퍼 가득 기관 목욕 챔버에 집게로 청소 대동맥 세그먼트를 이동시켜 95 % O 2, 5 % CO 2 폭기.
집게로 대동맥 반지의 터치 만 외막 측과 B를 고정하지 않습니다 참고들 (100d) 선박. - 30 분 기관 욕 실 동맥 평형.
- 최종 농도 1 μM의 장기 욕조에 아세틸 콜린 (ACH)를 추가하고 10 분 동안 동맥을 품어.
- 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 미리 예열 크렙스 - 링거 버퍼 (1,000 × 재고에서 희석 된 각 염료의 5 μM) DHE / DAF-2DA 용액 1 ㎖를 준비합니다. 빛의 노출을 피하기 위해 알루미늄 호일로 microcentrifuge 관을 감싸.
- 자극 후, 37 ° C에서 마이크로 원심 튜브 DHE / DAF-2DA 용액 오르간 조로부터 대동맥 고리를 전송할 95 % O 2, 5 % CO 2 통기하고, 30 분간의 대동맥 고리를 배양한다.
참고 :이 단계에서, 어둠 속에서 항상 대동맥을 유지합니다. - 세척 크렙스 - 링거 버퍼와 새로운 microcentrifuge 관에 대동맥 고리를 전송하고 1 분 이내에 세탁을 세 번 반복한다.
- 30 고정 용 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 대동맥 링을 이동시켜분.
- 준비 1 ml의 4 ', 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 버퍼 (1,000 × 재고에서 희석 300 nm의) 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 솔루션입니다. 3 분 동안 대동맥을 Counterstain과.
- 1 분 동안 세척 PBS 버퍼 새로운 microcentrifuge 관에 대동맥을 전송합니다. 세탁 세 번 반복합니다.
주 : 대동맥 고리를 고정 또는 내피 층이 손상되지 않도록주의를 기울이십시오.
설치 4. 욕실 얼굴
- 슬라이드에 매체를 장착 한 방울을 추가합니다.
- 겹쳐서 대동맥이 평평하고 유리 슬라이드 아래로 향하게 내피 세포와 설치 매체에 얼굴 엉 마운트, 현미경 미세 수술 가위로 길이 방향으로 대동맥 고리를 잘라. 앞뒤로 대동맥를 이동하지 마십시오.
- 커버 슬립과 슬라이드를 덮고 매니큐어와 슬라이드를 밀봉.
- 빛 보호 아래 공기 건조 후, 무서운 이미징에 대한 슬라이드를 사용ctly 또는 시간 이내에 다음 몇 일 동안 -20 ° C에 저장합니다.
5. 공 초점 현미경 이미징
- 형광 신호를 검출하는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용한다. 시스템에서 스위치 및 확대, 스캔 속도, 해상도, Z-스택으로 이미지 설정을 최적화 할 수 있습니다.
- 이 프로토콜의 경우, 024 × 024 픽셀의 200 Hz의 스캔 속도, 해상도 및 0.25 ㎛ 인 Z-스텝 크기를 사용한다. 반면 514 nm에서 DHE에서 형광을 흥분과 605 nm의 방출에 감지, 488 nm의 아르곤 레이저로 DAF-2DA에서 형광을 자극하고 515 nm에서 검출한다.
- DAPI 신호가 자외선 선명해질 때까지 샘플에 초점을 10 배 배율을 사용하고 40X 배율로 목표를 조정합니다.
- 조작부 Z 위치를 조정함으로써 내피 층의 범위를 정의한다. DAPI 염색 핵의 신호 내피 층 타원형 또는 둥근 점이다.
- 상단에서 스캔내피 세포 신호 및 기록 이미지의 전체 두께를 통해 샘플의 (루멘 국경에 내피 층). 각각의 샘플을 스캔 적어도 3 개의 필드를 선택합니다.
이미지 6. 분석
- 공 초점 현미경으로 스캔 데이터를 엽니 소프트웨어를 사용합니다. 분석을 위해 필드 당 세 개의 연속 이미지를 선택하고 샘플 당 적어도 3 가지 분야를 평가한다. 선택한 이미지를 내보내고 JPEG 파일로 저장합니다.
- 이미지 처리 소프트웨어로 염색 DAF-2DA, DHE 및 DAPI에서 이미지를 정량화. DAPI 염색의 이미지를 들어, '플러그인'을 선택 → DAPI 긍정적 인 핵의 수를 계산 → '셀 카운터를'분석 '.
- DAF-2DA 및 DHE 염색에서 이미지의 경우, 신호의 강도를 분석 → '측정'을 '분석'을 선택하고, 상대적 신호 강도로 '평균'값을. DAF-2DA의 비율로 존재 그 결과DAPI 긍정적 인 핵 또는 DAPI에 DHE의 비율. 각 샘플에 대해, 각 필드 화상의 평균값을 취.
- 배 변화를 얻을 대조군의 평균으로 모든 샘플의 결과를 나눈다. 통계 분석은 던넷 또는 페로 니 사후 테스트와 짝이 학생 t 테스트 또는 ANOVA를 수행 하였다. SEM ± 평균과 같은 데이터를 제공합니다. P <0.05 14에서 상당한으로 평균값의 차이를 고려한다.
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Representative Results
비만은 허혈성 심장 질환의 주요 위험 인자와 관련된 어떠한 생물학적, 동맥 경화성 혈관 질환 (21)의 특징 내피되지 감소된다. -eNOS의 언 커플 링 (22), 죽상 동맥 경화증, 비만 14 노화 등 다양한 생리 학적 및 병리학 적 상태에서 혈관 내피 기능 부전의 중요한 메커니즘으로 도시되었다. 따라서, 우리가 대표 NO의 결과와 O 2 .- 대동맥의 수준을 보여 마른 비만 쥐를 비교합니다.
10.6 %, 지방 27.6 %의 단백질, 57 %의 탄수화물, 섬유 4.8 % 에너지 함량 7 주 세의 나이에 시작, 수컷 생쥐 (C57BL / 6J)는 중 정상 우 (NC 14 주 동안 무료로 액세스 권한을 부여했다 ) 또는 고지방식이 (HFD 에너지 함량 : 55 %, 지방 21 % 단백질 및 24 % 탄수화물). HFD 마우스 14 주했다 후희생과 흉부 대동맥 해부 및 준수 조직의 청소했다. DAF-2DA 및 DHE 단계를 염색하기 전에, eNOS의는 LN G -Nitroarginine 메틸 에스테르 (L-NAME) (1 ㎜)이 eNOS의 활동 (14)을 차단하는 1 시간 동안 목욕 챔버에 추가 억제제. 대표 공 초점 형광 결과를 그림 1에 나타내었다. 상단 패널에 푸른 색은 DAPI으로 얼룩진 내피 세포의 핵을 나타냅니다. 중간 패널에서 녹색이 아닌 형광 DAF-2 NO함으로써, 녹색 신호의 강도가 크면 수단으로부터 변환 DAF-2T의 형광 신호이고, 세포에 더 이상 존재한다. 마찬가지로, 상기 하부 패널의 붉은 색 O 2 .- 의해 산화 DHE에서 형광 신호이므로, 더 붉은 색을 나타내는 샘플은 더 O 2 .- 셀을 갖는다.
공 초점 형광 현미경은 감소 밝혀D 쥐의 대동맥 내피 층에서 NO 생성 (DAF-2DA 염색) 증가 L-NAME에 민감한 O 2 .- 세대 (DHE 염색), 쥐의 그 NC (그림 1) 14 공급에 비해 HFD을 공급하지 이노스 - 언 커플 링 제안 비만. 신호는 정량 및 막대 그래프 (14)에 발표되었다.
그림 비만 1. eNOS의-언 커플 링. 얼굴 NO의 검출 및 O 2 엔 공 초점 현미경 .- 각각 DAF-2DA 및 DHE 염색에 의해. N = 5; *** p <NC 대 0.005, ††† p <HFD 그룹 대 0.005. 스케일 바 = 0.1 mm. (데이터 참조 14이었다) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
NO 또는 O (2)의 검출 .- 형광 염료 자주 조직 저온부 (23)에 또한 배양 된 내피 세포에서 많은 연구에 사용 하였다. 여기에서 우리는 얼굴 NO의 검출 및 O 2 .-, 비교적 간단하고 직관적 인 효과가 각각 DAF-2DA 및 DHE,와 내피 층의 수준 도중, 즉 그대로 살아있는 혈관에이 방법을 확장했다. 동맥 미디어 탄성 섬유, 특히 저온부에서 대동맥 특정 NO 또는 O이 방해 할 수있는 매우 강한 형광도 신호를주고 이후 혈관 저온부의 방법에 비해,이 방법은 낮은 배경 프로그램 등 정량적이다. - 내피 세포에서 생성 된 신호. 또한, 내측 평활근 세포의 NADPH 산화 효소 또는 다른 효소에 의해 특이 O 2 .- 생성은 방해 할혈관 저온부와 방법의 문제점을 나타내는 부분의 혈관에서 혈관 내피 세포에서의 신호들. 반면, 실내면의 염색 방법은 그대로 혈관 세그먼트의 내피 층으로부터 특이 신호를 검출하고, 따라서, 더 정확한 분석을 제공한다. 동결 절단 (Cryosections) 준비를위한 저온 유지 장치 기계는 비싼 투자입니다. 다른 생화학 적 방법에 비해,이 방법의 주요 한계 이하 정량적이지만, 샘플 사이의 상대적인 비교를위한 좋은 선택이다. 또한, 비싼 공 초점 레이저 주사 현미경의 요구도이 방법의 한계 일 수있다. 다기관 챔버 시스템 편리 이것은 실험실에서 사용할 수없는 경우 튜브 혈관이되도록 한 쉽게 수욕 규제 시스템 탄소 가스 탱크에 연결되어있는 튜브 시스템을 구축 할 37 ° C로 유지하고 95 % O 2, 5 % CO 통기 한주의를 지불해야 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 혈관 주위 조직이 쉽게 장착을 위해 청소되어 있는지 확인합니다. 그들은 인공 신호가 발생하여 형광 신호를 방해 할 수 있기 때문에 혈관 내강에 혈전이 떨어져 플러시해야합니다. 혈관 제제, 배양, 세척, 절단 및 장착하는 전체 공정 중에 하나는 혈관 내피 층이 손상되지 않도록 매우주의해야한다. 준비의 모든 절차를 수행하는 동안 혈관 건조하게하지 마십시오. DHE와 DAF-2DA 그래서 대동맥 항상 빛 노출로부터 보호되어야한다 염색 단계에서 시작, 모두 형광 프로브입니다. 고정하기 전에 대동맥의 혈관 내피 세포가 살아 있어야 단계, 그래서 대동맥은 항상 95 % O 2 5 % CO 2와 탄산 크렙스 - 링거 버퍼에 보관해야합니다. 샘플 이미지는 준비 후 가능한 한 빨리주의해야한다. 형광후부 신호도 결과의 정확성에 영향을 미칠 수있는 설치 매체의 보호와 며칠에 약한 될 것입니다. 이 방법은 너무 두꺼운 혈관 벽 혈관에 대한 적용되지 않을 수도 있습니다. 두 염료가 함께 혈관에 첨가하는 경우에있어서, 손상 혈관의 내피 층 동시 NO의 상상력과 O 2 .- 제조 할 수있다. 하나는 격리 된 혈관 체외에서 NO와 O 2 .- 생산에 약물의 약리 효과를 평가하기 위해이 방법을 사용할 수 있습니다. 이를 위해, 세정 대동맥 보통 한 제어하고 다른 약물 치료, 그리고 DAF-2DA 및 DHE 단계 염색 전에 약물이 평형 후 배양 버퍼에 추가되어야 두 부분으로 절단된다. 이 방법은 고립 된 혈액 V의 혈관 운동 응답의 분석, 예를 들어, 다른 방법과 함께 사용하는 경우는, 특히 유용하다essels 내피 세포의 생리 기능을 확인할 수있다. 이 방법은 질병 모델 혈관 손상 및 기전에있는 내피 (DYS) 함수의 분석에도 적합해야한다. 요약하면, 우리는 동시에 형광 공 촛점 현미경으로 그대로 혈관 내피 층에 NO와 O 2 .- 생산을 검출하는 간단한 프로토콜을 제시 하였다. 우리는이 방법이 성공적으로 비만 마우스 모델에서 근무 방법을 보여줍니다. 이 방법은 많은 혈관 질환 조건하에 내피 NO의 조사와 O 2 .- 생산에 유용한 기술이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) | Sigma-aldrich | N5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health (NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| Coverslip round diameter 15 mm | VWR | 631-1579 | |
| Tips 1 ml | VWR | RFL-1200c | |
| Tips 200 μl | VWR | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
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