Summary
במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.
Abstract
תחמוצת חנקן שמקורם האנדותל (NO) המופקת-synthase NO האנדותל (eNOS) היא אחת מולקולות vasoprotective החשובות ביותר בפיזיולוגיה קרדיווסקולרית. מתפקדת eNOS כגון שיחררה של eNOS גורמת להפחתת בשום הזמינות הביולוגית ואת הגידול אניון סופראוקסיד (O 2 .-) ייצור, ו בתורו מקדם מחלות לב וכלי דם. לכן, המידה המתאימה של NO ו- O 2 .- רמות לתאי אנדותל, הם מרכזיים למחקר על מחלות לב וכלי דם וסיבוכים. בשל אופיו היציב מאוד של NO ו- O 2 .-, קשה למדוד NO ו- O 2 .- ישירות בתוך כלי דם. שיטות רבות פותחו כדי למדוד NO ו- O 2 .- הייצור. היא, לעומת זאת, גם רגישה, או שאינה ספציפית, או תובענית מבחינה טכנית ודורשת ציוד מיוחד. כאן אנו מתארים לאימוצושיטת צבע קרינה עבור en איתור להדמיה סימולטני מול NO התאי ו- O 2 .- באמצעות diacetate החדיר diaminofluorescein-2 התאים (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE), בהתאמה, ב aortas השלם של מודל עכבר שמן נגרם על ידי האכלה עתירה שומן דיאטה. נוכל להוכיח ירד NO התאי ומשופרי O 2 .- רמות aortas השלם המבודד הטרי של עכבר שמן לעומת העכבר המלא הרזה. אנו מדגימים כי שיטה זו היא טכניקה קלה לגילוי ישיר ויזואליזציה של NO ו- O 2 .- בכלי הדם השלמים יכולה להיות מיושמת באופן נרחב לחקירה של האנדותל (פרע) פונקציה תחת (פיזיו) במצבים פתולוגיים.
Introduction
לתאי אנדותל כלי הדם לשמור על שלמות מבנית תפקודית וכלי דם על ידי שחרור גורמי vasoactive 1. בין גורמים אלה, תחמוצת החנקן שמקורם האנדותל (NO) המופק L-arginine באמצעות האנדותל NO-synthase (eNOS) הוא החשוב ביותר, איפיינו גורם בפיזיולוגיה קרדיווסקולרית 2. NO גורם להרפיית שרירים חלקים מעכב את שגשוג התאים, מעכב אגרגציה של טסיות הידבקות התא דלקתיות וחדירה לחלל subendothelial, ולכן הגנה מפני התפתחות מחלת כלי דם 3. תחת תנאים רבים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כולל הזדקנות, יתר לחץ דם, סוכרת, היפרליפידמיה, וכו ', בתפקוד האנדותל מאופיין ירד NO הזמינות הביולוגית והגדילה O 2 הייצור .- קיים ומקדם טרשת העורקים 2. מחקרים מהשנים האחרונות מראים כי שחרר של eNOS הואמנגנון חשוב עבור תפקוד אנדותל, שבו אנזים eNOS מייצר O 2 .- במקום NO, בתנאים האמורים השונים 1,4. לכן, ניתוח של תפקוד האנדותל, בפרט, אנדותל NO ייצור O 2 .- הדור הוא מכריע למחקר ניסיוני על מחלות לב וכלי דם וסיבוכים.
ישנן גישות מתודולוגיות רבות פותחו כדי לנתח ולמדוד ייצור NO ב דגימות ביולוגיות. בשל אופיו של NO יציב מאוד אשר מתחמצן בקלות ל NO 2 - ו NO 3 - עם זמן מחצית חיים של 3 עד 6 שניות, קשה למדוד NO ישירות. לכן קביעת מס '2 - / NO 3 - בדגימות נוזל שימש כמדד NO להשתחרר תאים או רקמות 5. למרות ההליך הוא קל יחסית, השיטה היא, לעומת זאת, easily מושפע רקע גבוה של NO היציבה 2 - / NO 3 - כלול הפתרון. כי אף מגרת cyclase guanylate המסיסה לייצר monophosphate guanosine המחזורי (cGMP) 6, רמת cGMP הסלולר כן נקבעה להעריך NO שחרור 7. שוב, זה הינו הערכה עקיפה ולא יכול להיות ספציפי, מאז כמה גורמים הנגזרות האנדותל כגון פפטיד natriuretic C-type (CNP) יכול גם לשפר את רמות cGMP באמצעות הפעלת guanylate חלקיקי cyclase 8. NO מופק L-arginine עם דור של L-Citrulline כתוצר לוואי 9, מדידת ייצור L-Citrulline ולכן גם משמש כשיטה עקיפה להעריך NO ייצור. החסרונות העיקריים של שיטה זו הם כי הוא רדיואקטיבי והוא אינו מודד רמות NO ביו, מאז שוחרר NO יכול להיות מומת במהירות על ידי O 2 .-; יתר על כן, L-Citrulline ניתן למחזר כדי L-ארגינין 10. שיטות כימיות אחרות כגון זיהוי chemiluminescence 11, תהודת ספין אלקטרון 12, או porphyrinic אלקטרוכימיים NO חיישן 13 נמצאות בשימוש על ידי מספר חוקרים. שיטות אלה הן בדרך כלל לא קלות בהכנסות תפעוליות, נהלים לזיהוי דורשים ציוד מיוחד. זה גם להזכיר כי מחקרים רבים החל ניסויי אמבטית איבר עם כלי דם מבודדים עם או בלי האנדותל להעריך את תפקוד האנדותל ובעקיפין למדוד הקלות וסקולרית בתיווך NO נגזרות האנדותל. עם זאת, שיטה זו, אם כי בעיקר קרוב מצב פיסיולוגי, אבל בהחלט לומר, אינו מודד פונקציה ולא, זה דווקא מעריך תגובות וזומוטורים בתיווך האנדותל בכלל המשקפים תופעות נטו של פונקצית אינס, ייצור של אחרים נגזרות האנדותל הרגיע גורמים וגורם קבלנות נגזרות האנדותל, ייצור של O 2 .-, וגם התגובות של תאי שריר חלקלגורמים אלו. ניתוח ספציפי של פונקצית eNOS או NO ייצור נדרש בדרך כלל 3.
קבוצות מחקר רבות כולל שלנו יש בשנים האחרונות השתמשו בשיטה לצבוע קרינה לזהות ייצור תאי של NO 14-19. בשיטה זו מחוון הקרינה חדיר תא diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) שימש כדי למדוד את תפקוד NO ו NOS חינם בתאים חיים ורקמות במבחנה או vivo לשעבר. העיקרון הוא כי התאים החיים, DAF-2da הוא deacetylated ידי אסטראז תאיים ללא ניאון 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) אשר היה ויומרו פלורסנט triazole DAF-2 (DAF-2T) על ידי מגיבים עם NO . הקרינה מן DAF-2T ניתן להבחין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ confocal הקרינה 14. עוצמת הקרינה התאית ולכן משקפת את ייצור NO תאי בתאים או האנדותל של ב vesse דם ללא פגעl. בשילוב עם צבע פלואורסצנטי ספציפי כגון dihydroethidium (DHE), אפשר בו זמנית להעריך NO התאי ו- O 2 .- דור בתאים או בכלי דם 14. באופן דומה, DHE גם מתחם תא חדיר כי הוא מתחמצן על ידי O 2 .- בתוך התאים, ומוצר החמצונים אז intercalates עם חומצות גרעין לפלוט צבע אדום בוהק לגילוי כמותית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal קרינה. DHE הוא צבע מאוד ספציפי לגילוי של O 2 .- מ דגימות ביולוגיות, כפי שהוא מזהה בעצם רדיקלים דיסמוטאז, נשמר היטב על ידי תאים, ואף עלול לסבול קיבעון מתון 20. אחד היתרונות של שיטת צבע הקרינה הזו היא שהיא מזהה מדמיין NO ו / או O 2 .- אן-פאס ישירות על שכבת האנדותל השלמה של כלי דם חיים.
במסמך הזה,אנו מתארים שיטה לצבוע קרינה זו כדי לזהות NO ו- O 2 .- אשר התאמנו עבור en זיהוי פן של NO ו- O 2 .- ב aortas השלם של מודל עכבר שמן הנגרמת על ידי דיאטה עשירה בשומן האכלה (HFD). אנו מראים כי שיטה זו יכולה סדירה ואמינה למדוד NO ו- O 2 .- רמות ולהעריך eNOS (פרע) פונקציה בשכבת האנדותל של aortas עכבר שלמים מבודדים טרי בהשמנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבודה בבעלי חיים אושרה על ידי ועדת האתיקה של לשכת וטרינרית פריבורג, שוויץ. הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות על טיפול בבעלי חיים ניסויים במוסד שלנו.
1. הכנה של סט-אפ לאינקובטורים של עורקים מבודדים
- לבנות מערכת אמבטיה איבר אשר ניתן מחומם ל 37 מעלות צלזיוס, מוגזים עם 95% O 2, 5% CO 2 מטנק גז פחמן.
- הכן ככל חיץ ביקרבונט קרבס-רינגר לפי הצורך עם ריכוז בהרכב הבא: (118 mM NaCl, 4.7 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl 2, 1.2 מ"מ MgSO 4, 1.2 מ"מ KH 2 4 PO, 25 מ"מ 3 NaHCO, 0.026 מ"מ EDTA, ו -11.1 מ"מ D- גלוקוז).
- שמור למאגר המניות על הקרח לאורר למאגר עם 95% O 2, 5% CO 2.
- הפעל את מערכת אמבטיה איבר, לקבוע את הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 5 מ"ל של חיץ מוכן לשימוש לכל תאולשמור עידור החיץ עם 95% O 2, 5% CO 2.
- לשטוף לתאי פעם עם חיץ קרבס-רינגר למשך 30 דקות.
- הוסף 5 מ"ל קרבס-רינגר חיץ לכל תא ולכסות את החדר כדי למנוע אידוי.
בידוד 2. עכבר Aortas
- להזריק פנטוברביטול אשר מומס 0.9% NaCl intraperitoneally בריכוז של 150 מ"ג / ק"ג להקריב את העכברים.
- הנח את העכבר supinely על לוח כירורגית.
- תרסיס הפרווה של אזור החזה עם אתנול 70% לצורך חיטוי ולחות.
- חלל החזה להרחיב בחתך סביב הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות, ולהסיר את הריאות.
- הסר את הדם בחלל החזה בעדינות עם ממחטת נייר.
- אחוז הלב בעדינות עם מלקחיים לנתק את אבי העורקים החזי על ידי חיתוך רקמת שומן perivascular בין אבי העורקים ועמוד השדרה עם מספריים כירורגיות.
- מיד לטבול את וולרקמות דואר ב קר כקרח (4 ° C) חיץ קרבס-רינגר.
- הסר את הלב קשת אבי העורקים תחת מיקרוסקופ לנתיחה ולשמור במגזר אבי העורקים החזי במאגר.
- לנתח את אבי העורקים ללא דבקות רקמות perivascular תחת מיקרוסקופ עם מספריים מלקחיים כירורגיים.
- לתפוס את קצה סוף אב העורקים עם מלקחיים, ולשטוף את דם לומן כלי הדם על ידי שטיפה בעדינות חיץ קרבס-רינגר עם מזרק 26 G × 1 / 2".
- חותכים את טבעות אבי העורקים ניקה למקטעים באורך של 3 מ"מ.
הערה: שימו לב בשלב זה לא לפגוע שכבת האנדותל.
3. DHE ו DAF-2da מכתים
- מעבירים את פלחי אבי העורקים לנקות עם מלקחיים לתאי אמבטיה איבר מלא של המאגר קרבס-רינגר ב 37 ° C מוגזים עם 95% O 2, 5% CO 2.
הערה: גע רק בצד adventitial של טבעות אבי העורקים עם מלקחיים לא מהדק את bכלי lood. - לאזן את העורקים בתא אמבטית האיבר למשך 30 דקות.
- להוסיף אצטילכולין (ACH) באמבטיה האיבר אל מיקרומטר 1 הריכוז הסופי, דגירה העורקים במשך 10 דקות.
- הכן 1 מ"ל של תמיסת DHE / DAF-2da (5 מיקרומטר של כל צבע, בדילול מ 1,000 × לני"ע) עם חיץ מראש חימם קרבס-רינגר ב צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. לעטוף את צינור microcentrifuge עם רדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור.
- לאחר גירוי, להעביר את טבעות אבי העורקים מהאמבטיה איבר לפתרון DHE / DAF-2da בצינור microcentrifuge ב 37 מעלות צלזיוס, מוגזים עם 95% O 2, 5% CO 2 ו דגירה טבעות אבי העורקים במשך 30 דקות.
הערה: החל מ שלב זה, לשמור על aortas תמיד בחושך. - מעביר את טבעות אב עורקים לצינור microcentrifuge חדש עם חיץ קרבס-רינגר לשטיפה וחזור על הכביסה שלוש פעמים בתוך דקות 1.
- מעבירים את טבעות אבי העורקים אל פתרון paraformaldehyde 4% עבור קיבעון עבור 30דקות.
- הכן 1 מ"ל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון (300 ננומטר, בדילול מ 1,000 × לני"ע) עם בופר פוספט (PBS) חיץ בתוך שפופרת microcentrifuge 1.5 מ"ל. Counterstain aortas במשך 3 דקות.
- מעבירים את aortas צינור microcentrifuge חדש עם חיץ PBS לשטיפת דקות 1. חזור על הכביסה שלוש פעמים.
הערה: שימו לב שלא מהדק את טבעות אבי העורקים או נזק שכבת האנדותל.
4. אן-פאס שמה
- הוסף טיפה של הרכבה בינונית לשקופית.
- חותכים את טבעות אבי העורקים longitudinally במספריים microsurgical תחת מיקרוסקופ, להפיק את aortas מגולגל שטוח ולעגן אותה אן-פאס על הרכבה בינונית עם האנדותל פונה כלפי מטה על זכוכית שקופית. אל תזיז את aortas הלוך ושוב.
- מכסים את השקופית עם תלוש לכסות ולאטום את השקופית עם לק.
- לאחר ייבוש באוויר תחת הגנת אור, השתמשו שקופיות הדמיה נואשתctly בתוך שעות או לאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס במשך הימים הקרובים.
5. הדמיה מיקרוסקופית Confocal
- שימוש במיקרוסקופ confocal כדי לזהות את אותות הקרינה. הפעל את המכונית ולמטב את הגדרות ההדמיה כגון גדלה, מהירות סריקה, רזולוציה, Z- מחסנית.
- עבור פרוטוקול זה, להשתמש במהירות סריקה 200 Hz, רזולוציה של 1,024 × 1,024 פיקסלים וגודל צעד Z של 0.25 מיקרומטר. Excite הקרינה מן DAF-2da עם לייזר ארגון 488 ננומטר לזהות ב 515 ננומטר, בעוד לרגש הקרינה מן DHE ב 514 ננומטר לזהות על פליטת 605 ננומטר.
- השתמש 10X בהגדלה להתמקד המדגם עד אות DAPI ברורה עם קרנות האולטרה סגולות, ולאחר מכן להתאים את המטרה כדי 40X בהגדלה.
- הגדר את הטווח של שכבת האנדותל ידי התאמת מיקום Z בלוח הבקרה. האותות של גרעינים מוכתמים DAPI הם נקודות סגלגלות או עגולות בשכבת האנדותל.
- סרוק מלמעלה(שכבת האנדותל בגבול לומן) של המדגם דרך עובי מלא דימויים אות ולהקליט האנדותל. בחר לפחות 3 תחומים שונים לסריקת כל דגימה.
6. ניתוח של תמונות
- השתמש בתוכנה כדי לפתוח את הנתונים הסרוקים על ידי מיקרוסקופ confocal. בחר שלוש תמונות רצופות לכל שדה לניתוח ולהעריך לפחות 3 תחומים שונים לדגימה. לייצא את התמונות שנבחרו ולשמור אותם כקבצי JPEG.
- לכמת את התמונות DAF-2da, DHE ו DAPI צביעה עם תוכנת עיבוד תמונה. עבור תמונה מתוך מכתים DAPI, לבחור 'תוספים' → 'לנתח' → 'מונה תא' כדי לספור את מספר גרעין חיובי DAPI.
- עבור התמונות מתוך DAF-2da והכתים DHE, לבחור 'לנתח' → 'מדוד' לנתח את עוצמת האותות, ולקחת את הערך 'Mean "כמו עוצמת האות היחסית. אז הווה התוצאות כיחס DAF-2da כדיגרעינים חיוביים DAPI או יחס של DHE כדי DAPI. עבור כל דגימה, לוקח את הערך הממוצע של כל תמונה ושדה.
- מחלקים את התוצאה של כל מדגם ידי הממוצע של קבוצת הביקורת כדי לקבל את השינוי לקפל. ניתוח סטטיסטי בוצע מבחן t הסטודנטים מזווג או ANOVA עם Dunnett או שלאחר הבדיקה Bonferroni. תן נתונים כממוצע ± SEM. שקול בדלי ערכים ממוצעים כמשמעותיים על p <0.05 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השמנת יתר היא גורם סיכון חשוב למחלת לב כלילית איסכמית קשורה לירידה אנדותל NO הזמינות הביולוגית, סימן ההיכר של מחלת טרשת עורקים 21. eNOS-שיחררה הוכח להיות מנגנון חשוב של תפקוד אנדותל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כולל הזדקנות 22, טרשת עורקים, והשמנה 14. לכן, כאן אנו משווים עכברים הרזים ושמנים להראות את תוצאת הנציג של NO ו- O 2 .- רמות aortas.
החל בגיל 7 שבועות, עכברים זכרים (C57BL / 6-י) קיבלו גישה חופשית במהלך 14 שבועות או א צ'או רגיל (NC; תכולת האנרגיה: שומן 10.6%, 27.6% חלבון, ו -57% פחמימות, סיבים 4.8% ) או דיאטת שומן גבוה (HFD, תכולת אנרגיה: שומן 55%, 21% חלבון, ו -24% פחמימות). לאחר 14 שבועות של עכברי HFD היוהקרב aortas החזי נותח, וניקה של רקמות דבקות. לפני DAF-2da ו DHE מכתים צעד, eNOS מעכב LN G -Nitroarginine מתיל אסתר (L-NAME) (1 מ"מ) נוספה לתא אמבטיה במשך שעה 1 לחסום eNOS פעילות 14. תוצאות הקרינה confocal נציג הוצגו באיור 1. הצבע הכחול של הפאנל העליון מייצג את הגרעין של תאי אנדותל יוכתמו DAPI. בחלונית האמצעית, הצבע הירוק היא אות הקרינה מן DAF-2T מרה מן DAF-2 ללא ניאון על ידי NO, כלומר אם עוצמת האות ירוקה גבוהה, יש יותר אין בתאים. באופן דומה, את הצבע האדום של הפנל התחתון הוא אות הקרינה מן DHE חמצון על ידי O 2 .-, כך המדגם מראה צבע אדום יותר יש יותר מ 2 .- בתאים.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Confocal חשף ירידהד NO ייצור (DAF-2da מכתים) והגדילה L-שם-רגיש O 2 .- דור (DHE מכתים) בשכבת האנדותל אבי העורקים של העכברים שהוזנו HFD בהשוואה לזו של העכברים שהוזנו NC (איור 1) 14, דבר מצביע eNOS-שחרר בהשמנה. האותות היו לכמת ומוצגי הגרפים הברים 14.
איור 1. eNOS-שיחררה בהשמנה. מיקרוסקופיים Confocal en זיהוי פנים של NO ו- O 2 .- ידי DAF-2da והכתים DHE, בהתאמה. n = 5; *** p <0.005 לעומת NC; p ††† <0.005 לעומת קבוצת HFD. סרגל קנה מידה = 0.1 מ"מ. (נתונים היו בהפניה 14) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איתור של NO או O 2 .- עם צבעי ניאון שימש לעתים קרובות במחקרים רבים בתאי האנדותל תרבותי וגם cryosections רקמות 23. כאן הארכנו בשיטה זו כדי כלי הדם ללא פגע החיים, כלומר, en זיהוי פנים של NO ו- O 2 .- רמות בשכבת האנדותל עם DAF-2da ו DHE, בהתאמה, שהוא יעיל, פשוט יחסית, האינטואיטיבית. לשם השוואה עם שיטת cryosections וסקולרית, שיטה זו מציגה רקע נמוך יותר כמותיים, מאז סיבים אלסטיים בתקשורת של עורק במיוחד האאורטה ב cryosections לתת אותות autofluorescence חזקים מאוד אשר יכול להפריע NO הספציפי או O 2. - אותות שנוצרו בתאי האנדותל. יתר על כן, ספציפית O 2 .- דור ידי מונואמין NADPH או אנזימים אחרים לתאי שריר חלק המדיאלי יכול גם להפריעעם האותות בתאי האנדותל בסעיף וסקולרית, המייצג את חסרונה של השיטה עם cryosections וסקולרית. לעומת זאת, שיטת מכתים פן en מזהה אותות במיוחד משכבת אנדותל של פלח כלי דם שלמים ולכן נותנת ניתוח מדויק יותר. מכונת cryostat להכנת cryosection היא גם השקעה יקרה. השוואת שיטות ביוכימיים אחרות, המגבלה העיקרית של שיטה זו היא פחות כמותית, אבל זה בחירה טובה להשוואת ביחס בין דגימות. יתר על כן, הדרישה של מיקרוסקופ confocal שהוא יקר יכול להיות גם מגבלה של שיטה זו. המערכת הקאמרית רב-איבר היא נוחה ואם זה אינו זמין במעבדה, אפשר בקלות להקים מערכת עם אמבט מים וצינורות המחוברים מיכל גז פחמן עם מערכת רגולציה, כך כלי דם הצינורות הם שמרו על 37 מעלות צלזיוס, סודה עם 95% O 2, 5% CO ישנם מספר שלבים קריטיים כי יש לשים לב. הקפד כי רקמת perivascular הוא ניקה להרכבה קלה. קרישי הדם בתוך כלי דם לומן חייבים להיות סמוקים משם, משום שהם עלולים לגרום לאותות מלאכותיים להפריע אותות קרינה. במהלך ההליך כולו של הכנת כלי דם, דגירה, כביסה, גזירת הרכבה, אחד צריך להיות זהיר מאוד שלא לפגוע שכבת האנדותל של כלי הדם. אל תתנו יבש כלי דם במהלך כל ההליך של הכנה. DHE ו DAF-2da הן בדיקות ניאון, אז החל מהשלב מכתים את aortas צריך להיות מוגן תמיד מפני חשיפה לאור. לפני קיבעון לשלב לתאי אנדותל של aortas חייב להיות בחיים, ולכן aortas צריך להישמר תמיד במאגר קרבס-רינגר מוגזים עם 95% O 2, 5% CO 2. תמונות של הדגימות צריכות להילקח בהקדם האפשרי לאחר הכנה. לזרוחאות NCE תיחלש בעוד כמה ימים אפילו עם ההגנה של הרכבה בינונית, אשר עשוי להשפיע על הדיוק של התוצאות. השיטה לא יכולה להגיש בקשת כלי דם עם קיר כלי דם עבה מדי. שיטה זו מאפשרת דמיון סימולטני של NO ו- O 2 .- ייצור בשכבת האנדותל של כלי דם ללא פגע, אם שני צבעים נוספו כלי הדם יחד. אפשר גם להשתמש בשיטה זו כדי לבדוק את השפעות תרופתיות של תרופות על NO ו- O 2 .- ייצור במבחנה בכלי דם מבודד. לשם כך, אב העורקים ניקו בדרך כלל נחתכו לשני חלקים, אחד הוא לבקרה אחרת הוא לטיפול בסמים, והתרופה יש להוסיף למאגר הדגירה לאחר איזון לפני DAF-2da ו DHE מכתימים צעד. זה שימושי במיוחד, אם שיטה זו משמשת יחד עם שיטה אחרת, למשל, עם ניתוח של תגובות וזומוטורים נ דם המבודדessels תפקיד פיזיולוגי של תאי אנדותל ניתן לאשר. שיטה זו תהיה גם מתאימה לניתוח של כל האנדותל (פרע) פונקציה בכלי דם ללא פגע של מודלים מחלים ואת המנגנונים. לסיכום, הצגנו פרוטוקול פשוט בו זמנית לאתר NO ו- O 2 .- ייצור שכבת האנדותל של כלי הדם ללא פגע עם מיקרוסקופ confocal הקרינה. אנו מראים כיצד שיטה זו פעלה בהצלחה במודל עכבר להשמנה. שיטה זו היא טכניקה שימושית חקירת האנדותל NO ו- O 2 .- ייצור בתנאי מחלת כלי דם רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) | Sigma-aldrich | N5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health (NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| Coverslip round diameter 15 mm | VWR | 631-1579 | |
| Tips 1 ml | VWR | RFL-1200c | |
| Tips 200 μl | VWR | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
- Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
- Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
- Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
- Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
- Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
- Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
- Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
- Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
- Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
- Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
- Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
- Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
- Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
- Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
- Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
- Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
- Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
- Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
- Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).
