Introduction
Inducerede pluripotente stamceller fra humane prøver (hiPSCs) er en hurtig udvikle teknologi af stamcelleforskning. De tilbyder et alternativ til embryonale stamceller (embryonale) forskning med langt færre etiske og moralske ulemper 1,2. Selv om de ikke er identiske med epigenetisk hESCs 3-5, hiPSCs tilbyder en unik måde at modellere udviklings- og sygdomsfænotyper, og de kan være afledt fra væv relevante for sygdomstilstanden 5-8. Nye metoder til at generere hiPSCs konstant bliver udforsket for at identificere optimale celletyper til at starte med, som en måde at forberede GMP kvalitet iPSCs egnet til transplantation, og også for at øge aktualiteten og effektiviteten af omprogrammering proces 6,9-11.
Luftvejsepitelceller er kritiske i udviklingen af allergisk inflammation 12, og epitelet er en væsentlig drivkraft for allergiske reaktioner og luftveje remodellering gennem interaktion med Immune og stromaceller. Den luftvejsepitel spiller en væsentlig rolle i oprindelsen og persistens af lungesygdomme såsom astma. Men lavere luftvejsepitelceller er vanskelige at opnå i et klinisk miljø, især fra sunde kontrolpatienter og børn. Data fra flere undersøgelser støtter den forudsætning, at epitelceller fra nasale slimhinde er en gyldig og praktisk proxy for lavere luftvejsepitelceller 13-20, især når de studerer reaktioner på luftforurenende stoffer og allergener. Næseslimhinden består af mere end 90% cilierede luftvejs epitelceller og prøveudtagning disse nasale epitelceller (NEC) kan let udføres i børn helt ned til alder fire eller fem, da det er mindre invasiv end andre celle / vævs stikprøver og er forbundet med minimal risiko for bivirkninger såsom infektion 20-23. Det tilbyder en hurtig og enkel måde at prøve både raske og syge børn uden lange, unødvendige og ofte smertefulde bronkoskopi Procedures der kræver sedation. Tidligere undersøgelser har vist, at sygdomstilstande undertyper relateret til astma sværhedsgrad kan skelnes i både næseslimhinden såvel som bronkiale celleprøver taget fra astmatiske børn, og genekspression mellem de to vævstyper var ens i ca. 90% af ikke-allestedsnærværende gener 22 , 24. Som en kilde til iPSCs, NEC tilbyder fordele frem for andre hyppigt anvendte celletyper. Fibroblaster anvendes ofte til iPSC generation, men selv om disse celler nemt kan dyrkes fra en hudbiopsi, denne proces kræver typisk lokalbedøvelse, et indsnit, og suturer, og er forbundet med en vis risiko for infektion. Derfor opnåelse informeret samtykke fra patienter til denne type biopsi kan være svært 25. Et alternativ til fibroblaster er perifere mononukleære blodceller (PBMC'er). Det kan dog være vanskeligt at opnå tilstrækkelig blod for iPSC generation fra pædiatriske patienter. Derudover er der begrænsninger for downstream applikationer for fibroblast og blodlegemer afledte iPSCs, især deres differentiering kapacitet til bestemte celletyper 5,26. Henset den relative tilgængelighed og lav risiko for bivirkninger efter deres samling, NEC udgør en ideel celle kilde til iPSC generation fra pædiatriske populationer.
iPSCs har fået en masse opmærksomhed for nylig som en platform for forskning i menneskers udvikling, skaber nye sygdomsmodeller, og som en potentiel kilde til celler til personlige behandlinger. Før det fulde potentiale af denne teknologi kan realiseres, de molekylære fundament for omprogrammering proces har brug for at blive belyst, men for nu denne protokol og de procedurer, der er skitseret i vil belyse de forskningsundersøgelser fokuseret på luftvejs eksponeringer, samt skabe en platform for undersøgelse af virkningerne af skræddersyet medicin involverer iPSCs.
Det samarbejde arbejde af flere laboratorier har ført til generation af en vellykket teknik til ikke blot prøveudtagning næseslimhinden, men også dyrkning NEC, og omprogrammering disse celler til iPSCs 23. Denne artikel indeholder en oversigt over en protokol for optimal sampling, dyrkning, og omprogrammering betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol følger retningslinjerne fra institutionernes menneskelige videnskabsetisk komité.
1. Prøveudtagning næseslimhinden
BEMÆRK: Få prøver fra patienter, som er fri for tegn på respiratorisk virusinfektion.
- Forbered en 15 ml konisk frisk før deltageren besøg og der tilsættes 2 ml BEGM (bronchieepithelceller Cell Growth Medium) plus 20 pi sterilt Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- Åbent cytologi børste lige før du tager prøven, og sørg for at holde børsten steril og ikke røre det til alle overflader udover den nasale overflader.
- Spørg deltager til at sidde stille og vip hovedet op mod loftet. Har mindre eller mere urolige børn sidde på deres hænder og / eller ligger ned for at undgå smækkede børste væk.
- Sigt pensel på bagsiden af næsen, hvor passagen indsnævres (Ligner en lille sort hul). Skub børsten ned og vride håndleddene som børsten fjernes fra nostril.
- Placer børsten i konisk og nedsænkes i BEGM. Skær overskydende børste og erstatte hætten på tuben. MÅ IKKE VORTEX.
BEMÆRK: Hvis deltageren er villig, få en anden pensel på samme måde, men i det andet næsebor. Opnåelsen af et børstning af begge næsebor vil resultere i en højere sandsynlighed for, at prøveudtagningen vil blive en succes. Prøveudtagning samme næsebor kan resultere i blødning og vil ikke sandsynligt forbedre prøven. - Opbevare prøver så tæt på 37 ° C som muligt under transport under anvendelse af et bæger med varmt vand.
2. celletal og Cytospin
- agitere forsigtigt penslen i BEGM og tage 10 pi af prøven til en celletælling ved hjælp af et hæmacytometer. Tilsæt 10 pi af en levende / død plet og tæller kun levende celler under et mikroskop.
- Tag 50 pi af prøven og fortyndes til 200 pi med 1x PBS. Tilføj til cytospin tragt knyttet til objektglas og centrifugering ved 300 rpm i 2 min. Lad glide tør O / N og plet slide following producentens anvisninger. Lad tørre O / N, fortrinsvis i mørke.
- Stain Slide med Hema 3 Stain
- Overfør hver løsning (Hema fiksativ, lyseblå, Hema 3 Solution I, pink, og Hema 3 Solution II, dyb blå) i en farvning fad; Hold dækket, når ikke er i brug. Indsæt glider ind slide farvning båd
- Dip glider kontinuerligt i fiksativ i 30 sek, derefter give overskud til at dræne. Dip glider kontinuerligt i Løsning I i 30 sek, derefter give overskud til at dræne. Dip glider kontinuerligt i Opløsning II i 30 sek, derefter tillade overskydende at dræne
- Skyl med deioniseret vand, indtil vandet er klart. Lad tørre O / N, fortrinsvis i mørke
- Kig på dias under mikroskop og tæller celler, bestemme procentdelen af epitelceller. Skal være 90% eller mere, hvis prøveudtagningen er god.
3. Seeding Celler
BEMÆRK: Udfør alle cellekultur procedurer i en ordentlig og certificeret vævskulturhætte anvendelse af sterilt teknik.
- Coat plader med Bovin Dermal Collagen (BDC), type 1. Tilføj 0,5 ml 3 mg / ml BDC fortyndet i 49,5 ml 1x PBS. Forbered mindre, hvis vil kun blive brugt et par plader. Coat en T25 kolbe med 2 ml BDC og inkuberes i sterilt hætte O / N eller ved 37 ° C i 2 timer, hvis det er nødvendigt.
- Efter inkubering aspireres enhver resterende væske. Udsætte kolber for UV-lys i 30 minutter i sterilt hætte. Opbevar kolber til op til en måned ved 4 ° C, men bringe dem til RT eller 37 ° C før såning celler.
- Hold pensel og celler i BEGM ved 37 ° C indtil den er klar til frø. Forsigtigt hvislen børste inde konisk, men gør ikke vortex.
- Plade 7 x 10 5 celler i en T25-kolbe. Hvis der er mindre, bruge en mindre beholder, såsom en brønd i en 6-brønds plade. Denne størrelse plade kræver ca. 3 x 10 5 celler.
BEMÆRK: Hvis der ikke er så mange celler, er det ikke tilrådeligt at fortsætte.
- Plade 7 x 10 5 celler i en T25-kolbe. Hvis der er mindre, bruge en mindre beholder, såsom en brønd i en 6-brønds plade. Denne størrelse plade kræver ca. 3 x 10 5 celler.
- Under en steril hætte, tage børste ud af røret og GEntly rotere pensel på overfladen af den coatede kolbe, og pas på ikke at ridse belægningen. Kassér pensel i en passende biologisk farligt beholder.
- Langsomt pipettere de resterende celler i BEGM ud af den koniske og ind i T25 kolbe. Overhold cellerne under mikroskop. Et antal flydende celler vil blive observeret, og der kan være nogle rester fra næsen, som er acceptabelt i denne fase (figur 3A).
4. Cellekultur
- Efter podning celler, lad dem nøjes i 48 timer uden afbrydelse (figur 3). Efter 48 timer, langsomt og forsigtigt tilsættes 2 ml varm BEGM og 20 pi sterilt penicillin / Streptomycin / Fungizone (P / S / F).
BEMÆRK: IKKE aspirere de oprindelige 2 ml medier. - På den 4. dag efter podning omhyggeligt aspirere al væske, og erstat med 4 ml friske, opvarmes BEGM plus 1x Pen / Strep (fungizon er ikke længere nødvendig). Skift medier hver to dage og vurdere celler til vedhæfteling, vækst og sammenløb. Når cellerne når ~ 80% konfluens, sædvanligvis i 2-3 uger, er de klar til at blive passeret.
- En T25-kolbe (ca. 2,5 x 10 6 celler, når sammenflydende) kan passeres i tre T25 kolber eller en T75 kolbe. Efter den første passage, skal cellerne være robuste og sunde, når konfluens omkring hver tredje dag.
5. passage Celler
- aspireres forsigtigt mediet fra pladen. Tilsæt 1 ml 0,05% trypsin opløsning pr T25 kolbe til pladen og plads i inkubatoren for omkring 4min, eller indtil cellerne løsnes fra pladen. Kontrollér niveauet for udstationering af celler hver 2 min og ikke forlader Trypsin på længere end 10 min.
- Tilsæt 5 ml Trypsin neutraliserende opløsning (TNS), eller serum-holdige medier at neutralisere enzymet. Fjern al væsken og cellerne fra kolben og anbring det i et 15 ml konisk rør.
- Centrifuger ved 200 xg (acceleration 0 deceleration 0) i 5 minutter til opnåelse af en cellepellet. Aspirer supernatige og resuspender cellerne i BEGM + P / S i volumen, der kræves for de nye kolber (4 ml til en T25 kolbe, 10 ml til en T75 kolbe)
- Udfør celletælling med en levende / død plet som beskrevet ovenfor (2.1). Tilsæt egnet mængde BEGM og celler til de coatede kolber og vende tilbage til inkubatoren. Oprethold som detaljeret ovenfor eller Cryopreservering i frysemedium (70% BEGM, 20% FBS og 10% DMSO) ved en koncentration på 0,5-2 x 10 6 celler pr.
6. Omprogrammering til iPSCs
BEMÆRK: Før generere iPSCs, sikre overholdelse af alle institutionelle regler generering og anvendelse af menneskelige iPSCs. Steril teknik er især vigtigt for IPSC kulturer, som dyrkningsmedium ikke rutinemæssigt indeholder antibiotika. Det er kritisk, NEC vises sunde og er robust proliferativ for vellykket omprogrammering.
- Plade 5 x 10 5 NEC'erne per brønd af en 6-brønds vævskulturplade. Efter 24 timer, tilsæt polybrentil BEGM til en endelig koncentration på 8 pg / ml og transducere NEC ved tilsætning lentivirale partikler udtrykker Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc til medierne. Til formål at opnå en mangfoldighed af infektion (MOI) på ~ 5 27.
- Til bestemmelse af MOI, forberede serielle fortyndinger af den koncentrerede-lentiviral lager og transducere HT1080 celler med disse fortyndinger. Efter første utvetydigt påvisning af dTomato ekspression i HT1080 celler, beregne antallet af "transducerende enheder / ml" ved at score antallet af dTomato-positive celler / små klumper af celler i hver fortynding.
BEMÆRK: Typisk vil der være fortyndinger, der er for høj (alt er dTomato positiv) og for lavt (ingen eller kun et par positive celler). - Udfør scoring fra fortyndinger, hvor diskrete positive celler / små klumper af celler er identificeret. Bestem titeren ved at korrigere antallet af transducere enheder / ml med den passende fortyndingsfaktor. MOI er da forholdet mellem antalletaf transducerede celler til antallet af viruspartikler 27.
BEMÆRK: Hver dTomato positiv celle / lille klump antages at hidrøre fra en enkelt virus partikel.
- Til bestemmelse af MOI, forberede serielle fortyndinger af den koncentrerede-lentiviral lager og transducere HT1080 celler med disse fortyndinger. Efter første utvetydigt påvisning af dTomato ekspression i HT1080 celler, beregne antallet af "transducerende enheder / ml" ved at score antallet af dTomato-positive celler / små klumper af celler i hver fortynding.
- Ca. 3 timer efter transduktion, fjern medier og erstatte med frisk BEGM. Kassér lentivirus-holdige medier ved hjælp af institutionelt-godkendte procedurer. Retur transduceret nationale Europass-centre til inkubatoren i 3 dage.
- På dag 3 erstatte medier med friske BEGM, og derefter inkuberes i yderligere 3 dage. Aspirer brugte medier, vaskes cellerne med 1 x PBS, og der tilsættes 1 ml 0,05% trypsin-opløsning til brønden. Passage celler med trypsin som skrevet ovenfor (afsnit 5). aspirere forsigtigt supernatanten og resuspender cellerne i 4 ml BEGM + P / S. Celler kan passeres til en ny brønd i en 6-brønds plade overtrukket med BDC eller lægges til MEF kulturer, hvis klar (se næste trin).
- Forbered MEF coatede plader. På dag 4 tilføje 0,1% gelatine-opløsning (1 ml / brønd) til 2 brønde i en 6 godt (at udføre +/- Thiazovivin (SPT) se trin 6.6). På næstedag, tø et hætteglas med inaktiverede MEF'er 28.
- Placer MEF'er i 10 ml MEF medier (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Centrifugering ved 200 xg i 5 minutter for at pelletere. Resuspender i MEF medier. Aspirer gelatine fra 6-brønds plade og tilsæt 1,87 x 10 5 MEF'er per brønd af gelatineovertrukket plade 6 brønd. Inkuber O / N ved 37 ° C, eller i mindst 24 timer.
- Overfør 2 ml BEGM indeholdende transducerede celler pr i 2 brønde i en tidligere overtrukket 6 brønds plade og inkuber O / N. Den næste dag, erstatte BEGM med 2,5 ml per brønd af standard hESC medier indeholdende 4 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor. Feed celler med frisk hESC medier +/- SPT dagligt i 10 dage
BEMÆRK: Det er muligt at tilføje en cocktail af små molekyler (SB431542, PD0325901, og Thiazovivin (SPT) cocktail) for at øge effektiviteten og kinetik omprogrammering for NEC 23. - Efter ti dage, fortsætte med at fodre dagligt bruger hESC medier uden SPT. Feed kulturer dagligt indtil hESC-lignende koloniervises (figur 5A, P0 koloni). Identificer kolonier huser formodede iPSCs ved deres høje kerne: cytoplasma forhold og fremtrædende nucleoli.
- Manuelt punktafgifter og overføre kolonier med embryonale-lignende morfologi til at adskille brønde for kultur og ekspansion som separate linjer i en feeder-frit system. Udskårne kolonier bør hurtigt at tilpasse sig disse betingelser.
- Efter plating udskåret kolonier disse diskrete formodede IPSC linjer betragtes nu passage 1 (P1). Feed kulturer dagligt med mTeSR1. Passage og udvide IPSC linjer ved hjælp af standardprocedurer. Det kan tage flere dage til en uge for p1 kolonier at nå størrelse, hvor de skal passeres.
7. Vedligeholdelse iPSCs i Kultur
- Foder og evaluere kulturer dagligt. Manuelt forbrugsafgifter områder udviser åbenlys differentiering ved at skrabe med en steril glas pipette eller micro pipette spids. Skift medier efter daglig plukning.
- Passage celler efter opstillet cately hver fjerde dag: forsigtigt aspiratprøver medier, tilsættes 1 ml varm dispase (1 mg / ml) pr brønd af en 6-brønds plade (halv fodring volumen), derefter inkuberes ved 37 ° C i ca. 4 min. Kanterne af kolonierne vil begynde at løfte, som ligner en hvid kontur omkring kolonien. Forsigtigt aspirere den Dispase og vask 3x med varmet DMEM / F12.
- Tilsæt 2 ml mTeSR1 og bruge en celle lifter til at løfte kolonierne fra pladen. Brug en 5 ml serologisk pipette eller P1000 mikropipette til forsigtigt tritureres cellerne indtil kolonierne er opdelt i mindre klynger.
- Undgå at producere meget små klynger eller enkelte celler, som overlevelse og efterfølgende spredning vil være optimal. Når re-plating kolonier, en 1: 4 til 1: vil 6 split opretholde en optimal koloni tæthed. forsigtigt fjerne kolonier og medier fra pladen og tilsæt til nye, Matrigelcoatede brønde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den indledende del af næsen, kaldet næsehulen, er det område omgivet af brusk 29. Børsten skal gå glat forbi dette område af næsen, ud over den nasale ventil (ostium internum, eller den "sorte hul" ses på bagsiden af nare), og prøven opnået fra inferior turbinate (figur 1). De nasale turbinater er knoglestrukturer, der øger overfladearealet af næsen 29, hvilket gør dem til et ideelt sted for prøveudtagning. Området er også foret med vaskulariseret slimhindevæv, der ligner garnering i de nedre luftveje og er også aktiv i immunresponset på miljømæssige eksponeringer.
Prøveudtagning korrekte væv sikrer, at de celler, der omprogrammerede er epitelceller. Dette kan vurderes af den oprindelige celletal og cytospin, men også ved at observere de celler i kultur. Detcytospin, når spundet ned, tørret og farvet, viser sammensætningen af prøven. De fleste prøver består af epitelceller, som er søjleformet og cilierede, med en rund kerne. Med Hema 3 pletten kit, de plette en lys blå farve med en mørkere lilla kerne (figur 2), og ofte når taget direkte fra næsen de ses klumpet sammen. Selvom nasale celleprøver er oprindeligt en blanding af celletyper samt rester fra næsen, med tiden i kultur og med medieændringer, epitelcellerne bliver fremherskende (figur 3A, B). Når epitelceller vokser til konfluens, bliver de formet som en frisk knækægsbiprodukter, hvor kernen er stort og beliggende i centrum og cytoplasmaet er slags "nå ud" og strækker sig så cellen forbereder at opdele (figur 3B). Da cellerne vokse sammen, begynder de at påtage sig mere af en fodbold form, og passer sammen stramt i skålen (figur3C).
Når cellerne transduceres, vil de udtrykker tdTomato fluorescerende markør i kernen. Figur 4 viser cellerne, når de er blevet transduceret, i kraftigt felt, fluorescens og med begge billeder fusioneret. Ikke alle cellen udtrykker markering, og derfor ikke hver celle blev transduceret, men hver brønd bør have omkring 90 procent transduktionseffektivitet, og dette vil øge sandsynligheden for, at nogle celler vil opnå pluripotens efter at være udpladet på MEF'er.
Når co-dyrket med MEF'er og som celler begynder at danne kolonier, vil de gradvist stoppe udtrykker tdTomato. Dette er imidlertid ikke den bedste indikation af kolonidannelse. Den bedste indikation af kolonidannelse er visuel bekræftelse. hESC kolonier, som er "gold standard" af pluripotens, er for det meste rundt og er sammensat af mange små, runde celler med large kerner og en høj kerne til cytoplasma forholdet. Hver celle vises oftest sammensat af kernerne, og andre organeller er ikke klart synlige. Efter iPSC koloni høst, og kultur i standard fødefri betingelser, bør nydannede IPSC kolonier ser meget gerne deres hESC modstykker, og de individuelle celler er næsten identisk med embryonale fænotype, som det ses i figur 5B.
Før udnytte iPSCs genereret fra nasale epitelceller (NEC-iPSCs) i eksperimenter, anbefales det at vurdere kvaliteten af nye linjer. Dette involverer typisk vurdering af karyotype, ekspressionen af pluripotens markører, og evnen hos iPSCs til at differentiere til hver af de 3 embryonale kim lag (endoderm, mesoderm og ektoderm). Differentiering kapacitet kan testes på mange måder, men i øjeblikket, den strengeste assay er teratom assay 2,23,30. Mere omfattende assays, såsom transkriptionelle og epigenomic profilering er nyttige til at fastslå, om der kromosomafvigelser introduceres ved omprogrammering 23.
Figur 1. ringere turbinate. Sampling bevægelse og målet prøvetagning, ringere turbinat, er angivet med sort pil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cytospin. Det meste af prøven består af epitelceller, som er lange og søjleformede, med cilier i den ene ende og et rundt kerne i den anden. De er ofte klumpet sammen, når samplet direkte fra nare. Pile viser individuelle epitelceller."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Primære nasale epitelceller i kultur. (A) flydende celler og debris lige efter prøven er indsamlet og belagt. (B) Celler én dag efter at være passeret. Cell morfologi er konsekvent og kulturen består primært af nasale epitelceller, 10x forstørrelse, og (C) 5X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Transduktion af NEC. Celler bliver transduceret har taget op vektoren og vise rød fluorescens markør tdTomato. Denne markør bør falme som de fremskridt i retning af en pluripotent tilstand. (A) Bright felt foto af transducerede celler. (B) Fluorescerende billede af transducerede celler. (C) Overlay af lyse felt og fluorescerende billeder (paneler A og B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. iPSC stamcelle-lignende kolonier. (A) Dyrkning på MEF'er, koloni er for det meste rundt om kanterne og viser lidt at ingen differentiering. (B) Individuelle celler viser typiske embryonale-lignende morfologi, med små runde celler med store kerner.5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nasal epitelceller (NEC) er en tilgængelig platform for at studere luftvejssygdom, og NEC-iPSCs tilbyder et spændende avenue at udforske sygdom udvikling, behandling og terapi 1,31,32. NEC kan nemt opnås uden stressende eller potentielt skadelige procedurer 6,23. Det er vores erfaring, vises prøvetagning af næseslimhinden, som beskrevet i denne protokol til at være mindre stressende og bedre opfattet end blod kollektion til børn. Derfor kan denne metode være særligt nyttige i pædiatriske patientpopulationer og relevante for at studere luftvejssygdomme. Den anden fordel ved nationale emissionslofter er, at når de er i kultur, er epitelceller udvalgt til med medier og kultur tilstand og bliver homogen. Dette er fordelagtigt end at bruge en kompleks væv såsom blodceller og gør det lettere at evaluere virkningen af celle oprindelse i følge IPSC linjer ved hjælp transkriptom og epigenetiske tilgange.
Hvornårprøveudtagning næseslimhinden, er det vigtigt, at det korrekte område af næsen samples, således at det meste epitelceller hentes, som det fremgår ved at se cytospin under et mikroskop (figur 2). Korrekt prøveudtagning vil give ≥90% epitelceller. Det er afgørende at opnå prøver fra raske patienter, og for at sikre, at prøven er indsamlet hensigtsmæssigt med henblik på at maksimere celleantallet opnået og udpladet. Den drejende bevægelse beskrevet i protokollen (afsnit 1.5) sikrer, at børsten kommer i kontakt med så meget af den nasale overflade som muligt. Det er en naturlig refleks at vende ens hoved, når et fremmedlegeme er på vej mod ens ansigt. Derfor, i tilfælde af at barnet fylder hans eller hendes hoved eller trækker sig væk, er det vigtigt, at der forekommer prøveudtagning hurtigt og præcist. Ved hjælp af disse teknikker vil øge effektiviteten af alle andre af protokollen, og bestemme sandsynligheden for en vellykket omprogrammering. Beder barnettil at ligge ned, og endda til at placere deres hænder under dem eller har en forælder eller søskende holde deres hænder er en god måde at tilskynde dem til at ligge stille og at hjælpe med at sikre en smidig og smertefri samling prøve.
For nylig har et par andre stikprøveteknikker blevet evalueret for komfort, lethed, og prøve resultater baseret på celle indhold og sammensætning samt RNA og DNA giver 33. Gruppen gennemgik sampling med en cytologisk børste versus en polyester vatpind, og de stikprøven både den ringere turbinate samt de forreste næsebor ved kraftig hvirvlende børsten eller vatpinden rundt næseborene. Prøveudtagning ringere turbinate med en børste viste sig at være lidt ubehageligt, selvom det giver de bedste RNA udbytter og bestod af de mest cilierede epitelceller i sammenligning med en polyester vatpind. Det foreslås i denne protokol metode er derfor bekræftet som den mest pålidelige metode til prøveudtagning den nasale epitel som en måde at studere respiratoriske luftvejeepitel.
Når prøven er opnået, skal den holdes ved 37 ° C. En af de mest effektive måder er at opvarme et bægerglas med vand til mere end 37 ° C og nestle den i en Styrofoam beholder til sikker transport, mens forbereder at opfylde deltageren. Lige før prøven er indsamlet, tilsættes koldt vand, således at temperaturen bringes til ca. 37 ° C, og tilsæt konisk rør med medierne. Når børsten sættes til den konisk rør, straks returnere røret til vandbadet og holde den der, indtil den kan returneres til laboratoriet, ved hvilket punkt røret bør sættes i en reguleret 37 ° C vandbad, indtil cellerne er podes på en dyrkningskolbe. På alle punkter, bør steril teknik anvendes for at undgå indføring af fremmede agenser i kulturen.
En betydelig mængde variabilitet blandt prøverne blev set, når celler blev sat i kultur. Denne variabilitet syntes at skyldes både donor kilde samtprøven kvalitet selv. En måde at øge prøve kvalitet er at opnå en børste fra hvert næsebor, eller to børster pr deltager. Efter såning den friske prøve, og da cellerne passeres, tilstanden af cellerne bør overvåges regelmæssigt for at være sikker på at de er egnede til at blive omprogrammeret. Celler, der gør de bedste kandidater til er dem, der tager til kultur og formere hurtigt. Det vides ikke, hvorfor celler fra visse donorer er mere robuste end dem fra andre celler, men det kan skyldes faktorer som alder, størrelse af næsen, og donorens helbred på tidspunktet for prøveudtagningen. Når en prøve udbyttet meget få celler, eller kun et lille antal celler vedhæfte engang belagt, prøven er usandsynligt at vokse til sammenløb. Hvis en kæmper kultur gør nå sammenløb, cellerne tendens til at være svag og mange celler dør under passage. Denne type prøve er en meget dårlig kandidat til omprogrammering, da det er vigtigt, at cellerne prolifererer hurtigt og robust, og at de ertransduceres på det tidligst mulige passage nummer. Det er ikke tilrådeligt at transficere celler, der vokser langsomt, om dette skyldes at donor variabilitet, dårlig prøvetagning, eller overførselsteknikker kulturer for tynd. Hvis omprogrammering forsøges med en dårlig cellekultur, er det usandsynligt, at gå videre til at bære frugt.
Forberedelse af celler til transduktion er en del af protokollen, der er sværest at forberede. Baseret på væksten af cellerne, 2 x 10 5 til 5 x 10 5 celler foreslås til transduktion og dette kan afhængig af specifikke patientprøver. Derfor kan det kræve et par brønde belagt med varierende celleantal for at opnå den ideelle antal.
Denne protokol skitserer ikke blot lethed af prøveudtagning, men også den relative lethed og tidslinjer for at etablere primære cellekulturer, og efterfølgende omprogrammering af disse primære cellekulturer til IPSC linjer for mere bæredygtige og alsidige muligheder forskning. Heleprocessen fra klinik til etablering af diskrete iPSCs i kultur tager omkring 3 måneder, og nye metoder til afkortning omprogrammering gange bliver udviklet 6,34,35. Dette felt er under hastig udvikling at finde mere effektive og komplette måder at konvertere primære celler til iPSCs, og efterfølgende differentiere iPSCs i specifikke celle- og vævstyper af interesse. Imidlertid differentierende protokoller for væv er vigtige for luftvejssygdomme, såsom lungen epitel, stadig under udarbejdelse 36-38.
Generering iPSCs fra NEC har den fordel, enkle og relativt smertefri isolering af celler. Endvidere er det muligt, at NEC-iPSCs tilbyde fordele i forhold iPSCs afledt af andre vævstyper, der kan udnyttes. Virkningen af IPSC epigenetik ved efterfølgende iPSC differentiering ikke helt forstået, selv om undersøgelser viser, at mus og menneskelige iPSCs havnen transkriptionel og epigenetisk minde om deres somatiske celleoprindelse, og at dette selektivt favoriserer deres differentiering i slægter forbundet med donor celletype mens begrænse andre skæbner 5,26. På grund af vigtigheden af vævet af oprindelse, og hvordan det påvirker de funktionelle egenskaber af iPSCs, især med hensyn til opbevaring af vævsspecifikke epigenetiske mærker 39-45, skal mere klart undersøges for IPSC linjer til bedre forstået indvirkning af vævet oprindelseslandet. Det er tidligere blevet vist, at NEC-afledte iPSCs huser en genomisk methylering signatur indikerer tilbageholdelse af en epigenetisk minde om deres væv af oprindelse 23. En sådan epigenetisk hukommelse bevares i NEC-iPSCs kan være gavnligt i differentiering af pluripotente stamceller ind i luftvejs celler, som tidligere undersøgelser har vist, at blodlegemer afledte iPSCs udviser epigenetisk mindet om blodceller oprindelsesbetegnelser lettere differentieret i blodceller end fibroblast eller glatte muskelceller afledt iPSCs mangler blood celle-specifikke epigenetisk hukommelse 5,26. I betragtning af det enorme potentiale i iPSC-afledte luftvejs celler til modellering lungesygdomme, vil det være vigtigt at undersøge, om nationale Europass-centre udgør en optimal celletype for differentiering af iPSCs i luftvejene celler / væv. Desuden kan dette opretholdes stabilt hukommelse repræsentere chromosomale steder resistente over for omprogrammering og kandidater til sygdomstilstande af donorceller. Som protokoller til at konvertere iPSCs at proximale og distale lunge celletyper udvikles 36-38, kan disse NEC-iPSCs har en fordel i modellering luftvejssygdomme såsom astma, COPD, cystisk fibrose, og mange andre, og i at studere miljøvirkninger på lungeudvikling og homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den Pluripotente Stem Cell Facility og Konfokal Imaging Core på Cincinnati Børnehospital. Dette arbejde blev støttet af R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) og 2U19AI70235 (GKKH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocol Step 1.1. |
| BEGM | Lonza | CC-3170 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocol Step 4.a. |
| cytosoft cytology brush | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocol Step 1.2. |
| trypan blue | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocol Step 2.1. |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocol Step 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocol Step 2.2. |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | Protocol Step 2.2. |
| cytospin funnel | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocol Step 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | Protocol Step 2.2. |
| blank slide | Fisher Scientific | S95933 | Protocol Step 2.2. |
| hema 3 stain kit | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocol Step 2.2. |
| Bovine Dermal Colagen, type 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocol Step 3.2. |
| T25 flask | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocol Step 3.3. |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | Protocol Step 5.2. |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | Protocol Step 5.2. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocol Step 5.5. |
| Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | Protocol Step 5.5. |
| polycistonic lentivirus* | e.g. Millipore | SCR511 | Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocol Step 6.4. |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | GSC-6301G | Protocol Step 6.4. |
| hESC media | See recipe included in protocol | Protocol Step 6.11. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Protocol Step 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocol Step 6.11. |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Protocol Step 6.11. |
| hESC-qualified Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Protocol Step 6.13. |
| Corning plate, 6 well | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocol Step 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | Protocol Step 6.13. |
| 250 ml disposable filter flask (0.22 µm) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocol Step 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocol Step 7.3. |
| cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocol Step 7.4. |
| hESC Media** | Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min |
||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Final Concentration |
| KO replacement serum (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
- Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
- Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
- Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
- Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
- Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
- Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
- Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
- Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
- Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
- Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
- Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
- Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
- Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
- Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
- Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
- Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
- Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
- Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
- Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
- Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
- Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
- Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
- Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).
