Introduction
Les cellules souches pluripotentes induites à partir d'échantillons humains (hiPSCs) sont une technologie en développement rapide de la recherche sur les cellules souches. Ils offrent une alternative aux cellules souches embryonnaires (hESC) la recherche avec beaucoup moins inconvénients éthiques et morales 1,2. Bien qu'ils ne sont pas épigénétique identique à CSEh 3-5, hiPSCs offrent un moyen unique de modéliser le développement et les maladies phénotypes, et ils peuvent être dérivés de tissus pertinents à l'état de la maladie 5-8. De nouvelles méthodes de hiPSCs générant sont constamment à l'étude pour identifier les types de cellules optimales pour commencer, comme un moyen de préparer CSPi GMP qualité convenant à la transplantation, et aussi pour augmenter la rapidité et l' efficacité du processus de reprogrammation 6,9-11.
Les cellules épithéliales des voies respiratoires sont essentielles dans le développement de l' inflammation allergique 12, et l'épithélium est un moteur important de réactions allergiques et remodelage des voies aériennes par l' interaction avec immune stromales et les cellules. L'épithélium des voies respiratoires joue un rôle essentiel dans l'origine et la persistance des maladies pulmonaires telles que l'asthme. Toutefois, les cellules epitheliales des voies respiratoires inférieures sont difficiles à obtenir dans un environnement clinique, en particulier chez des patients et des enfants témoins en bonne santé. Les données de plusieurs études soutiennent l'hypothèse que les cellules épithéliales de la muqueuse nasale sont une procuration valide et pratique pour les voies respiratoires inférieures des cellules épithéliales 13-20, en particulier lors de l' étude des réponses aux polluants atmosphériques et les allergènes. La muqueuse nasale se compose de plus de 90% des cellules épithéliales des voies respiratoires ciliées et échantillonner ces cellules épithéliales nasales (PEN) peut être facilement réalisée chez les enfants aussi jeunes que quatre ou cinq ans, car elle est moins invasive que les autres / techniques d'échantillonnage des tissus cellulaires et est associé à un risque minimal d'effets indésirables tels qu'une infection 20-23. Il offre un moyen simple et rapide pour échantillonner les enfants sains et malades sans long, inutile, et souvent douloureuse procedu bronchoscopieres qui nécessitent une sédation. Des études antérieures ont montré que les sous - types de maladies liées à la sévérité de l' asthme , on peut distinguer à la fois la muqueuse nasale, ainsi que des échantillons de cellules bronchiques prélevées sur les enfants asthmatiques, et l' expression génique entre les deux types de tissus était similaire chez environ 90% des gènes non omniprésents 22 , 24. En tant que source pour CSPi, NECs offrent des avantages par rapport aux autres types de cellules fréquemment utilisées. Les fibroblastes sont souvent utilisées pour la production COPSi, mais, bien que ces cellules peuvent facilement être mises en culture à partir d'une biopsie de la peau, ce procédé nécessite généralement une anesthésie locale, une incision, et des sutures, et est associée à un risque d'infection. Par conséquent, l' obtention du consentement éclairé des patients pour ce type de biopsie peut être difficile 25. Une alternative aux fibroblastes sont des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Cependant, il peut être difficile d'obtenir suffisamment de sang pour la génération COPSi des patients pédiatriques. En outre, il existe des limitations en aval du point d'accèsplications pour les fibroblastes et les cellules sanguines iPSCs dérivés, en particulier leur capacité de différenciation de certains types cellulaires 5,26. Par conséquent, compte tenu de l'accessibilité relative et le faible risque d'effets secondaires après leur collecte, NECs représentent une source cellulaire idéal pour la génération iPSC des populations pédiatriques.
CSPi ont reçu beaucoup d'attention récemment en tant que plate-forme pour l'étude du développement humain, générant de nouveaux modèles de maladies, et comme une source potentielle de cellules pour des thérapies personnalisées. Avant tout le potentiel de cette technologie peut être réalisée, les bases moléculaires du processus de reprogrammation doivent être élucidés, mais pour l'instant ce protocole et les procédures décrites dans les élucideront les études de recherche ont porté sur l'exposition des voies respiratoires, ainsi que de fournir une plate-forme étudier les effets de la médecine personnalisée impliquant CSPi.
Le travail de collaboration de plusieurs laboratoires a conduit à la generation d'une technique efficace non seulement pour l' échantillonnage de la muqueuse nasale, mais aussi la mise en culture PEN, et la reprogrammation de ces cellules à 23 iPSCs. Cet article donne un aperçu d'un protocole d'échantillonnage optimal, la culture, et les conditions de reprogrammation.
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Protocol
Le protocole suivant suit les directives du comité des institutions d'éthique de la recherche humaine.
1. L'échantillonnage de la muqueuse nasale
NOTE: Obtenir des échantillons de sujets qui sont exempts de signes d'infection virale des voies respiratoires.
- Préparer 15 ml frais conique avant la visite des participants et ajouter 2 ml BEGM (épithéliales bronchiques Cell Growth Medium) plus 20 ul stérile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- Ouvrir la cytologie brosse juste avant de prendre l'échantillon, et être sûr de garder la brosse stérile et ne pas toucher à toutes les surfaces en dehors des surfaces nasales.
- Demandez participant à rester assis et incliner la tête vers le plafond. Demandez plus petit ou plus d'enfants agités sont assis sur leurs mains et / ou couché pour éviter swatting brosse loin.
- Visez la brosse à l'arrière du nez où le passage se rétrécit (On dirait un petit trou noir). Faites glisser la brosse vers le bas et tordre les poignets lorsque la brosse est retirée de nostril.
- Placez la brosse dans conique et plonger dans BEGM. Coupez la brosse en excès et replacer le bouchon sur le tube. NE PAS VORTEX.
NOTE: Si le participant est prêt, obtenir une deuxième brosse de la même manière, mais dans la seconde narine. L'obtention d'un brossage des deux narines se traduira par une forte probabilité que l'échantillon sera couronné de succès. L'échantillonnage de la même narine peut entraîner des saignements et ne sera probablement pas améliorer l'échantillon. - Garder les échantillons aussi près de 37 ° C que possible pendant le transport en utilisant un bécher avec de l'eau chaude.
2. Cell Count et Cytospin
- Agiter doucement le pinceau dans BEGM et prendre 10 pi de l'échantillon pour un nombre de cellules en utilisant un hématimètre. Ajouter 10 ul d'une tache en direct / morts et compter que les cellules vivre sous un microscope.
- Prendre 50 pl de l'échantillon et diluer à 200 pi avec PBS 1x. Ajouter à entonnoir Cytospin attaché à lame de verre et de spin à 300 tours par minute pendant 2 min. Laissez glisser O / N et aux taches slide sec followinles instructions du fabricant g. Laisser sécher O / N, de préférence dans l'obscurité.
- Stain Diapositive avec Hema 3 Stain
- Transférer chaque solution (Hema fixateur, bleu clair; Hema 3 Solution I, rose; Solution et Hema 3 II, bleu foncé) dans un plat de coloration; Garder couvert lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation. Insérer des diapositives dans diapositive bateau de coloration
- Tremper les lames en continu dans un fixateur pendant 30 secondes, puis laisser excès d'eau. Tremper les lames en continu dans la solution I pendant 30 secondes, puis laisser excès d'eau. Tremper les lames en continu dans la solution II pendant 30 secondes, puis laisser égoutter l'excès de
- Rincer à l'eau déminéralisée jusqu'à ce que l'eau soit claire. Laisser sécher O / N, de préférence dans l'obscurité
- Regardez glisser sous les cellules au microscope et comptage, déterminer le pourcentage de cellules épithéliales. Devrait être 90% ou plus si l'échantillonnage est bon.
3. Les cellules Seeding
REMARQUE: Effectuer toutes les opérations de culture de cellules dans une culture de tissu propre et certifiéhotte à l'aide d'une technique stérile.
- plaques de Enduire bovine collagène dermique (BDC), tapez 1. Ajouter 0,5 ml de 3 mg / ml BDC dilué dans 49,5 ml 1x PBS. Préparer moins si seulement quelques plaques seront utilisées. Enduire un flacon T25 avec 2 ml BDC et incuber dans le capot O stérile / N ou à 37 ° C pendant 2 heures, si nécessaire.
- Après incubation, aspirer tout liquide restant. Exposer des flacons à la lumière UV pendant 30 minutes dans la hotte stérile. flacons de stockage pour jusqu'à un mois à 4 ° C, mais les amener à la température ambiante ou à 37 ° C avant l'ensemencement des cellules.
- Gardez la brosse et les cellules dans BEGM à 37 ° C jusqu'au moment de semer. Doucement brosse swish intérieur conique, mais ne pas vortex.
- La plaque 7 x 10 5 cellules dans un flacon T25. S'il y a moins d'utiliser un récipient plus petit, comme un puits d'une plaque à 6 puits. Cette plaque de taille a besoin d' environ 3 x 10 5 cellules.
NOTE: S'il n'y a pas ce nombre de cellules, il est conseillé de continuer.
- La plaque 7 x 10 5 cellules dans un flacon T25. S'il y a moins d'utiliser un récipient plus petit, comme un puits d'une plaque à 6 puits. Cette plaque de taille a besoin d' environ 3 x 10 5 cellules.
- Sous une hotte stérile, prendre brosse de tube et gently tourner la brosse sur la surface du flacon revêtu, en faisant attention à ne pas rayer le revêtement. Jeter la brosse dans un récipient biohazard approprié.
- pipeter lentement les cellules restantes dans BEGM de la partie conique et dans la fiole T25. Observer les cellules au microscope. Un certain nombre de cellules flottantes sera observée et il peut y avoir quelques débris du nez, ce qui est acceptable à ce stade (figure 3A).
4. Culture cellulaire
- Après l' ensemencement des cellules, laissez - les régler pendant 48 heures sans interruption (Figure 3). Après 48 heures, lentement et doucement ajouter 2 ml au chaud BEGM et 20 ul stérile penicilin / streptomycine / Fungizone (P / S / F).
NOTE: NE PAS aspirer les originaux 2 ml de milieu. - Le 4 e jour après le semis, aspirer soigneusement tout le liquide, et le remplacer par 4 ml frais, réchauffé BEGM ainsi 1x Pen / Strep (Fungizone est plus nécessaire). Changer les médias tous les deux jours et évaluer les cellules pour joindrement, la croissance et la confluence. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, généralement en 2-3 semaines, ils sont prêts à être repiquées.
- Un flacon T25 (environ 2,5 x 10 6 cellules lorsqu'elles sont confluentes) peut être repiqué dans trois flacons T25 ou d' un flacon T75. Après le premier passage, les cellules doivent être robustes et en bonne santé, d'atteindre la confluence environ tous les trois jours.
5. Cellules de repiquage
- Aspirer doucement les médias de la plaque. Ajouter 1 ml de solution à 0,05% de trypsine par flacon T25 à la plaque et placer dans l'incubateur pendant environ 4min, ou jusqu'à ce que les cellules se détachent de la plaque. Vérifiez le niveau du détachement des cellules toutes les 2 min et ne pas laisser la trypsine sur plus de 10 min.
- Ajouter 5 ml de trypsine Neutralisation Solution (TNS), ou un support contenant du sérum à neutraliser l'enzyme. Retirer tout le liquide et les cellules du ballon et le placer dans un tube conique de 15 ml.
- Centrifuger à 200 x g (accélération décélération 0 0) pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire. Aspirer supernacellules et tantes resuspendre dans BEGM + P / S dans le volume requis pour les nouveaux flacons (4 ml pour un flacon T25, 10 ml pour un flacon T75)
- Effectuer le nombre de cellules avec une tache en direct / morts comme décrit ci-dessus (2.1). Ajouter la quantité appropriée de BEGM et des cellules dans les flacons revêtus et revenir à l'incubateur. Maintenir comme détaillé ci - dessus ou de cryoconservation dans un milieu de congélation (70% BEGM, 20% de FBS et 10% de DMSO) à une concentration de 0,5-2 x 10 6 cellules par ml.
6. Reprogrammation à CSPi
NOTE: Avant de générer CSPi, assurer le respect de tous les règlements institutionnels régissant la production et l'utilisation des CSPi humaines. une technique stérile est particulièrement important pour les cultures COPSI comme milieu de culture ne contient pas systématiquement des antibiotiques. Il est essentiel que les CNE semblent en bonne santé et sont solidement proliférative pour la reprogrammation réussie.
- Planche 5 x 10 5 PEN par puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits. Après 24 h, ajouter polybrèneà BEGM à une concentration finale de 8 pg / ml et transduction NECs en ajoutant des particules lentiviraux exprimant Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc aux médias. But de parvenir à une multiplicité d'infection (MOI) de ~ 5 27.
- Pour la détermination de la MOI, préparer des dilutions en série du stock concentrée-lentivirus et la transduction des cellules HT1080 avec ces dilutions. Après la première détection de l'expression sans équivoque dTomato dans les cellules HT1080, calculer le nombre d ' "unités de transduction / ml» en marquant le nombre de dTomato positif cellules / petits amas de cellules dans chaque dilution.
NOTE: En règle générale, il y aura des dilutions qui sont trop élevés (tout est dTomato positif) et trop faible (aucun ou seulement un couple de cellules positives). - Effectuer la notation des dilutions dans lesquelles des cellules positives discrètes / petits amas de cellules est identifiée. Déterminer le titre en corrigeant le nombre de transduire unités / ml avec le facteur de dilution approprié. MOI est alors le rapport entre le nombredes cellules transduites au nombre de particules virales 27.
NOTE: Chaque dTomato cellulaire positive / petit bouquet est supposé provenir d'une seule particule virale.
- Pour la détermination de la MOI, préparer des dilutions en série du stock concentrée-lentivirus et la transduction des cellules HT1080 avec ces dilutions. Après la première détection de l'expression sans équivoque dTomato dans les cellules HT1080, calculer le nombre d ' "unités de transduction / ml» en marquant le nombre de dTomato positif cellules / petits amas de cellules dans chaque dilution.
- Environ 3 heures après la transduction, retirer les médias et les remplacer avec des produits frais BEGM. Jeter les médias lentivirus contenant en utilisant des procédures institutionnellement approuvés. Retour NECs transduites à l'incubateur pendant 3 jours.
- Le jour 3, remplacer les médias avec des produits frais BEGM, puis incuber pendant 3 jours. Aspirer passé médias, laver les cellules avec PBS 1x et ajouter une solution de trypsine 1 ml de 0,05% dans le puits. cellules Passage avec trypsine comme écrit ci-dessus (section 5). Aspirer délicatement les cellules surnageant et remettre en suspension dans 4 ml BEGM + P / S. Les cellules peuvent être repiquées à un nouveau puits d'une plaque à 6 puits revêtu de BDC, ou ajoutés aux cultures du MEF, il est prêt (voir l'étape suivante).
- Préparer des plaques revêtues MEF. Le jour 4 ajouter une solution de gélatine à 0,1% (1 ml / puits) pour 2 puits d'une 6 (pour effectuer +/- Thiazovivin (SPT) voir l'étape 6.6). Sur la prochainejour, décongeler un flacon de MEFs inactivés 28.
- Placez MEFs dans 10 ml de milieu MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% de SFD). Spin à 200 xg pendant 5 min à sédimenter. Resuspendre dans les médias MEF. Aspirer la gélatine de la plaque de 6 puits et ajouter 1,87 x 10 5 MEFs par puits de la plaque 6 et la gélatine à revêtement. Incuber O / N à 37 ° C ou pendant un minimum de 24 heures.
- Transférer 2 ml de BEGM contenant des cellules transduites par puits dans 2 puits d'une plaque à 6 puits revêtus précédemment et incuber O / N. Le jour suivant, remplacer BEGM avec 2,5 ml par puits de milieu standard contenant hESC 4 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes. Nourrir les cellules avec les médias CSEh frais +/- SPT par jour pendant 10 jours
NOTE: Il est possible d'ajouter un cocktail de petites molécules (SB431542, PD0325901 et Thiazovivin (SPT) cocktail) pour améliorer l'efficacité et la cinétique de reprogrammation pour NECs 23. - Après dix jours, continuer à nourrir tous les jours en utilisant les CSEh médias sans SPT. Nourrissez cultures tous les jours jusqu'à colonies de CSEh-likeapparaît (figure 5A, P0 colonie). Identifier les colonies hébergeant CSPi putatifs par leur haute noyau: rapport cytoplasmique et nucléoles proéminents.
- Manuelle accise et de transfert des colonies avec des CSEh-morphologie pour séparer les puits pour la culture et l'expansion des lignes distinctes dans un système sans alimentation. colonies excisées doivent adapter rapidement à ces conditions.
- Après que les colonies de placage excisé ces lignes iPSC putatifs discrètes sont maintenant considérés comme passage 1 (P1). cultures d'alimentation quotidienne avec mTeSR1. Passage et d'étendre les lignes iPSC en utilisant des procédures standard. Il peut prendre plusieurs jours à une semaine pour les colonies de p1 pour atteindre la taille à laquelle ils doivent être repiquées.
7. Maintenir CSPi en culture
- Flux et évaluer les cultures quotidienne. Manuellement les zones accises présentant une différenciation manifeste en grattant avec une pipette en verre stérile ou micro pointe de la pipette. Changer les médias après la cueillette quotidienne.
- cellules Passage après approximationdiatement tous les quatre jours: Gently médias aspirés, ajouter 1 ml de dispase chaud (1 mg / ml) par puits d'une plaque à 6 puits (la moitié du volume d'alimentation), puis incuber à 37 ° C pendant environ 4 min. Les bords des colonies vont commencer à soulever, qui ressemble à un contour blanc autour de la colonie. Aspirer doucement le dispase et laver 3x avec réchauffé DMEM / F12.
- Ajouter 2 ml mTeSR1 et utiliser un lève-cellule pour soulever les colonies de la plaque. Utilisez 5 ml de pipettes sérologiques ou P1000 micropipette à triturer doucement les cellules jusqu'à ce que les colonies sont divisés en petits groupes.
- Évitez la production de très petites grappes ou des cellules isolées, comme la survie et la prolifération subséquente sera sous-optimale. Lorsque les colonies re-placage, 1: 4 à 1: 6 scission maintiendra la densité de la colonie optimale. Retirez délicatement les colonies et les médias de la plaque et ajouter de nouveaux puits de matrigel revêtu.
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Representative Results
La première partie du nez, appelé le vestibule nasal, est la zone entourée par le cartilage 29. La brosse doit aller en douceur passée cette zone du nez, au - delà de la valve nasale (ostium internum, ou le «trou noir» vu à l'arrière de la narine), et l'échantillon est obtenu à partir du cornet inférieur (Figure 1). Les fosses nasales sont des structures osseuses qui augmentent la surface du nez 29, ce qui les rend un endroit idéal pour l' échantillonnage. La région est également bordée par le tissu de la muqueuse vascularisé, qui ressemble de près les parois des voies respiratoires inférieures et est également actif dans la réponse immunitaire à des expositions environnementales.
L'échantillonnage du tissu correct assure que les cellules qui sont reprogrammées sont des cellules épithéliales. Ceci peut être évaluée par le nombre de cellules initiales et Cytospin, mais aussi en observant les cellules en culture. leCytospin, une fois centrifugé, séché et coloré, montre la composition de l'échantillon. La plupart des échantillons sont constitués de cellules épithéliales, qui sont colonnaire et ciliées, avec un noyau rond. Avec le kit Hema 3 taches, ils tachent une couleur bleu clair avec un noyau violet foncé (Figure 2), et souvent lorsqu'ils sont pris directement à partir du nez , ils sont vus agglutinées. Bien que les échantillons de cellules nasales sont d' abord un mélange de types de cellules, ainsi que les débris du nez, avec le temps dans la culture et les changements dans les médias, les cellules épithéliales deviennent prédominantes (figure 3A, B). Lorsque les cellules épithéliales se développent à la confluence, elles sont en forme comme un œuf fraîchement concassé, où le noyau est grand et situé dans le centre et le cytoplasme est une sorte de "tendre la main" et d' étirement que la cellule se prépare à diviser (figure 3B). Comme les cellules se développent ensemble, ils commencent à prendre plus d'une forme de football, et emboîter parfaitement dans le plat (Figure3C).
Une fois que les cellules sont transduites, ils vont exprimer le tdTomato marqueur fluorescent dans le noyau. La figure 4 montre les cellules une fois qu'elles ont été transduite, dans le champ lumineux, la fluorescence et les images fusionnées avec les deux. Non chaque cellule exprime le marqueur, et donc pas toutes les cellules a été transduite, mais chaque puits devrait avoir environ 90 pour cent l'efficacité de transduction, et cela augmentera la probabilité que certaines cellules atteindront pluripotence après avoir été plaqué sur MEF.
Une fois co-cultivées avec des cellules MEF et que commencent à former des colonies, ils cesseront progressivement exprimer tdTomato. Cependant, ce ne sont pas la meilleure indication de la formation de colonies. La meilleure indication de la formation de colonies est une confirmation visuelle. colonies de CSEh, qui sont le «gold standard» de la pluripotence, sont pour la plupart ronde et sont composés de nombreuses petites cellules rondes avec largnoyaux e et un haut noyau ratio cytoplasme. Chaque cellule apparaît surtout composée des noyaux, et d'autres organites ne sont pas clairement visibles. Après la récolte de colonies iPSC, et la culture dans des conditions exemptes d'alimentation standard, les colonies iPSC nouvellement formés devraient ressemblent beaucoup à leurs homologues de CSEh, et les cellules individuelles sont presque identiques au phénotype CSEh, comme on le voit sur la figure 5B.
Avant CSPi utilisant générées à partir de cellules épithéliales nasales (NEC-CISP) dans des expériences, il est conseillé d'évaluer la qualité des nouvelles lignes. Cela implique généralement l'évaluation du caryotype, l'expression des marqueurs de la pluripotence et la capacité de se différencier en iPSCs chacune des 3 couches germinales embryonnaires (endoderme, du mésoderme et de l'ectoderme). Capacité de différenciation peut être testée à bien des égards, mais actuellement, le test le plus rigoureux est le dosage de tératome 2,23,30. tests plus complets tels que la transcription et le profilage épigénomique sont utiles pour déterminer si des anomalies chromosomiques sont introduits en reprogrammant 23.
Figure 1. turbiné Inferior. Mouvement d'échantillonnage et la cible d'échantillonnage, le cornet inférieur, est indiqué par la flèche noire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Cytospin. La plupart de l'échantillon est composé de cellules épithéliales, qui sont longues et de colonne, avec des cils à une extrémité et un noyau rond à l'autre. Ils sont souvent agglutinés quand échantillonné directement à partir du narine. Les flèches indiquent les cellules epitheliales individuelles.cible "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les cellules primaires épithéliales nasales dans la culture. (A) cellules flottantes et les débris juste après l' échantillon est recueilli et plaqué. (B) Les cellules un jour après avoir été repiquées. La morphologie cellulaire est cohérente et la culture se compose principalement de cellules épithéliales nasales, grossissement 10X, et (C) 5X grossissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Transduction de NECs. Cellules étant transduites ont pris le vecteur et montrer le rouge marqueur de fluorescence tdTomato. Ce marqueur devrait disparaître à mesure qu'ils progressent vers un état pluripotent. (A) de l' image lumineuse du champ de cellules transduites. (B) de l' image fluorescente des cellules transduites. (C) Superposition de champ lumineux et des images fluorescentes (panneaux A et B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. iPSC souches colonies de cellules-like. (A) croissante sur MEF, colonie est principalement ronde sur les bords et montre peu ou pas de différenciation. (B) Les cellules individuelles montrent la morphologie des CSEh comme typique, avec de petites cellules rondes avec de grands noyaux.5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cellules épithéliales nasales (NEC) sont une plate - forme accessible pour l' étude des maladies des voies respiratoires, et NEC-CSPi offrent une avenue intéressante à explorer le développement de la maladie, le traitement et la thérapie 1,31,32. NECs peut facilement être obtenue sans procédures nuisibles stressantes ou potentiellement 6,23. Dans notre expérience, l'échantillonnage de la muqueuse nasale, comme décrit dans ce protocole semble être moins stressant et mieux perçu que la collecte de sang pour les enfants. Par conséquent, cette méthode peut être particulièrement utile dans les populations pédiatriques et aux patients pertinents pour l'étude des maladies des voies respiratoires. L'autre avantage de la CNE est qu'une fois qu'ils sont dans la culture, les cellules épithéliales sont sélectionnés pour les médias et l'état de la culture et de devenir homogène. Ceci est avantageux que d'utiliser un tissu complexe, comme les cellules sanguines et il est plus facile d'évaluer l'impact de l'origine des cellules dans résultant lignes iPSC en utilisant des approches transcriptomiques et épigénétiques.
Quandl' échantillonnage de la muqueuse nasale, il est important que la zone correcte du nez est prélevé de telle sorte que la plupart des cellules épithéliales sont récupérées, comme le montre en regardant la Cytospin au microscope (Figure 2). Un échantillonnage correct donnera ≥90% de cellules épithéliales. Il est essentiel pour obtenir des échantillons provenant de patients sains, et de veiller à ce que l'échantillon est prélevé de façon appropriée afin de maximiser le nombre de cellules obtenues et plaqué. Le mouvement de torsion décrit dans le protocole (section 1.5) veille à ce que la brosse entre en contact avec autant de la surface nasale possible. Il est un réflexe naturel de tourner la tête quand un objet étranger se dirige vers son visage. Par conséquent, dans le cas où un enfant tourne sa tête ou se détache, il est essentiel que l'échantillonnage se produit rapidement et avec précision. L'utilisation de ces techniques permettra d'accroître l'efficacité de toutes les autres étapes du protocole, et de déterminer la probabilité d'une reprogrammation réussie. Demander à l'enfantde se coucher, et même de placer leurs mains sous eux ou ont un parent ou un frère détiennent leurs mains est un bon moyen de les encourager à rester immobile et pour aider à garantir un prélèvement d'échantillons lisse et indolore.
Récemment, quelques autres techniques d'échantillonnage ont été évalués pour le confort, la facilité et exemples de résultats, en fonction du contenu de la cellule et de la composition ainsi que l' ARN et l' ADN donne 33. Le groupe a examiné l'échantillonnage avec une brosse de cytologie par rapport à un tampon de polyester, et ils échantillonné à la fois le cornet inférieur, ainsi que les narines en tourbillonnant vigoureusement la brosse ou un tampon autour des narines. Échantillonner le cornet inférieur au pinceau se révèle être un peu inconfortable, même si elle a d'obtenir les meilleurs rendements en ARN et est composée de cellules epitheliales ciliées plus, par rapport à un tampon de polyester. La méthode proposée dans ce protocole est donc vérifiée comme la méthode la plus fiable de l'échantillonnage des épithéliums nasaux comme un moyen d'étudier les voies aériennes respiratoiresépithélium.
Une fois que l'échantillon est obtenu, il doit être conservé à 37 ° C. Une des façons les plus efficaces consiste à réchauffer un bécher d'eau à plus de 37 ° C et se blottir dans un récipient en polystyrène pour le transport en toute sécurité tout en se préparant à rencontrer le participant. Juste avant que l'échantillon est recueilli, ajouter de l'eau fraîche de sorte que la température est portée à environ 37 ° C, et ajouter le tube conique avec les médias. Lorsque la brosse est ajouté au tube conique, retourner immédiatement le tube dans le bain d'eau et de l'y maintenir jusqu'à ce qu'il puisse être retourné au laboratoire, à quel point le tube doit être placé dans un bain d'eau à 37 ° régulée jusqu'à ce que les cellules sont ensemencés sur un flacon de culture. À tous les points, une technique stérile doit être utilisée pour éviter l'introduction d'agents étrangers dans la culture.
Une quantité considérable de variabilité entre les échantillons a été observée lorsque les cellules ont été mises en culture. Cette variabilité semblait provenir à la fois la source des donateurs ainsi quela qualité de l'échantillon lui-même. Une façon d'augmenter la qualité de l'échantillon est d'obtenir une brosse de chaque narine, ou deux brosses par participant. Après l'ensemencement de l'échantillon frais, et que les cellules sont repiquées, l'état des cellules doit être surveillé régulièrement pour être sûr qu'ils sont aptes à être reprogrammée. Les cellules qui font les meilleurs candidats pour sont ceux qui prennent à la culture et prolifèrent rapidement. On ne sait pas pourquoi les cellules de certains bailleurs de fonds sont plus robustes que ceux des autres cellules, mais elle peut être due à des facteurs tels que l'âge, la taille du nez et de la santé du donneur au moment de l'échantillonnage. Lorsqu'un échantillon donne très peu de cellules, ou seulement un petit nombre de cellules étalées attach une fois, l'échantillon est peu susceptible de croître jusqu'à la confluence. Si une culture mal fait atteindre la confluence, les cellules ont tendance à être faible et de nombreuses cellules meurent pendant repiquage. Ce type d'échantillon est un candidat très pauvre pour la reprogrammation, car il est essentiel que les cellules soient prolifération rapide et robuste, et qu'ils sonttransduction au numéro plus tôt de passage possible. Il est déconseillé pour transfecter des cellules qui se développent lentement, si cela est dû à la variabilité des donateurs, un mauvais échantillonnage, ou de cultures de repiquage trop mince. Si la reprogrammation est tentée avec une culture de cellules pauvres, il est peu probable de procéder à terme.
La préparation des cellules pour la transduction est une partie du protocole qui est le plus difficile à préparer. Sur la base de la croissance des cellules, 2 x 10 5 à 5 x 10 5 cellules sont suggérées pour la transduction et cela peut dépendante des échantillons de patients spécifiques. Par conséquent, il peut exiger quelques puits plaqués avec différents nombres de cellules pour obtenir le nombre idéal.
Ce protocole décrit non seulement la facilité d'échantillonnage, mais aussi la relative facilité et les délais d'établissement des cultures de cellules primaires, et la reprogrammation ultérieure de ces cultures de cellules primaires à des lignes iPSC pour les opportunités de recherche plus durables et les plus polyvalents. L'ensembleprocessus de clinique à l' établissement de CSPi discrètes dans la culture prend environ 3 mois, et de nouvelles méthodes pour réduire les temps de reprogrammation sont développées 6,34,35. Ce champ est en évolution rapide de trouver des moyens plus efficaces et plus complets pour convertir des cellules primaires à CSPi, et de se différencier ensuite CSPi dans les types de cellules et de tissus spécifiques d'intérêt. Cependant, les protocoles de différenciation des tissus importants pour les maladies des voies respiratoires, telles que l'épithélium du poumon, sont encore en cours d' élaboration 36-38.
Génération CSPi de NECs a l'avantage d'isolement simple et relativement indolore de cellules. En outre, il est possible que NEC-iPSCs offrent des avantages par rapport iPSCs provenant d'autres types de tissus qui peuvent être exploitées. L'impact de l'épigénétique iPSC sur la différenciation iPSC suivante ne soit pas complètement compris, bien que la preuve indique que la souris et humaines CSPi abritent la mémoire transcriptionnelle et épigénétique de leur cellule somatiqueorigine et que cela favorise sélectivement leur différenciation en lignées associées au type de cellules du donneur tout en limitant les autres destins 5,26. En raison de l'importance du tissu d'origine, et comment cela influence les propriétés fonctionnelles des CSPi, en particulier par rapport à la rétention des marques épigénétiques 39-45 spécifiques des tissus, des lignes iPSC doivent être plus clairement étudiée afin de mieux comprendre la impact du tissu d'origine. Il a été montré précédemment que iPSCs NEC dérivés abritent une signature de méthylation génomique indiquant le maintien d'une mémoire épigénétique de leur tissu d'origine 23. Cette mémoire épigénétique retenue dans NEC-CSPi peut être bénéfique dans la différenciation des cellules souches pluripotentes en cellules des voies respiratoires, comme des études antérieures ont montré que les CSPi cellules sanguines dérivées présentant la mémoire épigénétique des cellules sanguines d'origine sont plus facilement différenciées en cellules de sang de fibroblaste ou CSPi dérivées du muscle lisse manquant blood-cellule spécifique mémoire épigénétique de 5,26. Compte tenu de l'énorme potentiel des cellules des voies respiratoires iPSC dérivées pour les maladies modélisation du poumon, il sera important d'étudier si les CNE représentent un type de cellule optimale pour la différenciation des CSPi dans les voies respiratoires des cellules / tissus. En outre, cette mémoire maintenue de manière stable peut représenter des emplacements chromosomiques résistants à la reprogrammation et des candidats aux états pathologiques des cellules du donneur. Comme les protocoles pour convertir CSPi à proximal et types de cellules pulmonaires distales sont développées 36-38, ces NEC-CSPi peut avoir un avantage dans les maladies modélisation des voies respiratoires telles que l' asthme, la MPOC, la fibrose kystique, et beaucoup d' autres et à l' étude des effets environnementaux sur le développement du poumon et l'homéostasie.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le pluripotentes Facility de cellules souches et l'imagerie confocale de base à l'Hôpital pour enfants de Cincinnati. Ce travail a été soutenu par R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) et 2U19AI70235 (GKKH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocol Step 1.1. |
| BEGM | Lonza | CC-3170 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocol Step 4.a. |
| cytosoft cytology brush | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocol Step 1.2. |
| trypan blue | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocol Step 2.1. |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocol Step 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocol Step 2.2. |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | Protocol Step 2.2. |
| cytospin funnel | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocol Step 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | Protocol Step 2.2. |
| blank slide | Fisher Scientific | S95933 | Protocol Step 2.2. |
| hema 3 stain kit | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocol Step 2.2. |
| Bovine Dermal Colagen, type 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocol Step 3.2. |
| T25 flask | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocol Step 3.3. |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | Protocol Step 5.2. |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | Protocol Step 5.2. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocol Step 5.5. |
| Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | Protocol Step 5.5. |
| polycistonic lentivirus* | e.g. Millipore | SCR511 | Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocol Step 6.4. |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | GSC-6301G | Protocol Step 6.4. |
| hESC media | See recipe included in protocol | Protocol Step 6.11. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Protocol Step 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocol Step 6.11. |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Protocol Step 6.11. |
| hESC-qualified Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Protocol Step 6.13. |
| Corning plate, 6 well | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocol Step 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | Protocol Step 6.13. |
| 250 ml disposable filter flask (0.22 µm) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocol Step 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocol Step 7.3. |
| cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocol Step 7.4. |
| hESC Media** | Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min |
||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Final Concentration |
| KO replacement serum (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
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