Introduction
Geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke monsters (hiPSCs) zijn een snel ontwikkelende technologie van stamcelonderzoek. Ze bieden een alternatief voor embryonale stamcellen (hESC) onderzoek met veel minder ethische en morele bezwaren 1,2. Hoewel ze niet epigenetisch identiek hESCs 3-5, hiPSCs bieden een unieke manier om ontwikkeling en ziekte fenotypes modelleren, en ze kunnen worden afgeleid van weefsels naar de ziektetoestand 5-8 relevant. Nieuwe methoden voor het genereren hiPSCs worden voortdurend onderzocht om optimale celtypen te beginnen identificeren als een manier om GMP-kwaliteit iPSCs geschikt voor transplantatie te bereiden, en om de tijdigheid en efficiëntie van de herprogrammeringsproces 6,9-11 verhogen.
Epitheelcellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van allergische ontsteking 12 en het epitheel is een belangrijke oorzaak van allergische reacties en luchtwegremodellering door interactie met immune en stromale cellen. Het luchtwegepitheel speelt een essentiële rol bij het ontstaan en voortduren van longziekten zoals astma. De geringere epitheelcellen moeilijk te verkrijgen in een klinische omgeving, vooral van gezonde controle patiënten en kinderen. Gegevens uit verschillende studies ondersteunen de vooronderstelling dat epitheliale cellen van het neusslijmvlies zijn van een geldig en praktische proxy voor de lagere luchtwegen epitheelcellen 13-20, in het bijzonder bij het bestuderen van de reacties op luchtverontreinigende stoffen en allergenen. Het neusslijmvlies bestaat uit meer dan 90% haartjes bedekte epitheelcellen en bemonstering deze nasale epitheelcellen (NEM) kan gemakkelijk worden uitgevoerd bij kinderen vanaf de leeftijd van vier of vijf, omdat die minder invasief dan andere cellen / weefsels bemonsteringstechnieken en geassocieerd met een minimale kans op bijwerkingen zoals een infectie 20-23. Het biedt een snelle en eenvoudige manier om zowel gezonde als zieke kinderen zonder lange, onnodige en vaak pijnlijke bronchoscopie procedu proevenres die sedatie noodzakelijk. Eerdere studies hebben aangetoond dat ziekte subtypes in verband met de ernst van astma kan worden onderscheiden in zowel de nasale mucosa en bronchiale cellen monsters van astmatische kinderen en genexpressie tussen de twee weefseltypen was vergelijkbaar in ongeveer 90% van de niet-ubiquitous genen 22 , 24. Als bron voor iPSCs, NEC's bieden voordelen ten opzichte van andere vaak gebruikt celtypen. Fibroblasten worden vaak gebruikt voor iPSC generatie, maar hoewel deze cellen gemakkelijk gekweekt uit een huidbiopsie kan dit proces vereist gewoonlijk plaatselijke verdoving, een incisie, en hechtdraden, en is geassocieerd met een risico op infectie. Derhalve verkrijgen geïnformeerde toestemming van patiënten voor dit type biopsie kan lastig 25 worden. Een alternatief voor fibroblasten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het kan echter moeilijk zijn om voldoende bloed iPSC generatie verkrijgen bij pediatrische patiënten. Daarnaast zijn er beperkingen van stroomafwaartse appassingen voor fibroblast en bloed cel afkomstige iPSCs, met name hun differentiatie capaciteit om bepaalde celtypen 5,26. Daarom, gezien de relatieve bereikbaarheid en de lage risico op bijwerkingen na hun collectie, NEC's vormen een ideale mobiele bron voor iPSC generatie van pediatrische populaties.
iPSCs hebben veel aandacht kreeg onlangs als een platform voor de studie van de menselijke ontwikkeling, het genereren van nieuwe ziekte-modellen, en als een potentiële bron van cellen voor gepersonaliseerde behandelingen. Voordat u het volledige potentieel van deze technologie kan worden gerealiseerd, de moleculaire onderbouwing van de herprogrammering proces moeten worden opgehelderd, maar voor nu dit protocol en de binnen geschetste procedures zullen de onderzoeken gericht op risico's van de luchtwegen toe te lichten, evenals een platform voor het bestuderen van de effecten van de gepersonaliseerde geneeskunde waarbij iPSCs.
De gezamelijke werk van verschillende labs heeft geleid tot de generation een succesvolle techniek voor niet uitsluitend bemonsteringen het neusslijmvlies, maar ook kweken NEM en herprogrammering van deze cellen iPSCs 23. Dit artikel geeft een overzicht van een protocol voor een optimale bemonstering, kweken en herprogrammering omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol volgt de richtlijnen van de instellingen menselijk onderzoek ethische commissie.
1. Sampling het neusslijmvlies
OPMERKING: Zorg monsters van patiënten die vrij zijn van symptomen van de luchtwegen virale infectie.
- Bereid een 15 ml conische verse voordat de deelnemer bezoek en voeg 2 ml BEGM (bronchiale epitheelcellen Growth Medium) plus 20 ul steriel Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- Open cytologie borstel net voor het nemen van het monster, en zorg ervoor dat borstel steriel te houden en het niet aanraken om elk oppervlak naast de nasale oppervlakken.
- Vraag deelnemer om stil te zitten en tilt hoofd omhoog naar het plafond. Hebben kleinere of meer onrustige kinderen zitten op hun handen en / of liggen om te voorkomen swatting borstel weg.
- Richt borstel aan de achterkant van de neus, waar de doorgang vernauwt (Ziet eruit als een klein zwart gat). Schuif borstel naar beneden en draai de polsen als de borstel nostri wordt verwijderdl.
- Plaats de borstel in conische en dompel in BEGM. Snijd overtollig borstel en dop te vervangen op de buis. NIET VORTEX.
LET OP: Als de deelnemer bereid is, het verkrijgen van een tweede borstel op dezelfde manier, maar in de tweede neusgat. Het verkrijgen van een poetsen van beide neusgaten leidt tot een grotere kans dat de bemonstering succesvol zal zijn. Bemonstering van hetzelfde neusgat kan leiden tot bloeden en zal waarschijnlijk niet verbeteren van het monster. - Houd monsters zo dicht mogelijk bij 37 ° C mogelijk tijdens transport met een bekerglas met warm water.
2. celgetal en Cytospin
- Schud voorzichtig de borstel in BEGM en neem 10 ul van het monster voor een telling cel met behulp van een hemacytometer. Voeg 10 ul van een levende / dode vlek tellen alleen levende cellen onder een microscoop.
- Neem 50 pi van het monster en verdun tot 200 gl met 1x PBS. Naar cytospin trechter bevestigd aan glasplaatje en centrifugeren bij 300 rpm gedurende 2 min. Laat schuif droge O / N en vlek dia followininstructies g fabrikant. Laat O / N drogen, bij voorkeur in het donker.
- Vlek Slide met Hema 3 Stain
- Transfer elke oplossing (Hema fixatief, lichtblauw, Hema 3 Solution I, roze en Hema 3 Solution II, diep blauw) in een kleuring schotel; Houd bedekt wanneer niet in gebruik. Plaats dia's in slide kleuring boot
- Dip dia's voortdurend in fixatief gedurende 30 seconden, dan laat overtollige uitlekken. Dip dia's continu in oplossing I gedurende 30 seconden, dan laat overtollige uitlekken. Dip dia's continu in oplossing II voor 30 sec, dan laat overtollige uitlekken
- Spoelen met gedemineraliseerd water tot het water helder is. Laten drogen O / N bij voorkeur in het donker
- Kijk naar dia onder de microscoop en tellen cellen te bepalen percentage van de epitheelcellen. Zou moeten zijn 90% of meer indien de monsterneming is goed.
3. Seeding Cellen
OPMERKING: Voer alle celcultuur procedures op de juiste en gecertificeerde weefselkweekkap met behulp van steriele techniek.
- Coat platen met Bovine Collagen Dermaal (BDC), het type 1. Voeg 0,5 ml van 3 mg / ml BDC verdund in 49,5 ml 1x PBS. Bereid minder als slechts een enkele plaat worden gebruikt. Coat een T25 kolf met 2 ml BDC en incubeer in steriele kap O / N of bij 37 ° C gedurende 2 uur, indien nodig.
- Na incubatie zuig resterende vloeistof. Expose kolven aan UV-licht voor 30min in steriele kap. Store kolven voor maximaal een maand bij 4 ° C, maar breng ze naar kamertemperatuur of 37 ° C voor het zaaien cellen.
- Houd borstel en cellen in BEGM bij 37 ° C tot klaar aan zaad. Voorzichtig swish borstel binnen conisch, maar niet vortex.
- Plaat 7 x 10 5 cellen in een T25 fles. Als er minder, een kleinere houder, zoals een putje van een 6-wells plaat. Deze omvang plaat vereist ongeveer 3 x 10 5 cellen.
LET OP: Als er niet zoveel cellen, is het niet raadzaam om verder te gaan.
- Plaat 7 x 10 5 cellen in een T25 fles. Als er minder, een kleinere houder, zoals een putje van een 6-wells plaat. Deze omvang plaat vereist ongeveer 3 x 10 5 cellen.
- Onder een steriele kap, neem borstel uit de buis en gently roteren borstel op het oppervlak van de gecoate fles, zorg dat u de coating niet bekrast. Gooi penseel in een geschikte biohazard container.
- Langzaam pipet de resterende cellen in BEGM uit de conische en in de T25 fles. Houd u aan de cellen onder de microscoop. Een aantal drijvende cellen worden waargenomen en kan er enige vuil van de neus, die in dit stadium (figuur 3A) aanvaardbaar zijn.
4. Cell Culture
- Na het zaaien cellen, laat ze genoegen nemen met 48 uur zonder onderbreking (figuur 3). Na 48 uur, langzaam en voorzichtig voeg 2 ml warm BEGM en 20 ul steriel penicilline / streptomycine / Fungizone (P / S / F).
LET OP: NIET zuig het oorspronkelijke 2 ml media. - Op de 4de dag na het uitzaaien, zuig zorgvuldig alle vloeibare en vervangen door 4 ml vers verwarmd BEGM plus 1x Pen / Strep (fungizone niet meer nodig). Wijzig de media om de twee dagen en cellen hechten beoordelenment, groei en samenvloeiing. Wanneer cellen te bereiken ~ 80% confluentie, meestal in 2-3 weken, zijn ze klaar om te worden gepasseerd.
- Een T25 fles (ongeveer 2,5 x 10 6 cellen wanneer confluent) kan worden gepasseerd in drie T25 flessen of een T75 kolf. Na de eerste passage, moeten de cellen robuust en gezond, tot confluentie ongeveer drie dagen.
5. Passage Cells
- Zuig het materiaal uit de plaat. Voeg 1 ml 0,05% trypsine oplossing per T25 fles aan de plaat en plaats in de incubator gedurende 4 min of totdat cellen los van de plaat. Controleer het niveau van onthechting van de cellen om de 2 min en niet verlaten trypsine op meer dan 10 min.
- Voeg 5 ml trypsine neutraliserende oplossing (TNS) of serum-bevattende media om het enzym te neutraliseren. Verwijder alle vloeistof en cellen uit de kolf en plaats in een 15 ml conische buis.
- Centrifugeer bij 200 xg (versnelling 0 deceleratie 0) gedurende 5 min een celpellet te verkrijgen. aspireren Supernatant en resuspendeer cellen in BEGM + P / S in het gebruikte volume van de nieuwe flessen (4 ml voor een T25 kolf 10 ml van een T75 kolf)
- Voer celgetal met een live / dode vlek zoals hierboven (2.1) beschreven. Voeg juiste hoeveelheid BEGM en cellen voor de beklede kolven en terug naar de incubator. Handhaaf gedetailleerde boven of worden ingevroren in invriesmedium (70% BEGM, 20% FBS en 10% DMSO) bij een concentratie van 0,5-2 x 10 6 cellen per ml.
6. herprogrammeren om iPSCs
LET OP: Voor het genereren van iPSCs, zorgen voor naleving van alle institutionele regels voor de productie en het gebruik van menselijke iPSCs. Steriele techniek is vooral belangrijk voor iPSC culturen, als kweekmedium antibiotica niet routinematig bevat. Het is cruciaal dat NEC's gezond lijken en zijn robuust proliferatieve voor een succesvolle herprogrammering.
- Plate 5 x 10 5 NEC's per putje van een 6-well weefselkweek plaat. Na 24 uur, voeg polybreenBEGM om tot een eindconcentratie van 8 ug / ml en transduceren NEM door toevoeging lentivirale deeltjes expressie Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc aan de media. Streven naar een veelvoud van infectie (MOI) te realiseren van 5 ~ 27.
- Om het bepalen van de MOI, voor te bereiden seriële verdunningen van de geconcentreerde-lentivirale voorraad en transduceren HT1080 cellen met deze verdunningen. Na eerste ondubbelzinnige detectie van dTomato expressie in HT1080 cellen, bereken het aantal "transducerende eenheden / ml" door het scoren van het aantal dTomato-positieve cellen / kleine klompjes cellen bij elke verdunning.
LET OP: Typisch, zal er verdunningen die te hoog zijn (alles is dTomato positief) en te laag is (geen of slechts een paar positieve cellen). - Voer scoren uit de verdunningen waarin discrete positieve cellen / kleine klompjes cellen geïdentificeerd. Bepaal de titer door het corrigeren van het aantal transducerende eenheden / ml met de juiste verdunningsfactor. MOI is dan de verhouding van het aantalgetransduceerde cellen om het aantal virusdeeltjes 27.
OPMERKING: Elke dTomato positieve cel / klein groepje wordt verondersteld afkomstig te zijn uit een enkel virusdeeltje.
- Om het bepalen van de MOI, voor te bereiden seriële verdunningen van de geconcentreerde-lentivirale voorraad en transduceren HT1080 cellen met deze verdunningen. Na eerste ondubbelzinnige detectie van dTomato expressie in HT1080 cellen, bereken het aantal "transducerende eenheden / ml" door het scoren van het aantal dTomato-positieve cellen / kleine klompjes cellen bij elke verdunning.
- Ongeveer 3 uur na transductie, verwijder de media en te vervangen door frisse BEGM. Gooi lentivirus-bevattende media met behulp van institutioneel-goedgekeurde procedures. Terugkeren getransduceerd NEC de incubator gedurende 3 dagen.
- Op dag 3, vervangen met verse media BEGM, en incubeer gedurende nog 3 dagen. Zuig doorgebracht media, cellen te wassen met 1x PBS en voeg 1 ml 0,05% trypsine-oplossing naar de bron. Passage cellen met trypsine zoals hierboven (hoofdstuk 5) geschreven. aspireren supernatant en resuspendeer cellen voorzichtig in 4 ml BEGM + P / S. Cellen kunnen worden gepasseerd om een nieuwe put van een 6 wells plaat bekleed met BDC, of toegevoegd aan MEF culturen, als klaar (zie volgende stap).
- Bereid MEF beklede platen. Op dag 4 voeg 0,1% gelatine-oplossing (1 ml / putje) tot 2 putjes van een 6 putjes (+/- uitvoeren Thiazovivin (SPT) zie stap 6,6). Op de volgendedag ontdooien een flacon geïnactiveerd MEFs 28.
- Plaats MEF in 10 ml van MEF media (DMEM + 1x NEAA + 10% DFC's). Spin bij 200 xg gedurende 5 minuten tot pellet. Resuspendeer in MEF media. Aspireren gelatine van 6 well plaat en voeg 1,87 x 10 5 MEF per putje van de gelatine-gecoate plaat met 6 putjes. Incubeer O / N bij 37 ° C, of gedurende ten minste 24 uur.
- Overdracht 2 ml BEGM bevattende getransduceerde cellen per putje in 2 putjes van een eerder beklede plaat met 6 putjes en incubeer O / N. Op de volgende dag vervangen BEGM met 2,5 ml per putje van standaard hESC media met 4 ng / ml basische fibroblast groeifactor. Voeden cellen met verse hESC media +/- SPT daags gedurende 10 dagen
LET OP: Het is mogelijk om een cocktail van kleine moleculen (SB431542, PD0325901 en Thiazovivin (SPT) cocktail) toe te voegen aan de efficiëntie en de kinetiek van herprogrammering voor NECs 23 te verbeteren. - Na tien dagen blijven dagelijks voeden met behulp van hESC media zonder SPT. Feed culturen dagelijks tot hESC-achtige koloniesverschijnen (Figuur 5A, P0 kolonie). Identificeer kolonies herbergen vermeende iPSCs door hun hoge kern: cytoplasma-verhouding en prominente nucleoli.
- Handmatig accijnzen en overdracht kolonies met hESC-achtige morfologie te putten scheiden voor cultuur en uitbreiding als afzonderlijke lijnen in een feeder-free-systeem. Weggesneden kolonies moet snel aan te passen aan deze voorwaarden.
- Na plating weggesneden kolonies deze discrete vermeende iPSC lijnen nu worden beschouwd passage 1 (P1). Feed culturen per dag met mTeSR1. Passage en uit te breiden iPSC lijnen met behulp van standaard procedures. Het kan enkele dagen duren om een week voor p1 kolonies op de grootte waarop ze moeten worden gepasseerd bereiken.
7. Handhaving iPSCs in Cultuur
- Voeden en culturen dagelijks te evalueren. Handmatig accijnzen gebieden tentoonstellen openlijke differentiatie door schrapen met een steriele glazen pipet of micro pipet tip. Verander media na dag plukken.
- Passage cellen na approximadellijk elke vier dagen: voorzichtig aspiraat media, voeg 1 ml warm Dispase (1 mg / ml) per putje van een 6-well plaat (half feeding volume), vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende ongeveer 4 minuten. De randen van de kolonies zal beginnen op te heffen, die eruit ziet als een wit overzicht rond de kolonie. Zuig voorzichtig het Dispase en was 3x met verwarmde DMEM / F12.
- Voeg 2 ml mTeSR1 en het gebruik van een cel lifter naar de koloniën te tillen van de plaat. Gebruik een 5 ml serologische pipet of P1000 micropipet om voorzichtig vermaal de cellen tot de kolonies worden opgesplitst in kleinere clusters.
- Voorkomen die zeer kleine clusters of enkelvoudige cellen, zoals overleving en daaropvolgende proliferatie suboptimaal zijn. Bij het opnieuw uitplaten kolonies, een 1: 4 tot 1: 6 wordt gespleten optimale kolonie dichtheid handhaven. Voorzichtig koloniën en media te verwijderen uit de plaat en toe te voegen aan nieuwe, Matrigel beklede putjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het eerste gedeelte van de neus, genaamd de nasale vestibule, is het gebied omringd door kraakbeen 29. De borstel moet soepel voorbij het gebied van de neus, buiten de nasale klep (ostium internum, of de "zwarte gat" gezien op de achterkant van de nare), en het monster wordt verkregen van de inferieure turbinate (figuur 1). De nasale turbinates zijn benige structuren die het oppervlak van de neus 29 te verhogen, waardoor ze een ideale locatie voor de bemonstering. Het gebied is ook bekleed met slijmvlies doorbloed weefsel, dat sterk lijkt op de bekleding van de onderste luchtwegen en is ook actief in de immuunrespons op milieu-risico's.
Het bemonsteren van het juiste weefsel, zodat de cellen die geprogrammeerd zijn epitheelcellen. Dit kan worden geëvalueerd door de aanvankelijke celtelling en Cytospin, maar ook door het observeren van de cellen in kweek. DeCytospin eenmaal gecentrifugeerd, gedroogd en gekleurd, toont de samenstelling van het monster. De meeste monsters bestaan uit epitheelcellen die zuil en trilharen zijn, met een ronde kern. Met HEMA 3 vlek kit, ze vlek een lichtblauwe kleur met een donker paarse kern (figuur 2), en vaak wanneer rechtstreeks uit de neus ze gezien samengeklonterd samen genomen. Hoewel nasale celmonsters aanvankelijk een mengeling van celtypen en vuil van de neus, de tijd in kweek en media verandert, de epitheliale cellen overheersen (figuur 3A, B). Wanneer epitheliale cellen groeien tot samenvloeiing, worden zij gevormd als een vers gebarsten eieren, waarbij de kern is groot en in het midden en het cytoplasma soort "bereiken" en strekken de cel zich voorbereidt om te delen (figuur 3B). Als de cellen samen te groeien, beginnen ze op meer van een voetbal vorm aan te nemen en in elkaar passen precies in de schaal (zie figuur3C).
Zodra de cellen worden getransduceerd, zullen zij tdTomato fluorescente merker in de kern tot expressie. Figuur 4 toont de cellen zodra deze zijn getransduceerd met helderveld, fluorescentie met beide beelden samengevoegd. Niet elke cel drukt de bewaker, en dus niet elke cel getransduceerd, maar elk putje zou ongeveer 90 procent transductie-efficiëntie, en dit zal de waarschijnlijkheid dat sommige cellen pluripotentie zal bereiken na uitgeplaat op MEFs verhogen.
Zodra samen gekweekt met MEF en als cellen beginnen kolonies te vormen, zullen ze geleidelijk stoppen tot expressie tdTomato. Echter, dit is niet de beste indicatie van kolonievorming. De beste indicatie van de kolonie formatie is visuele bevestiging. hESC kolonies, die de "gouden standaard" van pluripotentie zijn meestal rond en bestaan uit vele kleine ronde cellen met groe kernen en een hoge kern naar het cytoplasma verhouding. Elke cel lijkt hoofdzakelijk uit de kernen en andere organellen vaag zijn. Na iPSC kolonie oogst en cultuur in standaard feeder-vrije omstandigheden dienen pas gevormde kolonies iPSC erg lijken hun hESC tegenhangers en de individuele cellen bijna identiek aan de hESC fenotype, zoals te zien in Figuur 5B.
Alvorens gebruik te maken van iPSCs gegenereerd uit nasale epitheelcellen (NEC-iPSCs) in experimenten, is het aangeraden om de kwaliteit van de nieuwe lijnen te beoordelen. Veelal gaat het karyotype beoordeling van de expressie van pluripotentie markers, en het vermogen van iPSCs te differentiëren tot elk van de 3 embryonale kiembladen (endoderm, mesoderm en ectoderm). Differentiatievermogen kunnen worden getest op vele manieren, momenteel de meest stringente test is de test teratoma 2,23,30. Uitgebreidere testen zoals transcriptionele en epigenomisch profilering zijn nuttig om te bepalen of er chromosomale abnormaliteiten zijn geïntroduceerd door herprogrammering 23.
Figuur 1. Inferior turbinate. Sampling beweging en de bemonstering doel, de inferieure turbinate, wordt aangegeven met zwarte pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Cytospin. Het merendeel van het monster uit epitheelcellen, die lange zuilvormige zijn, met cilia aan één einde en een ronde kern aan de andere. Ze worden vaak samen samengeklonterd toen direct bemonsterd uit de nare. Pijlen geven individuele epitheelcellen."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Primaire nasale epitheelcellen in kweek. (A) drijvende cellen en resten net na monster wordt genomen en uitgeplaat. (B) cellen één dag nadat ze gepasseerd. Celmorfologie is consistent en de cultuur bestaat voornamelijk uit nasale epitheelcellen, 10x vergroting, en (C) 5X vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Transductie van NEC. Cells wordt getransduceerd de vector hebben opgenomen en tonen de rode fluorescentie marker tdTomato. Deze markering moet verdwijnen omdat ze vooruitgang in de richting van een pluripotente toestand. (A) veld beeld van getransduceerde cellen Bright. (B) Fluorescentie beeld van getransduceerde cellen. (C) Overlay van helderveld en fluorescerende beelden (panelen A en B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. iPSC stamcel-achtige kolonies. (A) Kweken op MEFs, kolonie meestal rond op de randen en vertoont weinig tot geen differentiatie. (B) van individuele cellen vertonen typisch hESC-achtige morfologie, met kleine ronde cellen met grote kernen.5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nasale epitheelcellen (NEC) zijn een toegankelijk platform voor het bestuderen van luchtwegaandoeningen en NEC-iPSCs bieden een spannende laan aan de ziekte ontwikkeling, de behandeling en therapie 1,31,32 verkennen. NEC's kunnen gemakkelijk worden verkregen zonder stress of potentieel schadelijke procedures 6,23. In onze ervaring, wordt de bemonstering van het neusslijmvlies zoals beschreven in dit protocol minder stressvol en beter ervaren dan bloedafname voor de kinderen te zijn. Daarom is deze werkwijze bijzonder bruikbaar bij pediatrische patiëntenpopulaties en relevant bestuderen luchtwegen ziekten. Het andere voordeel van de NEC's is dat als ze eenmaal in de cultuur, epitheelcellen worden geselecteerd op met media en cultuur staat en worden homogeen. Dit is voordeliger dan het gebruik van een complex weefsel zoals bloedcellen en maakt het gemakkelijker om het effect van cel oorsprong verkregen iPSC lijnen behulp transcriptoom en epigenetische mogelijkheden te evalueren.
Wanneerhet bemonsteren van het neusslijmvlies, is het belangrijk dat het juiste gebied van de neus bemonsterd draaien blijft epitheelcellen worden opgehaald, zoals blijkt uit het bekijken van de Cytospin onder een microscoop (Figuur 2). Een juiste bemonstering zal ≥90% epitheelcellen opleveren. Het is cruciaal om monsters van gezonde patiënten te verkrijgen, en te zorgen dat het monster adequaat wordt verzameld om het aantal cellen verkregen en uitgeplaat maximaliseren. De draaiende beweging in het protocol (punt 1.5) beschreven zorgt ervoor dat de borstel in contact komt met zoveel van de nasale oppervlak mogelijk. Het is een natuurlijke reflex om je hoofd te draaien als er een vreemd voorwerp is op weg naar iemands gezicht. Daarom is in het geval dat een kind wordt zijn of haar hoofd of wegtrekt, is het essentieel dat gesampled worden snel en nauwkeurig. Met behulp van deze technieken zal de efficiëntie van elke stap van het protocol te verhogen, en bepalen de waarschijnlijkheid van succesvolle herprogrammering. Het vragen van het kindom te gaan liggen, en zelfs om hun handen te plaatsen onder hen of hebben een ouder of broer of zus houden hun handen is een goede manier om ze aan te moedigen om stil te liggen en te helpen zorgen voor een soepele en pijnloze monstername.
Onlangs hebben een paar andere steekproeven geëvalueerd voor comfort, gemak, en het monster resultaten, gebaseerd op de celinhoud en de samenstelling evenals RNA en DNA oplevert 33. De groep beoordeeld bemonstering met een borstel cytologie versus een polyester wattenstaafje en ze proefden zowel de onderste turbinate en de voorste neusgaten door heftig wervelen de borstel of wattenstaafje rond de neusgaten. Bemonstering de inferieure turbinate met een borstel bleek enigszins ongemakkelijk, hoewel het op de beste opbrengsten RNA en bestond uit de trilharen epitheliale cellen, in vergelijking met een polyester doekje. De in dit protocol voorgestelde methode wordt daarom geverifieerd als de meest betrouwbare methode voor het bemonsteren van de nasale epitheel als een manier om de luchtwegen van de luchtwegen te studerenepitheel.
Zodra het monster is verkregen, moet het op 37 ° C gehouden. Een van de meest effectieve manieren is om een beker water te verwarmen tot meer dan 37 ° C en nestelen het in piepschuim container voor veilig transport tijdens de voorbereiding van de deelnemer voldoen. Net voordat het monster wordt verzameld, voeg koud water zodat de temperatuur tot ongeveer 37 ° C wordt gebracht, en voeg de conische buis met de media. Wanneer de borstel wordt toegevoegd aan de conische buis, keren de buis onmiddellijk in het waterbad en te houden tot aan het laboratorium kan worden geretourneerd, waarna de buis moet een gereguleerde 37 ° C waterbad worden genomen wanneer cellen gezaaid in een kolf. Op alle punten, moet steriele techniek worden gebruikt om te voorkomen dat de invoering van buitenlandse agenten in de cultuur.
Een aanzienlijke hoeveelheid variabiliteit tussen de monsters werd waargenomen wanneer cellen in kweek werden gezet. Deze variatie bleek te zijn veroorzaakt door zowel de donor bron ende kwaliteit van het monster zelf. Een manier om de kwaliteit van het monster te verhogen is een borstel van elk neusgat, of twee borstels per deelnemer te verkrijgen. Na het zaaien vers monster en de cellen worden gepasseerd, de toestand van de cellen moeten regelmatig worden gecontroleerd om zeker te zijn dat ze geschikt zijn om te worden geprogrammeerd. Cellen die de beste kandidaten voor te maken zijn degenen die naar de cultuur en vermenigvuldigen snel. Het is niet bekend waarom cellen van bepaalde donors zijn robuuster dan die van andere cellen, maar kan als gevolg van factoren zoals leeftijd, grootte van de neus, en de gezondheid van de donor op het moment van bemonstering. Indien een monster levert zeer weinig cellen, of slechts een klein aantal cellen eenmaal hechten geplateerd, het monster waarschijnlijk groeien tot confluentie. Als een worstelende cultuur doet bereiken samenvloeiing, de cellen hebben de neiging zwak te zijn en veel cellen sterven tijdens de passage. Dit type monster een zeer goede kandidaat voor herprogrammering, aangezien het essentieel is dat de cellen zich snel en krachtig prolifererende, en dat zijgetransduceerde op de kortst mogelijke passage nummer. Is het niet raadzaam om cellen die langzaam groeien transfecteren, of dit door donor variabiliteit slechte sampling of passages culturen te dun. Als herprogrammering wordt geprobeerd met een slechte celkweek, is het onwaarschijnlijk dat verder tot bloei.
Voorbereiding van de cellen voor transductie is een deel van het protocol dat het moeilijkst te bereiden. Op basis van de groei van de cellen, 2 x 10 5 5 x 10 5 cellen worden voorgesteld voor transductie en deze kunnen afhankelijk van specifieke patiëntenmonsters. Daarom kan het enkele putjes bekleed met variërende celaantallen het ideale aantal te verkrijgen.
Dit protocol beschrijft niet alleen het gemak van bemonstering, maar ook het relatieve gemak en termijnen van primaire cel culturen, en daaropvolgende herprogrammering van de primaire celculturen iPSC lijnen voor duurzamere en veelzijdige mogelijkheden onderzoek. De heleproces van de kliniek voor de vestiging van discrete iPSCs in cultuur duurt ongeveer 3 maanden, en nieuwe methoden voor het inkorten van herprogrammering tijden worden ontwikkeld 6,34,35. Dit gebied ontwikkelt zich snel tot een efficiëntere en volledige manieren om primaire cellen om te zetten in iPSCs, en vervolgens iPSCs in specifieke cellen en weefsels vormen van belang onderscheid te vinden. Echter, differentiatie protocollen voor weefsels belangrijk voor luchtwegaandoeningen, zoals de long epitheel, worden nog uitgewerkt 36-38.
IPSCs genereren van NEC heeft het voordeel dat eenvoudige en relatief pijnloze isolatie van cellen. Bovendien is het mogelijk dat NEC-iPSCs voordelen tegenover iPSCs afgeleid van andere weefseltypen die kunnen worden benut. De impact van iPSC epigenetica voor latere iPSC differentiatie is niet volledig begrepen, hoewel gegevens blijkt dat muizen en mensen iPSCs haven transcriptie en epigenetische herinnering aan hun somatische cel vanherkomst en dat dit selectief begunstigt hun differentiatie in geslachten in verband met de donor celtype, terwijl het beperken van andere lot 5,26. Vanwege het belang van het weefsel van oorsprong, en hoe dit invloed op de functionele eigenschappen van iPSC, met name wat betreft het behoud van weefselspecifieke epigenetische merken 39-45, iPSC lijnen moeten duidelijker worden bestudeerd om beter begrepen impact van het weefsel van herkomst. Eerder is aangetoond dat NEC-afgeleide iPSCs herbergen een genomische methylatie handtekening aangeeft behoud van een epigenetische herinnering aan hun weefsel van oorsprong 23. Dergelijke epigenetische geheugen NEC-iPSCs vastgehouden kan voordelig zijn om differentiatie van pluripotente stamcellen tot luchtwegen cellen, als eerdere studies hebben aangetoond dat bloedcellen afkomstig iPSCs vertoont epigenetische geheugen van de bloedcellen van herkomst gemakkelijker in bloedcellen gedifferentieerd dan fibroblast of gladde spier afgeleid iPSCs ontbreekt Blood cel-specifieke epigenetische geheugen 5,26. Gezien de enorme potentieel van iPSC-afgeleide luchtwegen cellen voor het modelleren longziekten, is het van belang te onderzoeken of NEM vormen een optimale celtype differentiatie van iPSC in luchtwegen cellen / weefsel. Bovendien kan deze stabiel gehandhaafd geheugen chromosomale locaties bestand tegen herprogrammering en kandidaten voor ziektetoestanden donorcellen vertegenwoordigen. Zoals protocollen iPSCs zetten in proximale en distale types longcel ontwikkeld 36-38, kunnen deze NEC-iPSCs een voordeel bij het modelleren van de luchtwegen zoals astma, COPD, cystische fibrose, en vele anderen en bestuderen milieueffecten op longontwikkeling en homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de pluripotente Stem Cell Facility en de confocale Imaging Core op Cincinnati Children's Hospital te erkennen. Dit werk werd ondersteund door R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) en 2U19AI70235 (GKKH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocol Step 1.1. |
| BEGM | Lonza | CC-3170 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocol Step 4.a. |
| cytosoft cytology brush | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocol Step 1.2. |
| trypan blue | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocol Step 2.1. |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocol Step 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocol Step 2.2. |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | Protocol Step 2.2. |
| cytospin funnel | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocol Step 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | Protocol Step 2.2. |
| blank slide | Fisher Scientific | S95933 | Protocol Step 2.2. |
| hema 3 stain kit | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocol Step 2.2. |
| Bovine Dermal Colagen, type 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocol Step 3.2. |
| T25 flask | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocol Step 3.3. |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | Protocol Step 5.2. |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | Protocol Step 5.2. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocol Step 5.5. |
| Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | Protocol Step 5.5. |
| polycistonic lentivirus* | e.g. Millipore | SCR511 | Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocol Step 6.4. |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | GSC-6301G | Protocol Step 6.4. |
| hESC media | See recipe included in protocol | Protocol Step 6.11. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Protocol Step 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocol Step 6.11. |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Protocol Step 6.11. |
| hESC-qualified Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Protocol Step 6.13. |
| Corning plate, 6 well | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocol Step 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | Protocol Step 6.13. |
| 250 ml disposable filter flask (0.22 µm) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocol Step 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocol Step 7.3. |
| cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocol Step 7.4. |
| hESC Media** | Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min |
||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Final Concentration |
| KO replacement serum (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
- Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
- Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
- Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
- Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
- Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
- Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
- Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
- Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
- Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
- Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
- Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
- Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
- Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
- Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
- Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
- Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
- Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
- Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
- Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
- Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
- Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
- Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
- Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).
