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Developmental Biology

बच्चे से खेती प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में Reprogram

Published: March 10, 2016 doi: 10.3791/53814
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1,4
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

Introduction

मानव के नमूने (hiPSCs) से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल स्टेम सेल अनुसंधान के एक तेजी से विकसित प्रौद्योगिकी रहे हैं। वे अब तक कम नैतिक और नैतिक कमियां 1,2 के साथ (hESC) भ्रूण स्टेम सेल अनुसंधान के लिए एक विकल्प प्रदान करते हैं। हालांकि वे epigenetically समान hESCs 3-5 करने के लिए नहीं कर रहे हैं, hiPSCs विकास और रोग phenotypes मॉडल करने के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करते हैं, और वे रोग राज्य 5-8 के लिए प्रासंगिक ऊतकों से निकाली जा सकती है। पैदा hiPSCs के नए तरीकों लगातार इष्टतम प्रकार की कोशिकाओं के साथ शुरू करने के लिए की पहचान करने के प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त जीएमपी गुणवत्ता IPSCs तैयार करने के लिए, और भी समयबद्धता और reprogramming प्रक्रिया 6,9-11 की दक्षता बढ़ाने के लिए एक रास्ता के रूप में पता लगाया जा रहा है।

श्वासनली उपकला कोशिकाओं एलर्जी सूजन 12 के विकास में महत्वपूर्ण हैं, और उपकला Immun के साथ बातचीत के माध्यम से एलर्जी प्रतिक्रियाओं और एयरवे remodeling के एक प्रमुख ड्राइवर हैई और stromal कोशिकाओं। एयरवे उपकला मूल और अस्थमा जैसे फेफड़ों के रोगों के हठ में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। हालांकि, कम एयरवे उपकला कोशिकाओं को विशेष रूप से स्वस्थ नियंत्रण रोगियों और बच्चों से, एक नैदानिक ​​सेटिंग में प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है। कई अध्ययनों से डेटा आधार यह है कि नाक mucosa से उपकला कोशिकाओं कम एयरवे उपकला कोशिकाओं 13-20 के लिए एक वैध और व्यावहारिक प्रॉक्सी समर्थन कर रहे हैं, खासकर जब वायु प्रदूषण और एलर्जी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। नाक mucosa 90% से अधिक रोमक एयरवे उपकला कोशिकाओं के होते हैं और इन नाक उपकला कोशिकाओं (एनईसीएस) नमूने आसानी से, बच्चों की उम्र चार या पाँच के रूप में के रूप में युवा में किया जा सकता, क्योंकि यह अन्य सेल / ऊतक नमूना तकनीक की तुलना में कम आक्रामक है और है इस तरह के संक्रमण 20-23 के रूप में प्रतिकूल घटनाओं के कम से कम जोखिम के साथ जुड़े। यह लंबे समय अनावश्यक है, और अक्सर दर्दनाक ब्रोंकोस्कोपी procedu बिना दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त बच्चों नमूने के लिए एक तेजी से और आसान तरीका प्रदान करता हैres कि बेहोश करने की क्रिया की जरूरत। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि रोग अस्थमा गंभीरता से संबंधित उपप्रकार दोनों नाक mucosa के साथ-साथ बच्चों को दमा से लिया ब्रोन्कियल सेल के नमूने में प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और दो ​​प्रकार के ऊतकों के बीच जीन अभिव्यक्ति गैर सर्वव्यापी जीन 22 से 90% के बारे में इसी तरह की थी 24। IPSCs के लिए एक स्रोत के रूप में, एनईसीएस अन्य बार उपयोग प्रकार की कोशिकाओं से अधिक लाभ प्रदान करते हैं। Fibroblasts अक्सर IPSC पीढ़ी के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन हालांकि इन कोशिकाओं को आसानी से एक त्वचा बायोप्सी से संवर्धित किया जा सकता है, यह प्रक्रिया आम तौर पर स्थानीय संज्ञाहरण, एक चीरा और टांके की आवश्यकता है, और संक्रमण के कुछ जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है। इसलिए, बायोप्सी के इस प्रकार के रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त करने के मुश्किल से 25 हो सकती है। fibroblasts के लिए एक वैकल्पिक परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) है। हालांकि, यह बाल चिकित्सा रोगियों से IPSC पीढ़ी के लिए पर्याप्त रक्त प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, वहाँ नीचे की ओर एपी की सीमाएं हैंfibroblast और रक्त कोशिका ली गई IPSCs, कुछ प्रकार की कोशिकाओं 5,26 करने के लिए विशेष रूप से उनके भेदभाव क्षमता के लिए plications। इसलिए, रिश्तेदार पहुंच और उनके संग्रह निम्नलिखित दुष्प्रभाव का कम जोखिम को देखते हुए, एनईसीएस बाल चिकित्सा आबादी से IPSC पीढ़ी के लिए एक आदर्श सेल स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं।

IPSCs, मानव विकास का अध्ययन उपन्यास रोग मॉडल पैदा करने के लिए एक मंच के रूप में हाल ही में ध्यान की एक बहुत कुछ प्राप्त किया है, और व्यक्तिगत उपचार के लिए कोशिकाओं का एक संभावित स्रोत के रूप में। इससे पहले इस तकनीक की पूरी क्षमता का एहसास किया जा सकता है, reprogramming प्रक्रिया के आणविक आधार स्पष्ट करने की आवश्यकता है, लेकिन अब इस प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं के भीतर उल्लिखित एयरवे जोखिम पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान अध्ययन के लिए स्पष्ट होगा, साथ ही साथ के लिए एक मंच प्रदान करते हैं IPSCs से जुड़े व्यक्तिगत दवा के प्रभावों का अध्ययन।

कई प्रयोगशालाओं की सहयोगी काम generatio के लिए प्रेरित कियान केवल नाक mucosa नमूने, लेकिन यह भी एनईसीएस संवर्धन, और IPSCs 23 करने के लिए इन कोशिकाओं reprogramming के लिए एक सफल तकनीक के एन। यह लेख इष्टतम नमूने, संवर्धन, और reprogramming की स्थिति के लिए एक प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा प्रदान करता है।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल संस्थानों मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन करती है।

1. नाक mucosa नमूना

ध्यान दें: विषयों जो श्वसन वायरल संक्रमण के लक्षण के लिए स्वतंत्र हैं नमूनों से प्राप्त करते हैं।

  1. प्रतिभागी को यात्रा से पहले एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ताजा तैयार है और 2 मिलीलीटर BEGM (ब्रोन्कियल उपकला सेल के विकास मध्यम) प्लस 20 μl बाँझ पेन / Strep / Fungizone (पी / एस / एफ) (0.01%) जोड़ें।
  2. सिर्फ नमूना लेने से पहले ओपन कोशिका विज्ञान ब्रश, ब्रश और बाँझ रखने के लिए यकीन है कि हो सकता है और इसके अलावा नाक सतहों किसी भी सतहों के लिए यह नहीं टिकते।
  3. भागीदार पूछो अभी भी बैठने और छत की ओर सिर झुकाव के लिए। छोटे हैं या अधिक बेचैन बच्चों को अपने हाथों पर बैठते हैं और / या लेटी ब्रश दूर swatting से बचने के लिए।
  4. नाक जहां पारित होने संकरी (एक छोटे ब्लैक होल तरह दिखता है) के पीछे ब्रश निशाना लगाओ। स्लाइड नीचे ब्रश और कलाई मोड़ के रूप में ब्रश nostri से निकाल दिया जाता हैएल।
  5. शंक्वाकार में ब्रश की जगह और BEGM में डूब। अतिरिक्त ब्रश कट और ट्यूब पर टोपी की जगह। भंवर नहीं है।
    नोट: यदि प्रतिभागी को तैयार है, लेकिन एक ही तरीके से दूसरे नथुने में एक दूसरे ब्रश प्राप्त करते हैं। दोनों नाक के एक brushing प्राप्त करने के लिए एक उच्च संभावना है कि नमूना सफल हो जाएगा में परिणाम होगा। एक ही नथुने नमूना रक्तस्राव में हो सकता है और संभावना नमूना सुधार नहीं होगा।
  6. नमूने गर्म पानी के साथ एक बीकर का उपयोग करते हुए परिवहन के दौरान संभव के रूप में 37 डिग्री सेल्सियस के करीब के रूप में रखें।

2. कोशिका गिनती और Cytospin

  1. धीरे BEGM में ब्रश आंदोलन और एक hemacytometer का उपयोग कर एक कोशिका गिनती के लिए नमूना के 10 μl ले। एक लाइव / मृत दाग के 10 μl जोड़ें और केवल एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं रहते गिनती।
  2. नमूने के 50 μl ले लो और 1x पीबीएस के साथ 200 μl के लिए पतला। cytospin 2 मिनट के लिए 300 rpm पर गिलास स्लाइड और स्पिन से जुड़ी कीप में जोड़े। चलो स्लाइड सूखी हे / एन और दाग followin स्लाइडजी निर्माता के निर्देशों। अधिमानतः अंधेरे में, हे / एन सूखे की अनुमति दें।
  3. हेमा 3 दाग के साथ दाग स्लाइड
    1. प्रत्येक समाधान (; हेमा 3 समाधान मैं, गुलाबी, हेमा लगानेवाला, हल्के नीले और हेमा 3 समाधान द्वितीय, गहरे नीले) स्थानांतरण एक धुंधला डिश में; कवर जब उपयोग में नहीं रखें। स्लाइड धुंधला नाव में स्लाइड्स सम्मिलित
    2. डुबकी स्लाइड लगातार 30 सेकंड के लिए लगानेवाला में, तो अतिरिक्त पलायन करने की अनुमति देते हैं। डुबकी समाधान में लगातार स्लाइड मैं 30 सेकंड के लिए, तो अतिरिक्त पलायन करने की अनुमति देते हैं। डुबकी 30 सेकंड के लिए समाधान द्वितीय में लगातार स्लाइड्स, तो अतिरिक्त पलायन करने की अनुमति
    3. जब तक पानी साफ चलाता विआयनीकृत पानी से कुल्ला। अंधेरे में हे / एन सुखाने के लिए, अधिमानतः की अनुमति दें
  4. माइक्रोस्कोप और गिनती कोशिकाओं के तहत स्लाइड को देखो, उपकला कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित। 90% या अधिक से अधिक होना चाहिए, अगर नमूना अच्छा है।

3. सीडिंग प्रकोष्ठों

ध्यान दें: एक उचित और प्रमाणित टिशू कल्चर में सभी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं को पूराहुड बाँझ तकनीक का इस्तेमाल करते हैं।

  1. गोजातीय त्वचीय कोलेजन (बीडीसी) के साथ कोट प्लेटों, प्रकार 1. 3 मिलीग्राम / एमएल बीडीसी के 0.5 मिलीलीटर 49.5 मिलीलीटर 1x पीबीएस में पतला जोड़ें। कम तैयार केवल कुछ प्लेटों का इस्तेमाल किया जाएगा। कोट एक T25 या 2 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर बीडीसी के साथ फ्लास्क और बाँझ हुड में सेते हे / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर, यदि आवश्यक है।
  2. ऊष्मायन के बाद, किसी भी शेष तरल aspirate। बाँझ हुड में 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए बोतल बेनकाब। एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्टोर बोतल, लेकिन कोशिकाओं बोने से पहले आरटी के लिए उन्हें लाने के लिए या 37 डिग्री सेल्सियस।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर BEGM में ब्रश और कोशिकाओं रखें बीज के लिए तैयार है जब तक। शंक्वाकार अंदर धीरे बेंत की मार ब्रश, लेकिन भंवर नहीं है।
    1. प्लेट एक T25 फ्लास्क में 7 x 10 5 कोशिकाओं। अगर वहाँ कम, एक छोटे कंटेनर, 6 अच्छी तरह से थाली की तरह के रूप में एक अच्छी तरह से इस्तेमाल करते हैं। इस आकार की प्लेट के बारे में 3 x 10 5 कोशिकाओं की आवश्यकता है।
      नोट: यदि इस कई कोशिकाओं नहीं हैं, यह जारी रखने के लिए उचित नहीं है।
  4. एक बाँझ हुड के तहत, ट्यूब और जीई के बाहर ब्रश लेntly लेपित कुप्पी की सतह पर ब्रश घुमाने के लिए, कोटिंग खरोंच करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा। एक उपयुक्त biohazard कंटेनर में ब्रश त्यागें।
  5. धीरे-धीरे शंक्वाकार के बाहर और T25 फ्लास्क में BEGM में शेष कोशिकाओं पिपेट। खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। अस्थायी कोशिकाओं के एक नंबर मनाया जाएगा और नाक, जो इस स्तर (चित्रा 3 ए) पर स्वीकार्य है से कुछ मलबा भी हो सकते हैं।

4. सेल संस्कृति

  1. कोशिकाओं को बोने के बाद, उन्हें बिना व्यवधान के 48 घंटा (चित्रा 3) के लिए समझौता। 48 घंटे के बाद, धीरे धीरे और धीरे 2 मिलीलीटर गर्म BEGM और 20 μl बाँझ Penicilin / स्ट्रेप्टोमाइसिन / Fungizone (पी / एस / एफ) जोड़ें।
    नोट: मीडिया के मूल 2 मिलीलीटर aspirate नहीं है।
  2. बोने के बाद 4 वें दिन पर, ध्यान से सभी तरल aspirate, और ताजा 4 मिलीलीटर के साथ की जगह, गरम BEGM प्लस 1x पेन / Strep (fungizone जरूरी नहीं रह जाता)। मीडिया हर दो दिन में बदलने के लिए और संलग्न कर के लिए कोशिकाओं का आकलनजाहिर है, विकास, और संगम। जब कोशिकाओं तक पहुँचने ~ 80% संगम, 2-3 हफ्तों में आमतौर पर, वे passaged होने के लिए तैयार कर रहे हैं।
  3. एक T25 कुप्पी (लगभग 2.5 x 10 6 कोशिकाओं जब मिला हुआ) तीन T25 बोतल या एक T75 फ्लास्क में passaged जा सकता है। पहले पारित होने के बाद, कोशिकाओं मजबूत और स्वस्थ होना चाहिए, संगम तक पहुंचने के बारे में हर तीन दिनों के लिए।

5. Passaging प्रकोष्ठों

  1. धीरे थाली से मीडिया aspirate। के बारे में 4min के लिए थाली और इनक्यूबेटर में जगह के लिए T25 कुप्पी प्रति 1 मिलीलीटर 0.05% trypsin समाधान जोड़ें, या कोशिकाओं थाली से अलग होने तक। कोशिकाओं हर 2 मिनट की टुकड़ी के स्तर की जांच और अब से 10 मिनट पर ट्रिप्सिन नहीं छोड़ते।
  2. 5 मिलीलीटर trypsin निष्क्रिय समाधान (टीएनएस), या सीरम युक्त मीडिया एंजाइम को बेअसर करने के लिए जोड़ें। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कुप्पी और जगह से सभी तरल और कोशिकाओं निकालें।
  3. 5 मिनट के लिए 200 XG (0 त्वरण मंदी 0) पर अपकेंद्रित्र एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए। महाप्राण supernaनई बोतल में मात्रा के लिए आवश्यक BEGM में + पी / एस उग्रवादी और resuspend कोशिकाओं (एक T75 कुप्पी के लिए एक T25 कुप्पी के लिए 4 मिलीलीटर, 10 मिलीलीटर)
  4. ऊपर के रूप में (2.1) में वर्णित एक लाइव / मृत दाग के साथ कोशिकाओं की संख्या को पूरा करें। लेपित बोतल को BEGM और कोशिकाओं की उचित मात्रा में जोड़ें और इनक्यूबेटर में लौटने। ऊपर के रूप में विस्तृत बनाए रखने या मिलीलीटर प्रति 0.5-2 x 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में मध्यम (70% BEGM, 20% और 10% FBS DMSO) ठंड में cryopreserve।

6. IPSCs को Reprogramming

नोट: IPSCs पैदा करने से पहले, और मानव पीढ़ी IPSCs के उपयोग को नियंत्रित करने के सभी संस्थागत नियमों के पालन किया जाता है। बाँझ तकनीक IPSC संस्कृतियों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में संस्कृति के माध्यम नियमित रूप से एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल नहीं करता। यह महत्वपूर्ण है कि एनईसीएस स्वस्थ दिखाई देते हैं और मजबूती के साथ सफल reprogramming के लिए proliferative हो रहा है।

  1. प्लेट एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 5 एक्स 10 5 एनईसीएस। 24 घंटे के बाद, polybrene जोड़नेBEGM करने lentiviral कणों मीडिया को Oct4, Sox2, Klf4, सी Myc व्यक्त जोड़कर 8 माइक्रोग्राम / एमएल और transduce एनईसीएस के अंतिम एकाग्रता के लिए। ~ 5 27 का संक्रमण (MOI) की बहुलता को प्राप्त करने के लिए निशाना लगाओ।
    1. MOI का निर्धारण करने के लिए, ध्यान केंद्रित किया-lentiviral शेयर के धारावाहिक dilutions तैयार करने और इन dilutions के साथ HT1080 कोशिकाओं transduce। पहले स्पष्ट HT1080 कोशिकाओं में dTomato अभिव्यक्ति का पता लगाने के बाद, dTomato पॉजिटिव कोशिकाओं / प्रत्येक कमजोर पड़ने में कोशिकाओं के छोटे गुच्छों की संख्या स्कोरिंग द्वारा "transducing इकाइयों / मिलीलीटर" की संख्या की गणना।
      नोट: आमतौर पर, वहाँ dilutions कि बहुत अधिक हैं (सब कुछ dTomato सकारात्मक है) और बहुत कम है (या कोई भी केवल सकारात्मक कोशिकाओं की एक जोड़ी) हो जाएगा।
    2. dilutions जिसमें असतत सकारात्मक कोशिकाओं / कोशिकाओं के छोटे गुच्छों की पहचान की है से स्कोरिंग प्रदर्शन करना। उचित कमजोर पड़ने कारक के साथ इकाइयों / एमएल transducing की संख्या को सही करने से अनुमापांक निर्धारित करते हैं। MOI तो संख्या का अनुपात हैके वायरस कणों की संख्या 27 के लिए कोशिकाओं transduced।
      नोट: प्रत्येक dTomato सकारात्मक सेल / छोटे पेड़ों का झुरमुट एक भी कण वायरस से पैदा करने के लिए माना जाता है।
  2. लगभग 3 घंटे बाद पारगमन, मीडिया को हटाने और नए सिरे से BEGM के साथ बदलें। संस्थागत मंजूरी दे दी प्रक्रियाओं का उपयोग lentivirus युक्त मीडिया त्यागें। 3 दिन के लिए इनक्यूबेटर transduced एनईसीएस लौटें।
  3. 3 दिन, ताजा BEGM के साथ मीडिया की जगह है, और फिर एक और 3 दिन के लिए सेते हैं। महाप्राण बिताया मीडिया, 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने के लिए और अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर 0.05% trypsin समाधान जोड़ें। Trypsin के साथ पारित होने कोशिकाओं (धारा 5) के रूप में ऊपर लिखा। ध्यान से 4 मिलीलीटर BEGM + P / एस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं aspirate। प्रकोष्ठों एक 6 अच्छी तरह से थाली का एक नया अच्छी तरह से बीडीसी के साथ लेपित को passaged किया जा सकता है, या MEF संस्कृतियों को जोड़ा गया है, अगर तैयार (अगले कदम देखें)।
  4. MEF लेपित प्लेट तैयार करें। 4 दिन पर 0.1% जिलेटिन समाधान (1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) एक 6 अच्छी तरह से 2 कुओं के लिए (प्रदर्शन करने के लिए +/- Thiazovivin (एसपीटी) कदम 6.6 देखें) जोड़ें। अगले परदिन, निष्क्रिय MEFs 28 की एक शीशी पिघलना।
  5. MEFs MEF मीडिया (DMEM + 1x NEAA + 10% DFCS) के 10 मिलीलीटर में रखें। 5 मिनट के लिए 200 XG पर स्पिन गोली। MEF मीडिया में Resuspend। 6 अच्छी तरह से थाली से महाप्राण जिलेटिन और जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 1.87 x 10 5 MEFs जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन, या 24 घंटे की एक न्यूनतम के लिए।
  6. स्थानांतरण 2 BEGM मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से एक पहले से लेपित 6 अच्छी तरह से थाली के 2 कुओं में transduced कोशिकाओं और सेते हे / एन से युक्त। अगले दिन, 4 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक युक्त मानक hESC मीडिया के प्रति अच्छी तरह से 2.5 मिलीलीटर के साथ BEGM जगह। 10 दिनों के लिए दैनिक ताजा hESC मीडिया के साथ कोशिकाओं फीड +/- SPT
    नोट: यह एनईसीएस 23 के लिए दक्षता और reprogramming के कैनेटीक्स को बढ़ाने के लिए छोटे अणुओं (SB431542, PD0325901, और Thiazovivin (एसपीटी) कॉकटेल) के एक कॉकटेल जोड़ने के लिए संभव है।
  7. दस दिनों के बाद, एसपीटी बिना hESC मीडिया का उपयोग दैनिक को खिलाने के लिए जारी है। संस्कृतियों फीड दैनिक जब तक hESC तरह कालोनियोंदिखाई देते हैं (चित्रा 5 ए, P0 कॉलोनी)। cytoplasmic अनुपात और प्रमुख nucleoli: कालोनियों उनके उच्च नाभिक से ख्यात IPSCs को शरण देने को पहचानें।
  8. hESC की तरह आकृति विज्ञान के साथ मैन्युअल आबकारी एवं हस्तांतरण कालोनियों संस्कृति और एक फीडर से मुक्त प्रणाली में अलग लाइनों के रूप में विस्तार के लिए कुओं अलग करने के लिए। Excised कालोनियों इन परिस्थितियों के लिए तेजी से अनुकूल होना चाहिए।
    1. चढ़ाना excised कालोनियों के बाद इन असतत ख्यात IPSC लाइनों अब मार्ग 1 (P1) माना जाता है। mTeSR1 के साथ दैनिक फ़ीड संस्कृतियों। पारित होने और मानक प्रक्रियाओं का उपयोग IPSC लाइनों का विस्तार। यह कई दिनों एक सप्ताह के लिए ले P1 कालोनियों आकार, जिस पर वे passaged किया जाना चाहिए तक पहुँचने के लिए कर सकता है।

7. संस्कृति को बनाए रखने में IPSCs

  1. फ़ीड और दैनिक संस्कृतियों का मूल्यांकन। मैन्युअल आबकारी क्षेत्रों में एक बाँझ कांच पिपेट या सूक्ष्म विंदुक टिप के साथ scraping द्वारा प्रकट भेदभाव का प्रदर्शन। दैनिक उठा के बाद मीडिया को बदलें।
  2. पारित होने के बाद कोशिकाओं approximately हर चार दिन: धीरे महाप्राण मीडिया, 6 अच्छी तरह से थाली (आधा खिला मात्रा) की अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर गर्म Dispase (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने, तो के बारे में 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। कालोनियों के किनारों को उठाने के लिए है, जो कॉलोनी के चारों ओर एक सफेद रूपरेखा की तरह लग रहा है शुरू हो जाएगा। धीरे Dispase aspirate और गरम DMEM / F12 के साथ 3x धो लें।
  3. 2 मिलीलीटर mTeSR1 जोड़ें और थाली से कालोनियों को उठाने के लिए एक सेल चोर का उपयोग करें। एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट या P1000 micropipette का उपयोग धीरे कोशिकाओं triturate जब तक कालोनियों छोटे समूहों में टूट रहे हैं।
    1. बहुत छोटे समूहों या एकल कक्षों का निर्माण करने से बचें, के रूप में अस्तित्व और बाद के प्रसार उप इष्टतम किया जाएगा। जब फिर से चढ़ाना कालोनियों, एक 1: 4 1: 6 विभाजन इष्टतम कॉलोनी घनत्व को बनाए रखने होगा। धीरे थाली से कालोनियों और मीडिया को हटाने और नए, Matrigel लेपित कुओं में जोड़ें।

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Representative Results

नाक के प्रारंभिक भाग, नाक बरोठा कहा जाता है, उपास्थि 29 से घिरा हुआ क्षेत्र है। ब्रश नाक के इस क्षेत्र के अतीत को सुचारू रूप से जाना, नाक वाल्व (आंतरिक दरवाजा, या "ब्लैक होल" Nare की पीठ पर देखा) से परे की जरूरत है, और नमूना अवर turbinate (चित्रा 1) से प्राप्त की है। नाक turbinates बोनी संरचनाओं कि नाक 29 की सतह क्षेत्र में वृद्धि, उन्हें नमूना लेने के लिए एक आदर्श स्थान बना रहे हैं। इस क्षेत्र में भी vascularized श्लैष्मिक ऊतक, जो निकट कम एयरवेज के अस्तर जैसा दिखता है और पर्यावरण जोखिम के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भी सक्रिय है से तैयार है।

सही ऊतक के नमूने सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं है कि reprogrammed रहे हैं उपकला कोशिकाओं रहे हैं। यह है, बल्कि संस्कृति में कोशिकाओं को देख कर प्रारंभिक सेल गिनती और cytospin द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।cytospin, एक बार, नीचे काता सूखे, और दाग, नमूना के श्रृंगार से पता चलता है। अधिकांश नमूने एक दौर नाभिक के साथ, उपकला कोशिकाओं है, जो स्तंभ और रोमक हैं से मिलकर बनता है। हेमा 3 दाग किट के साथ, वे एक गहरे रंग बैंगनी नाभिक के साथ एक हल्के नीले रंग (चित्रा 2) दाग, और अक्सर जब नाक वे एक साथ देखा जाता है clumped से सीधे लिया। हालांकि शुरू में नाक सेल के नमूने प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण के साथ ही नाक से मलबे, संस्कृति और मीडिया में परिवर्तन के साथ समय के साथ कर रहे हैं, उपकला कोशिकाओं प्रमुख (चित्रा 3 ए, बी) हो जाते हैं। उपकला कोशिकाओं संगम के लिए बढ़ रहे हैं, वे एक हौसले से फटा अंडे, जहां नाभिक बड़ी है जैसे आकार और केंद्र में स्थित है और सेल के रूप में विभाजित करने के लिए (चित्रा 3 बी) तैयार करता है कोशिका द्रव्य "बाहर तक पहुँचने" और खींच की तरह है कर रहे हैं। कोशिकाओं को एक साथ होते हैं, वे एक फुटबॉल के आकार के और अधिक पर ले, और डिश में आराम से एक साथ फिट (चित्रा करने के लिए शुरू3 सी)।

एक बार कोशिकाओं transduced रहे हैं, वे नाभिक में tdTomato फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करेंगे। चित्रा 4 कोशिकाओं से पता चलता है कि वे एक बार transduced किया गया है, उज्ज्वल क्षेत्र, प्रतिदीप्ति में विलय कर दिया और दोनों छवियों के साथ। नहीं हर सेल मार्कर व्यक्त करता है, और इसलिए नहीं हर कोशिका transduced किया गया था, लेकिन अच्छी तरह से प्रत्येक के बारे में 90 प्रतिशत पारगमन क्षमता होनी चाहिए, और यह संभावना है कि कुछ कोशिकाओं MEFs पर चढ़ाया जा रहा है के बाद pluripotency को प्राप्त होगा वृद्धि होगी।

एक बार जब सह-सुसंस्कृत MEFs साथ और कोशिकाओं के रूप में कालोनियों के रूप में करने के लिए शुरू, वे धीरे-धीरे tdTomato व्यक्त बंद हो जाएगा। हालांकि, इस कॉलोनी गठन का सबसे अच्छा संकेत नहीं है। कॉलोनी गठन का सबसे अच्छा संकेत दृश्य पुष्टि है। hESC कालोनियों, जो pluripotency की "सोने के मानक 'कर रहे हैं, ज्यादातर गोल कर रहे हैं और larg के साथ कई छोटे, गोल कोशिकाओं से बना रहे हैंई नाभिक और कोशिका द्रव्य अनुपात करने के लिए एक उच्च नाभिक। प्रत्येक कोशिका ज्यादातर नाभिक से बना होता है, और अन्य अंगों को स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं हैं। मानक फीडर मुक्त परिस्थितियों में IPSC कॉलोनी फसल, और संस्कृति के बाद नवगठित IPSC कालोनियों ज्यादा अपने hESC समकक्षों की तरह दिखना चाहिए, और के रूप में चित्रा 5 ब में देखा व्यक्तिगत कोशिकाओं, hESC phenotype के लिए लगभग समान हैं।

इससे पहले का उपयोग IPSCs प्रयोगों में नाक उपकला कोशिकाओं (एनईसी-IPSCs) से उत्पन्न, यह नई लाइनों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए सलाह दी है। यह आमतौर पर कुपोषण, pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति, और IPSCs की क्षमता 3 भ्रूण रोगाणु परतों (एण्डोडर्म, mesoderm और बाहरी झिल्ली) में से प्रत्येक में अंतर करने का मूल्यांकन शामिल है। भेदभाव क्षमता कई मायनों में परीक्षण किया जा सकता है, लेकिन वर्तमान में, सबसे कड़े परख टेराटोमा परख 2,23,30 है। ऐसे ट्रांसक्रिप्शनल के रूप में अधिक व्यापक assays और Epigenomic की रूपरेखा निर्धारित करने के लिए कि क्या किसी भी गुणसूत्र असामान्यताओं 23 reprogramming द्वारा पेश कर रहे हैं उपयोगी होते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. अवर turbinate। सैम्पलिंग आंदोलन और नमूना लक्ष्य, अवर turbinate, काला तीर द्वारा संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Cytospin। नमूने के अधिकांश उपकला कोशिकाओं है, जो लंबी और स्तंभ हैं, एक छोर पर सिलिया और अन्य पर एक दौर नाभिक के साथ होते हैं। वे अक्सर एक साथ clumped कर रहे हैं जब Nare से सीधे जांचा। तीर व्यक्तिगत उपकला कोशिकाओं का संकेत मिलता है।"Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. संस्कृति में प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं। (ए) अस्थायी कोशिकाओं और मलबे बस के बाद नमूना एकत्र की है और चढ़ाया जाता है। (बी) कोशिकाओं passaged होने के बाद एक दिन। सेल आकृति विज्ञान संगत है और संस्कृति को मुख्य रूप से नाक उपकला कोशिकाओं, 10X बढ़ाई, और (सी) 5X बढ़ाई के होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एनईसीएस के पारगमन। प्रकोष्ठों वेक्टर हाथ में लिया और लाल प्रतिदीप्ति मार्कर tdTomato दिखा दिया है transduced जा रहा है। के रूप में वे एक pluripotent राज्य की दिशा में प्रगति यह मार्कर फीका करना चाहिए। (ए) transduced कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (बी) transduced कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट छवि। (सी) ओवरले उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों (पैनल ए और बी) के। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. IPSC सेल की तरह कालोनियों स्टेम। (ए) MEFs पर बढ़ रहा है, कॉलोनी ज्यादातर किनारों पर गोल है और कोई भेदभाव करने के लिए छोटी से पता चलता है। (बी) व्यक्तिगत कोशिकाओं बड़े नाभिक के साथ छोटे गोल कोशिकाओं के साथ, ठेठ hESC तरह आकारिकी दिखा।5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

नाक उपकला कोशिकाओं (एनईसीएस) airway रोग के अध्ययन के लिए एक सुलभ मंच हैं, और एनईसी-IPSCs एक रोमांचक अवसर प्रदान करते हैं रोग विकास, उपचार और चिकित्सा 1,31,32 पता लगाने के लिए। एनईसीएस आसानी से तनावपूर्ण या हानिकारक प्रक्रियाओं 6,23 बिना प्राप्त किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित नाक mucosa के नमूने कम तनावपूर्ण और बेहतर बच्चों के लिए रक्त संग्रह की तुलना में कथित प्रतीत होता है। इसलिए, इस विधि एयरवे रोगों का अध्ययन करने के लिए बाल चिकित्सा रोगी आबादी में विशेष रूप से उपयोगी और प्रासंगिक हो सकता है। एनईसीएस के अन्य लाभ यह है कि एक बार वे संस्कृति में हैं, उपकला कोशिकाओं मीडिया और संस्कृति शर्त के साथ के लिए चुने गए और समरूप बन रहे है। इस तरह के रक्त कोशिकाओं के रूप में एक जटिल ऊतक का उपयोग करने से लाभप्रद है और यह आसान transcriptomic और epigenetic दृष्टिकोण का उपयोग कर IPSC लाइनों जिसके परिणामस्वरूप में सेल मूल के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए बनाता है।

कबनाक mucosa नमूने, यह महत्वपूर्ण है कि नाक की सही क्षेत्र के रूप में एक माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत cytospin देखने इसका सबूत नमूना है इतना है कि ज्यादातर उपकला कोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं। सही नमूने ≥90% उपकला कोशिकाओं निकलेगा। यह स्वस्थ रोगियों से नमूने प्राप्त करने के लिए, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना आदेश प्राप्त की और चढ़ाया सेल संख्या को अधिकतम करने में उचित रूप से इकट्ठा किया जाता है महत्वपूर्ण है। घुमा गति प्रोटोकॉल (धारा 1.5) में वर्णित है कि ब्रश संभव के रूप में नाक की सतह के रूप में ज्यादा के साथ संपर्क में आता है। यह एक प्राकृतिक पलटा जब एक विदेशी वस्तु किसी के चेहरे की ओर बढ़ रहा है एक के सिर बारी है। इसलिए, घटना है कि एक बच्चे को उसके सिर बदल जाता है या दूर खींचती में, यह जरूरी है कि नमूना लेने के लिए जल्दी और सही होता है। इन तकनीकों का प्रयोग प्रोटोकॉल के हर दूसरे कदम की दक्षता बढ़ाने के लिए, और सफल reprogramming की संभावना का निर्धारण करेगा। बच्चा पूछनीचे झूठ है, और यहां तक ​​कि उन्हें उनके हाथों के नीचे करने के लिए जगह है या एक माता पिता या भाई उनके हाथों पकड़ है उन्हें अभी भी झूठ बोलने के लिए और मदद करने के लिए एक चिकनी और दर्द रहित नमूना संग्रह की गारंटी प्रोत्साहित करने के लिए एक अच्छा तरीका है।

हाल ही में, कुछ अन्य नमूना तकनीक, आराम, आराम, और नमूना परिणामों के लिए मूल्यांकन किया गया है सेल सामग्री और संरचना के साथ-साथ आरएनए और डीएनए के आधार पर पैदावार 33। समूह की तुलना में एक पॉलिएस्टर झाड़ू एक कोशिका विज्ञान ब्रश के साथ नमूने की समीक्षा की, और वे दोनों अवर turbinate के साथ-साथ सख्ती ब्रश या nares के आसपास घूमता द्वारा झाड़ू पूर्वकाल nares जांचा। एक ब्रश के साथ अवर turbinate नमूने, हालांकि यह सबसे अच्छा आरएनए पैदावार उपज था और सबसे रोमक उपकला कोशिकाओं के शामिल है, एक पॉलिएस्टर झाड़ू की तुलना में थोड़ा असहज हो पाया था। विधि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित इसलिए श्वसन एयरवे अध्ययन करने के लिए एक मार्ग के रूप में नाक epithelia नमूने का सबसे विश्वसनीय पद्धति के रूप में सत्यापित किया गया हैउपकला।

एक बार नमूना प्राप्त किया जाता है, यह 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। सबसे प्रभावी तरीकों में से एक है, जबकि भागीदार मिलने की तैयारी सुरक्षित परिवहन के लिए एक स्टायरोफोम कंटेनर में अधिक से अधिक से अधिक 37 डिग्री सेल्सियस और यह नेस्ले के लिए पानी की एक बीकर गर्म करने के लिए है। नमूना एकत्र किया जाता है बस से पहले, ठंडे पानी जोड़ने के लिए इतना है कि तापमान के बारे में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए लाया जाता है, और मीडिया के साथ शंक्वाकार ट्यूब जोड़ें। ब्रश शंक्वाकार ट्यूब जोड़ा जाता है, पानी से स्नान करने के लिए तुरंत ट्यूब लौट सकते हैं और यह वहाँ रखने के लिए जब तक यह प्रयोगशाला लौटा जा सकता है, पर जो बात ट्यूब एक विनियमित 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डाल दिया जाना चाहिए जब तक कोशिकाओं रहे हैं एक संस्कृति फ्लास्क पर वरीयता प्राप्त। सभी बिंदुओं पर, बाँझ तकनीक संस्कृति में विदेशी एजेंटों शुरू करने से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

नमूने के बीच परिवर्तनशीलता का एक काफी मात्रा में जब कोशिकाओं संस्कृति में डाल रहे थे देखा गया था। इस परिवर्तनशीलता दोनों दाता स्रोत से स्टेम के रूप में अच्छी तरह से लग रहा थानमूना गुणवत्ता के लिए ही। एक तरीका यह नमूना गुणवत्ता बढ़ाने के लिए प्रत्येक नथुने से एक ब्रश, या भागीदार प्रति दो ब्रश प्राप्त करने के लिए है। ताजा नमूना बोने के बाद, और के रूप में कोशिकाओं passaged हैं, कोशिकाओं की शर्त यकीन है कि वे नियमित रूप से reprogrammed किया जा करने के लिए फिट हैं होने के लिए निगरानी की जानी चाहिए। कोशिकाओं है कि के लिए सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवार बनाने वाले है कि संस्कृति के लिए लेने के लिए और जल्दी से पैदा कर रहे हैं। यह ज्ञात नहीं है कि क्यों कुछ दाताओं से कोशिकाओं अन्य कोशिकाओं से उन लोगों की तुलना में अधिक मजबूत कर रहे हैं, लेकिन यह इस तरह के नमूने के समय उम्र, नाक के आकार, और दाता के स्वास्थ्य जैसे कारकों की वजह से हो सकता है। जब एक नमूना पैदावार बहुत कुछ कोशिकाओं, या केवल कोशिकाओं की एक छोटी संख्या एक बार चढ़ाया देते हैं, नमूना संगम तक बढ़ने की संभावना नहीं है। एक संघर्षरत संस्कृति संगम तक पहुँचने करता है, कोशिकाओं को कमजोर हो जाते हैं और कई कोशिकाओं passaging के दौरान मर जाते हैं। नमूना के इस प्रकार, reprogramming के लिए एक बहुत ही गरीब उम्मीदवार के रूप में यह जरूरी है कि कोशिकाओं के तेजी से और मजबूती के साथ proliferating हो सकता है, और वे कर रहे हैं किजल्द से जल्द संभव बीतने संख्या में transduced। ऐसा नहीं है कि धीरे-धीरे बढ़ रहे हैं कोशिकाओं transfect करने के लिए उचित नहीं है, चाहे यह दाता परिवर्तनशीलता, गरीब नमूने, या passaging संस्कृतियों भी पतली के कारण है। reprogramming एक गरीब सेल संस्कृति के साथ प्रयास किया जाता है, यह उपयोग करने के लिए आगे बढ़ने की संभावना नहीं है।

पारगमन के लिए कक्षों की तैयारी प्रोटोकॉल है कि के लिए तैयार करने के लिए सबसे मुश्किल है का एक हिस्सा है। कोशिकाओं के विकास, 2 एक्स 10 5 5 x 10 5 कोशिकाओं के आधार पर करने के लिए पारगमन के लिए सुझाव दिया है और इस विशिष्ट रोगी के नमूने पर निर्भर हो सकता है। इसलिए यह सेल नंबर अलग-अलग आदर्श संख्या प्राप्त करने के साथ चढ़ाया कुछ कुओं की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल न केवल नमूने में आसानी, लेकिन यह भी रिश्तेदार आसानी और प्राथमिक सेल संस्कृतियों की स्थापना के समय, और अधिक टिकाऊ और बहुमुखी अनुसंधान के अवसरों के लिए IPSC लाइनों के लिए उन प्राथमिक सेल संस्कृतियों के बाद reprogramming की रूपरेखा। पूराक्लिनिक से संस्कृति में असतत IPSCs की स्थापना के लिए प्रक्रिया के बारे में 3 महीने लगते हैं, और reprogramming बार छोटा करने के लिए नए तरीकों 6,34,35 विकसित किया जा रहा हैं। यह क्षेत्र तेजी से और अधिक कुशल और पूर्ण तरीके IPSCs को प्राथमिक कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए, और बाद में ब्याज की विशेष सेल और प्रकार के ऊतकों में IPSCs अंतर करने के लिए पता लगाने के लिए तैयार है। हालांकि, airway रोग के लिए महत्वपूर्ण ऊतकों के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल, जैसे फेफड़ों उपकला के रूप में, अभी भी बाहर 36-38 काम किया जा रहा है।

एनईसीएस से IPSCs उत्पन्न कोशिकाओं की सरल और अपेक्षाकृत दर्दरहित अलगाव का फायदा है। इसके अलावा, यह संभव है कि NEC-IPSCs अन्य प्रकार के ऊतकों कि शोषण किया जा सकता से निकाली गई IPSCs से अधिक लाभ प्रदान करते हैं। बाद में IPSC भेदभाव पर IPSC एपिजेनेटिक्स के प्रभाव को पूरी तरह से समझ नहीं है, हालांकि सबूत इंगित करता है कि माउस और मानव IPSCs के अपने दैहिक सेल के transcriptional और epigenetic स्मृति बंदरगाहमूल और है कि यह चुनिंदा अन्य भाग्य 5,26 सीमित whilst दाता सेल प्रकार के साथ जुड़े प्रजातियों में उनके भेदभाव के पक्ष में है। मूल के ऊतक का महत्व है, और कैसे ऊतक विशेष epigenetic निशान 39-45 की अवधारण को यह प्रभावों IPSCs के कार्यात्मक गुण, विशेष रूप से सम्मान के साथ, IPSC लाइनों अधिक स्पष्ट रूप से आदेश में अध्ययन करने की आवश्यकता बेहतर समझ के कारण मूल के ऊतक का प्रभाव। यह पहले से है कि NEC व्युत्पन्न IPSCs एक जीनोमिक मेथिलिकरण हस्ताक्षर उत्पत्ति 23 के अपने ऊतक के एक epigenetic स्मृति की अवधारण का संकेत बंदरगाह दिखाया गया है। इस तरह के epigenetic स्मृति एनईसी-IPSCs में बनाए रखा, एयरवे कोशिकाओं में स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव में फायदेमंद हो सकता है के रूप में पिछले अध्ययनों से पता चला है कि रक्त कोशिका ली गई मूल के रक्त कोशिकाओं के epigenetic स्मृति प्रदर्शन IPSCs और अधिक आसानी से fibroblast या रक्त कोशिकाओं की तुलना में भेदभाव कर रहे हैं चिकनी मांसपेशियों व्युत्पन्न Bloo कमी IPSCsडी सेल विशिष्ट epigenetic स्मृति 5,26। मॉडलिंग फेफड़ों के रोगों के लिए IPSC व्युत्पन्न एयरवे कोशिकाओं की विशाल क्षमता को देखते हुए यह अध्ययन करने के लिए एनईसीएस एयरवे कोशिकाओं / ऊतक में IPSCs के भेदभाव के लिए एक इष्टतम सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं कि क्या महत्वपूर्ण होगा। इसके अलावा, इस स्थिरतापूर्वक बनाए रखा स्मृति दाता कोशिकाओं की रोग राज्यों के लिए गुणसूत्र स्थानों reprogramming के लिए प्रतिरोधी और उम्मीदवारों का प्रतिनिधित्व कर सकते। प्रोटोकॉल IPSCs कन्वर्ट करने के समीपस्थ और बाहर फेफड़ों सेल प्रकार 36-38 विकसित कर रहे हैं के रूप में, इन एनईसी-IPSCs ऐसे अस्थमा, सीओपीडी, सिस्टिक फाइब्रोसिस, और कई दूसरों के रूप में और फेफड़ों के विकास पर पर्यावरणीय प्रभाव के अध्ययन में मॉडलिंग एयरवे रोगों में एक फायदा हो सकता है और homeostasis।

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Acknowledgments

स्टेम सेल लेखकों सुविधा और सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल में Confocal इमेजिंग कोर स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), एनआईएच / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) और 2U19AI70235 (GKKH) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

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References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

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