Introduction
Le cellule staminali pluripotenti indotte da campioni umani (hiPSCs) sono una tecnologia in rapido sviluppo della ricerca sulle cellule staminali. Essi offrono un'alternativa alle cellule staminali embrionali (hESC) ricerca con molti meno inconvenienti etici e morali 1,2. Anche se non sono identici a epigeneticamente hESC 3-5, hiPSCs offrono un modo unico per modello di sviluppo e di malattia fenotipi, e possono essere derivati da tessuti rilevanti per lo stato di malattia 5-8. Nuovi metodi di hiPSCs elettrogeni sono costantemente in fase di studio per identificare i tipi di cellule ottimali per cominciare, come un modo per preparare iPSCs GMP qualità adatte per il trapianto, e anche per aumentare la tempestività e l'efficienza del processo di riprogrammazione 6,9-11.
Cellule epiteliali delle vie aeree sono fondamentali per lo sviluppo di infiammazione allergica 12, e l'epitelio è una delle principali cause di reazioni allergiche e rimodellamento delle vie aeree attraverso l'interazione con immunE e stromali cellule. L'epitelio delle vie aeree gioca un ruolo essenziale nella genesi e la persistenza di malattie polmonari come asma. Tuttavia, più bassa delle vie aeree cellule epiteliali sono difficili da ottenere in un ambiente clinico, soprattutto da pazienti sani di controllo e bambini. I dati provenienti da diversi studi supportano la premessa che le cellule epiteliali da mucose nasali sono un proxy valido e pratico per vie aeree inferiori cellule epiteliali 13-20, soprattutto quando si studiano le risposte alle sostanze inquinanti e allergeni. La mucosa nasale si compone di oltre il 90% di cellule epiteliali ciliate delle vie aeree e di campionamento queste cellule epiteliali nasali (NEC) può essere facilmente effettuata in bambini di età quattro o cinque, in quanto è meno invasivo rispetto ad altre tecniche di campionamento di cellule / tessuti ed è associato con un rischio minimo di effetti collaterali come l'infezione 20-23. Esso offre un modo veloce e semplice per assaggiare sia i bambini sani e malati senza lunghe, inutili, e spesso doloroso Operazi broncoscopiares che necessitano di sedazione. Studi precedenti hanno dimostrato che i sottotipi di malattia correlati alla gravità dell'asma possono distinguere sia nella mucosa nasale e campioni di cellule bronchiali prelevati da bambini asmatici, e l'espressione genica tra i due tipi di tessuto era simile in circa il 90% dei geni non onnipresenti 22 , 24. Come fonte per iPSCs, NEC offrono vantaggi rispetto ad altri tipi di cellule utilizzate di frequente. I fibroblasti sono spesso utilizzati per la generazione COPSI, ma anche se queste cellule possono essere facilmente coltivate da una biopsia cutanea, questo processo richiede tipicamente anestesia locale, una incisione e suture, ed è associata con qualche rischio di infezione. Pertanto, ottenendo consenso informato dai pazienti per questo tipo di biopsia può essere difficile 25. Una alternativa al fibroblasti è cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Tuttavia, può essere difficile ottenere sangue sufficiente per la generazione COPSI da pazienti pediatrici. In aggiunta, ci sono limitazioni di ap vallecomplicanze di fibroblasti e cellule del sangue iPSCs derivate, in particolare la loro capacità di differenziazione di alcuni tipi di cellule 5,26. Pertanto, data la relativa accessibilità e il basso rischio di effetti collaterali a seguito della loro raccolta, NEC rappresentano una fonte di cellule ideale per la generazione iPSC da popolazioni pediatriche.
iPSCs hanno ricevuto molta attenzione recentemente come una piattaforma per lo studio dello sviluppo umano, la generazione di modelli di malattia romanzo, e come una potenziale fonte di cellule per le terapie personalizzate. Prima di tutto il potenziale di questa tecnologia può essere realizzato, le basi molecolari del processo di riprogrammazione hanno bisogno di essere chiariti, ma per ora questo protocollo e le procedure descritte nel potranno chiarire gli studi di ricerca focalizzati sulle esposizioni delle vie respiratorie, oltre a fornire una piattaforma per studiare gli effetti della medicina personalizzata che coinvolgono iPSCs.
Il lavoro di collaborazione di diversi laboratori ha portato alla generation di una tecnica efficace non solo per campionare la mucosa nasale, ma anche coltura NEC, e riprogrammare queste cellule per iPSCs 23. Questo articolo fornisce uno schema di un protocollo per il campionamento ottimale, coltura e condizioni di riprogrammazione.
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Protocol
Il seguente protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana istituzioni.
1. Campionamento la mucosa nasale
NOTA: ottenere campioni da soggetti che sono liberi di segni di infezione virale delle vie respiratorie.
- Preparare un 15 ml fresca conica prima della visita partecipante e aggiungere 2 ml BEGM (epiteliali bronchiali Media cellulare crescita) più 20 ml sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- spazzola di citologia aperto poco prima di prendere il campione, ed essere sicuri di mantenere il pennello sterile e non toccare a tutte le superfici oltre alle superfici nasali.
- Chiedi partecipante a stare fermo e inclinare la testa verso soffitto. Avere più piccolo o più figli irrequieti siedono sulle loro mani e / o sdraiati per evitare di schiacciare la spazzola via.
- Puntare pennello nella parte posteriore del naso dove il passaggio si restringe (Sembra un piccolo buco nero). Far scorrere la spazzola verso il basso e ruotare i polsi come il pennello viene rimosso dal Nostril.
- Mettere pennello in conica e immergere in BEGM. Tagliare pennello in eccesso e rimettere il tappo sul tubo. NON FARE VORTEX.
NOTA: Se il partecipante è disposto, ottenere una seconda spazzola nello stesso modo ma nella seconda narice. Ottenere una spazzolatura di entrambe le narici si tradurrà in una maggiore probabilità che il campionamento avrà successo. Campionamento stessa narice può provocare sanguinamento e non sarà probabilmente migliorare il campione. - I campioni più vicino a 37 ° C possibile durante il trasporto utilizzando un becher con acqua calda.
2. numero di celle e Cytospin
- Agitare delicatamente il pennello in BEGM e prendere 10 ml di campione per un conteggio di cellule utilizzando un emocitometro. Aggiungere 10 ml di una macchia live / morti e contare solo vivere cellule al microscopio.
- Introdurre 50 ml di campione e portare a 200 ml con PBS 1x. Aggiungi a imbuto cytospin attaccato al vetrino e far girare a 300 giri al minuto per 2 minuti. Lasciate scorrere secca O / N e macchia scivolo followinle istruzioni del produttore g. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente al buio.
- Far scorrere macchia con Hema 3 Stain
- Trasferire ogni soluzione (Hema fissativo, la luce blu; Hema 3 Soluzione, rosa; e Hema 3 Solution II, blu scuro) in un piatto colorazione; Mantenere coperto quando non in uso. Inserire diapositive in slitta barca colorazione
- Immergere i vetrini continuamente in fissativo per 30 secondi, quindi permettono in eccesso di defluire. Dip scorre continuamente in Solution I per 30 secondi, quindi lasciare in eccesso di defluire. Dip scorre continuamente in Solution II per 30 secondi, quindi lasciare in eccesso di defluire
- Risciacquare con acqua deionizzata fino a quando l'acqua è pulita. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente al buio
- Guardate slitta sotto le cellule al microscopio e conteggio, determinare la percentuale di cellule epiteliali. Dovrebbe essere del 90% o superiore, se il campionamento è buono.
3. Cellule Seeding
NOTA: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in una cultura adeguata e certificata dei tessutiCappuccio con tecnica sterile.
- Piastre cappotto con Bovine Collagen Dermal (BDC), digitare 1. Aggiungere 0,5 ml di 3 mg / ml BDC diluiti in 49,5 ml di PBS 1x. Preparare meno se verranno utilizzati solo pochi piatti. Coat un pallone T25 con 2 ml BDC e incubare sterile cappa O / N oa 37 ° C per 2 ore, se necessario.
- Dopo l'incubazione, aspirare il liquido rimanente. Esporre fiaschi a luce UV per 30 minuti in cappa sterile. palloni Conservare fino a un mese a 4 ° C, ma portarli a RT o 37 ° C prima della semina cellule.
- Mantenere pennello e le cellule in BEGM a 37 ° C fino al momento di seminare. Delicatamente pennello swish all'interno conica, ma non fare vortice.
- Tavola 7 x 10 5 cellule in un pallone T25. Se c'è meno, utilizzare un contenitore più piccolo, come un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Questa piastra dimensioni richiede circa 3 x 10 5 cellule.
NOTA: Se non ci sono questo molte cellule, non è consigliabile per continuare.
- Tavola 7 x 10 5 cellule in un pallone T25. Se c'è meno, utilizzare un contenitore più piccolo, come un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Questa piastra dimensioni richiede circa 3 x 10 5 cellule.
- Sotto una cappa sterile, prendere pennello di tubo e gente ruotare pennello sulla superficie del pallone rivestito, facendo attenzione a non graffiare il rivestimento. Scartare pennello in un contenitore adeguato rischio biologico.
- Lentamente pipettare le cellule rimanenti BEGM fuori dalla conica e nel pallone T25. Osservare le cellule sotto il microscopio. Verrà osservato un numero di cellule galleggianti e ci possono essere alcuni detriti dal naso, che è accettabile in questa fase (Figura 3A).
Cultura 4. cellulare
- Dopo la semina delle cellule, far loro accontentarsi di 48 ore senza interruzioni (Figura 3). Dopo 48 ore, lentamente e delicatamente con 2 ml di caldo BEGM e 20 ml sterile penicillina / streptomicina / Fungizone (P / S / F).
NOTA: NON aspirare l'originale 2 ml di media. - Al 4 ° giorno dopo la semina, aspirare accuratamente tutto il liquido, e sostituirlo con 4 ml freschi, riscaldati BEGM più 1x Pen / Strep (Fungizone non è più necessario). Modificare i media ogni due giorni e valutare le cellule per attaccaremento, la crescita, e la confluenza. Quando le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza, di solito in 2-3 settimane, sono pronti per essere diversi passaggi.
- Un pallone T25 (circa 2,5 x 10 6 cellule quando confluenti) possono essere diversi passaggi in tre palloni T25 o di un pallone T75. Dopo il primo passaggio, le cellule devono essere robusti e sani, raggiungendo confluenza circa ogni tre giorni.
5. Le cellule passaging
- Aspirare delicatamente il supporto dal piatto. Aggiungere 1 ml di soluzione 0,05% tripsina per bombola T25 alla piastra e posto in incubatrice per circa 4 min, o fino a quando le cellule si staccano dal piatto. Controllare il livello di distacco delle cellule ogni 2 minuti e non lasciare tripsina su più di 10 min.
- Aggiungere 5 ml di tripsina soluzione neutralizzante (TNS), o un supporto siero contenente per neutralizzare l'enzima. Rimuovere tutto il liquido e le cellule dal pallone e mettere in un tubo da 15 ml.
- Centrifugare a 200 xg (accelerazione 0 decelerazione 0) per 5 minuti per ottenere un pellet di cellule. Aspirare SupernaTant cellule e risospendere in BEGM + P / S nel volume richiesto per i nuovi palloni (4 ml per un pallone T25, 10 ml per un pallone T75)
- Eseguire conteggio delle cellule con una macchia Live / Dead come descritto sopra (2.1). Aggiungere la quantità appropriata di BEGM e cellule per i fiaschi rivestiti e tornare alla incubatore. Mantenere come dettagliato sopra o cryopreserve a congelamento medio (70% BEGM, 20% FBS e 10% DMSO) ad una concentrazione di 0,5-2 x 10 6 cellule per ml.
6. Riprogrammazione a iPSCs
NOTA: Prima di generare iPSCs, assicurare il rispetto di tutte le prescrizioni istituzionali che regolano la generazione e l'uso di iPSCs umani. tecnica sterile è particolarmente importante per le culture IPSC, come terreno di coltura non di routine contiene antibiotici. E 'fondamentale che CNE appaiono in buona salute e sono robusto proliferativa per la riprogrammazione di successo.
- Piastra 5 x 10 5 CNE per pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6 bene. Dopo 24 ore, aggiungere polibrenea BEGM ad una concentrazione finale di 8 mg / ml e trasdurre NEC con l'aggiunta di particelle lentivirali che esprimono Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc ai media. Lo scopo di raggiungere una molteplicità di infezione (MOI) di ~ 5 27.
- Per la determinazione del MOI, preparare diluizioni seriali del magazzino concentrato-lentivirali e trasdurre cellule HT1080 con queste diluizioni. Dopo la prima inequivocabile individuazione di espressione dTomato nelle cellule HT1080, calcolare il numero di "unità di trasduzione / ml" segnando il numero di cellule dTomato-positivo / piccoli grumi di cellule in ogni diluizione.
NOTA: in genere, ci saranno le diluizioni che sono troppo alti (tutto è dTomato positivo) e troppo bassa (nessuno o solo un paio di cellule positive). - Eseguire punteggio da diluire che viene identificato cellule positive discreti / piccoli grumi di cellule. Determinare il titolo correggendo il numero di trasduzione unità / ml con il fattore di diluizione appropriata. MOI è allora il rapporto del numerodi trasdotte cellule al numero di particelle virali 27.
NOTA: Ogni dTomato cellulare positiva / piccolo ciuffo si presume che derivare da una singola particella di virus.
- Per la determinazione del MOI, preparare diluizioni seriali del magazzino concentrato-lentivirali e trasdurre cellule HT1080 con queste diluizioni. Dopo la prima inequivocabile individuazione di espressione dTomato nelle cellule HT1080, calcolare il numero di "unità di trasduzione / ml" segnando il numero di cellule dTomato-positivo / piccoli grumi di cellule in ogni diluizione.
- Circa 3 ore post-trasduzione, rimuovere il supporto e sostituirlo con fresco BEGM. Eliminare i media lentivirali contenenti utilizzando procedure istituzionalmente approvati. Rientro CNE trasdotte per l'incubatore per 3 giorni.
- Il giorno 3, sostituire il supporto con fresco BEGM, e poi incubare per altri 3 giorni. Aspirare speso media, lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere 1 ml di soluzione 0,05% tripsina al pozzo. cellule Passage con tripsina come scritto in precedenza (sezione 5). Con attenzione aspirare le cellule surnatante e risospendere in 4 ml BEGM + P / S. Le celle possono essere diversi passaggi di un nuovo pozzo di una piastra 6 e rivestito con BDC, o aggiunti alle culture MEF, se pronto (vedi punto successivo).
- Preparare MEF piastre rivestite. Il giorno 4 aggiungere soluzione di gelatina 0,1% (1 ml / pozzetto) a 2 pozzetti di una 6 pozzo (per eseguire +/- Thiazovivin (SPT) vedi punto 6.6). Nella successivagiorno, scongelare una fiala di MEF inattivati 28.
- Mettere MEF in 10 ml di media MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% DFCS). Spin a 200 g per 5 minuti per far sedimentare. Risospendere in mezzi MEF. Aspirare la gelatina da 6 pozzetti e aggiungere 1,87 x 10 5 MEF per pozzetto della piastra 6 bene la gelatina rivestite. Incubare O / N a 37 ° C, o per un minimo di 24 ore.
- Trasferire 2 ml di BEGM contenenti trasdotte cellule per pozzetto in 2 pozzetti di una piastra 6 bene precedentemente ricoperto e incubare O / N. Il giorno successivo, sostituire BEGM con 2,5 ml per pozzetto di mezzi hESC standard contenenti 4 ng / ml fattore di crescita dei fibroblasti di base. Nutrire le cellule con i media hESC fresca +/- SPT giorno per 10 giorni
NOTA: È possibile aggiungere un cocktail di piccole molecole (SB431542, PD0325901, e Thiazovivin () cocktail SPT) per migliorare l'efficienza e la cinetica di riprogrammazione per NEC 23. - Dopo dieci giorni, continuare ad alimentare ogni giorno con hESC media senza SPT. Nutrire culture ogni giorno fino colonie hESC-like(Figura 5A, P0 colonia). Identificare le colonie che ospitano iPSCs putativi per la loro alta nucleo: rapporto citoplasma e nucleoli prominenti.
- Manualmente accise e trasferire le colonie con morfologia hESC simil-pozzetti per la cultura e l'espansione come linee separate in un sistema di libero alimentatore. colonie asportato devono adattarsi rapidamente a queste condizioni.
- Dopo colonie placcatura asportato queste linee IPSC putativi discrete sono ormai considerati passaggio 1 (p1). culture giornaliera di mangime con mTeSR1. Passage ed espandere le linee IPSC utilizzando le procedure standard. Potrebbero essere necessari diversi giorni a una settimana per le colonie P1 per raggiungere la dimensione in cui devono essere diversi passaggi.
7. Mantenere iPSCs in cultura
- Alimentare e valutare le culture quotidiana. Manualmente aree accise esibendo differenziazione palese raschiando con una pipetta di vetro sterile o micro punta della pipetta. Cambiare media dopo la raccolta quotidiana.
- cellule Passage dopo approssitamente ogni quattro giorni: Gently mezzi aspirato, aggiungere 1 ml dispasi calda (1 mg / ml) per pozzetto di un 6-pozzetti (metà del volume di alimentazione), poi incubare a 37 ° C per circa 4 minuti. I bordi delle colonie cominceranno a sollevare, che appare come un contorno bianco intorno alla colonia. Delicatamente aspirare il dispasi e lavare 3x con riscaldato DMEM / F12.
- Aggiungere 2 ml mTeSR1 e utilizzare un sollevatore cella per sollevare le colonie dalla piastra. Utilizzare una pipetta da 5 ml sierologico o P1000 micropipetta per triturare delicatamente le cellule fino a quando le colonie sono suddivisi in gruppi più piccoli.
- Evitare di produrre molto piccoli gruppi o singole cellule, come la sopravvivenza e la successiva proliferazione saranno sub-ottimale. Quando le colonie ri-placcatura, un 1: 4 a 1: 6 spaccatura manterrà densità ottimale colonia. Rimuovere delicatamente colonie e dei media dal piatto e aggiungere nuovi pozzi Matrigel rivestite.
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Representative Results
La parte iniziale del naso, chiamato il vestibolo nasale, è l'area circondata da cartilagine 29. La spazzola deve andare liscio passato questa zona del naso, oltre la valvola nasale (ostium internum, o "buco nero" visto sul retro della nare), e il campione è ottenuta dalla turbinato inferiore (Figura 1). I turbinati nasali sono strutture ossee che aumentano la superficie del naso 29, che li rende un luogo ideale per il campionamento. L'area è inoltre rivestito da tessuto mucoso vascolarizzato, che ricorda da vicino i rivestimenti delle vie aeree inferiori ed è attiva anche nella risposta immunitaria alle esposizioni ambientali.
Campionamento tessuto corretto assicura che le cellule che vengono riprogrammate sono cellule epiteliali. Questo può essere valutata dal numero di celle iniziale e cytospin, ma anche osservando le cellule in coltura. Ilcytospin, una volta centrifugata, essiccato, e macchiato, mostra la composizione del campione. La maggior parte dei campioni sono costituiti da cellule epiteliali, che sono colonnare e ciliato, con un nucleo rotondo. Con il kit di colorazione Hema 3, si colorano di una luce di colore blu con un nucleo viola più scuro (Figura 2), e spesso se estrapolate direttamente dal naso si vedono aggregata insieme. Sebbene campioni di cellule nasali sono inizialmente un mix di tipi di cellule e detriti dal naso, con tempo di coltura e modifiche di supporto, le cellule epiteliali diventano predominanti (Figura 3A, B). Quando le cellule epiteliali sono in crescita di confluenza, che hanno la forma di un uovo appena incrinato, dove il nucleo è di grandi dimensioni e situati nel centro e il citoplasma è una sorta di "raggiungere" e si estende come la cellula si prepara a dividersi (Figura 3B). Come le cellule crescono insieme, cominciano ad assumere più di una forma di calcio, e si incastrano perfettamente nel piatto (Figura3C).
Una volta che le cellule vengono trasdotte, esprimono il marcatore fluorescente tdTomato nel nucleo. Figura 4 mostra le cellule una volta trasdotte, in campo chiaro, fluorescenza e con immagini fuse. Non ogni cellula esprime il marcatore, e quindi è stata trasdotte non tutte le cellule, ma ogni pozzetto dovrebbe avere circa il 90 per cento l'efficienza di trasduzione, e questo aumenterà la probabilità che alcune cellule raggiungeranno pluripotenza dopo essere stato placcato sul MEF.
Una volta co-coltura con MEF e come le cellule iniziano a formare colonie, saranno gradualmente smettere di esprimere tdTomato. Tuttavia, questa non è la migliore indicazione della formazione di colonie. La migliore indicazione della formazione di colonie è la conferma visiva. colonie hESC, che sono il "gold standard" di pluripotenza, sono per lo più rotonda e sono composti da tante piccole cellule rotonde con large nuclei e un alto nucleo al citoplasma rapporto. Ogni cella appare per lo più composta da nuclei, e altri organelli non sono chiaramente visibili. Dopo iPSC raccolta colonia, e la cultura in condizioni di assenza di alimentazione standard colonie IPSC di nuova formazione devono guardare molto come le loro controparti hESC, e le singole celle sono quasi identiche al fenotipo hESC, come si vede in figura 5B.
Prima iPSCs utilizzano generati dalle cellule epiteliali nasali (NEC-iPSCs) in esperimenti, si consiglia di valutare la qualità delle nuove linee. Questo in genere comporta la valutazione del cariotipo, l'espressione di marcatori pluripotenza, e la capacità di iPSCs di differenziarsi in ciascuno dei 3 strati germinali embrionali (endoderma, mesoderma ed ectoderma). La capacità di differenziazione può essere testato in molti modi, ma attualmente, il saggio più rigoroso è il saggio teratoma 2,23,30. test più completi, come trascrizionale e profilatura epigenomico sono utili per determinare se eventuali anomalie cromosomiche sono introdotti riprogrammando 23.
Movimento Figura 1. turbinato inferiore. Campionamento e il target di campionamento, il turbinati inferiori, è indicato da una freccia nera. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Cytospin. La maggior parte del campione è costituito da cellule epiteliali, che sono lunghe e colonnare, con cilia ad una estremità e un nucleo intorno all'altra. Essi sono spesso ragruppato insieme quando campionata direttamente dal nare. Le frecce indicano singole cellule epiteliali.target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. primarie cellule epiteliali nasali in coltura. (A) cellule galleggianti e detriti dopo campione viene raccolto e placcato. (B) Le cellule un giorno dopo essere diversi passaggi. Morfologia cellulare è coerente e la cultura è costituito principalmente da cellule epiteliali nasali, ingrandimento 10X, e ingrandimento (C) 5X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. trasduzione del NEC. Cellule essere trasdotte hanno preso il vettore e mostrerà il marcatore fluorescenza rossa tdTomato. Questo indicatore dovrebbe svanire man mano che progrediscono verso uno stato pluripotente. (A) di campo immagine luminosa di cellule trasdotte. (B) immagine fluorescente di cellule trasdotte. (C) Sovrapposizione di campo luminoso e immagini fluorescenti (pannelli A e B). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. iPSC staminali colonie di cellule-like. (A) in crescita per MEF, colonia è per lo più rotonda sui bordi e mostra poca o nessuna differenziazione. (B), le cellule individuali mostrano tipica morfologia hESC simile, con piccole cellule rotonde con grandi nuclei.5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Cellule epiteliali nasali (NEC) sono una piattaforma accessibile per studiare le malattie delle vie respiratorie, e NEC-iPSCs offrono un viale emozionante di esplorare lo sviluppo della malattia, il trattamento e la terapia 1,31,32. NEC può essere facilmente ottenuto senza procedure nocive stressanti o potenzialmente 6,23. Nella nostra esperienza, il campionamento della mucosa nasale come descritto in questo protocollo appare meno stressante e meglio percepita di raccolta sangue per i bambini. Pertanto, questo metodo può essere particolarmente utile nella popolazione pediatrica di pazienti e rilevanti per lo studio delle malattie delle vie respiratorie. L'altro vantaggio della CNE è che una volta che sono in coltura, le cellule epiteliali sono selezionati per con i media e le condizioni della cultura e diventare omogenea. Questo è vantaggioso rispetto all'utilizzo di un tessuto complesso come le cellule del sangue e rende più facile valutare l'impatto di origine cellula risultante linee IPSC utilizzando approcci trascrittomica ed epigenetici.
quandocampionamento della mucosa nasale, è importante che l'area corretta del naso viene campionato in modo che le cellule epiteliali prevalentemente vengono recuperati, come evidenziato visualizzando l'cytospin al microscopio (Figura 2). Un corretto campionamento produrrà ≥90% delle cellule epiteliali. È fondamentale per ottenere campioni da pazienti sani, e per assicurare che il campione viene raccolto in modo idoneo a massimizzare il numero cellulare ottenuta e placcato. Il movimento rotatorio descritto nel protocollo (punto 1.5) assicura che il pennello viene a contatto con il più della superficie nasale possibile. E 'un riflesso naturale per girare la testa quando un oggetto estraneo si sta dirigendo verso il proprio viso. Pertanto, nel caso in cui un bambino compie la sua testa o tira via, è essenziale che il campionamento avviene con rapidità e precisione. Usando queste tecniche aumenta l'efficienza di ogni altra fase del protocollo, e determinare la probabilità di successo riprogrammazione. Chiedere al bambinodi coricarsi, e persino a mettere le loro mani sotto di loro o hanno un genitore o un fratello tenere le mani è un buon modo per incoraggiarli a mentire ancora e per aiutare a garantire una raccolta dei campioni morbido e indolore.
Recentemente, alcune altre tecniche di campionamento sono stati valutati per il comfort, la facilità, e gli esiti del campione, in base al contenuto delle cellule e la composizione così come RNA e DNA produce 33. Il gruppo recensione campionamento con una spazzola di citologia contro un tampone in poliestere, e loro campionato sia il turbinati inferiori, così come le narici anteriori da vigorosamente roteare il pennello o tampone intorno alle narici. Campionamento turbinato inferiore con una spazzola è risultato essere leggermente fastidioso, anche se ha dato i migliori rendimenti RNA e consisteva delle cellule epiteliali ciliate più, rispetto ad un tampone di poliestere. Il metodo proposto in questo protocollo è quindi verificato come il metodo più affidabile di campionamento dei epiteli nasali come un modo per studiare vie respiratorieepitelio.
Una volta che il campione è ottenuta, deve essere mantenuta a 37 ° C. Uno dei modi più efficaci è quello di riscaldare un bicchiere d'acqua a più di 37 ° C e si annidano in un contenitore polistirolo per il trasporto sicuro durante la preparazione per incontrare il partecipante. Poco prima che il campione viene raccolto, aggiungere acqua fredda in modo che la temperatura viene portata a circa 37 ° C e aggiungere il tubo conico con i media. Quando la spazzola viene aggiunto alla provetta conica, restituire il tubo immediatamente a bagnomaria e tenerlo lì finché può essere restituito al laboratorio, a questo punto il tubo deve essere messo in un regolato 37 ° bagnomaria C fino cellule sono seminate su un pallone di coltura. In tutti i punti, una tecnica sterile deve essere utilizzato per evitare l'introduzione di agenti stranieri nella cultura.
Una quantità considerevole di variabilità tra i campioni è stata osservata quando le cellule sono state messe in coltura. Questa variabilità sembra derivare sia dalla fonte donatore nonchéla qualità del campione stesso. Un modo per aumentare la qualità del campione è quello di ottenere una spazzola da ogni narice, o due spazzole per partecipante. Dopo la semina del campione fresco, e come le cellule sono diversi passaggi, la condizione delle celle devono essere monitorati regolarmente per essere sicuri che siano idonei ad essere riprogrammato. Le cellule che compongono i migliori candidati per sono quelli che prendono alla cultura e proliferano rapidamente. Non è noto perché le cellule provenienti da alcuni donatori sono più robusti di quelli di altre cellule, ma può essere dovuto a fattori quali l'età, dimensione del naso e la salute del donatore al momento del campionamento. Quando un campione rendimenti molto poche cellule, o solo un piccolo numero di cellule attribuiscono una volta placcato, il campione è improbabile a crescere fino a confluenza. Se una cultura che lotta fa raggiungere confluenza, le cellule tendono ad essere debole e molte cellule muoiono durante passaging. Questo tipo di campione è un candidato molto povero per riprogrammazione, in quanto è essenziale che le cellule siano proliferazione rapida e robusta, e che sonotrasdotte al più presto il numero di passaggio possibile. Non è consigliabile trasfezione le cellule che crescono lentamente, se ciò sia dovuto alla variabilità dei donatori, il campionamento povero, o culture passaging troppo sottile. Se riprogrammazione viene tentata con una coltura cellulare povero, è improbabile procedere a buon fine.
Preparazione delle cellule per la trasduzione è una parte del protocollo che è più difficile da preparare. Sulla base della crescita delle cellule, 2 x 10 5 di 5 x 10 5 cellule sono suggeriti per la trasduzione e questo può dipendere su campioni specifici del paziente. Pertanto, può richiedere alcuni pozzi placcati con diversi numeri di cellulare per ottenere il numero ideale.
Questo protocollo descrive non solo la facilità di campionamento, ma anche la relativa facilità e tempistiche di stabilire colture cellulari primarie, e successiva riprogrammazione di tali colture cellulari primarie a linee IPSC per opportunità di ricerca più sostenibili e versatili. L'interoprocesso da clinica a creazione di iPSCs discreti nella cultura vogliono circa 3 mesi, e nuovi metodi per abbreviare i tempi di riprogrammazione si stanno sviluppando 6,34,35. Questo campo è in rapida evoluzione per trovare modi più efficienti e completi per convertire cellule primarie di iPSCs, e per differenziare in seguito iPSCs in specifici tipi di cellule e tessuti di interesse. Tuttavia, i protocolli di differenziazione per i tessuti importanti per le malattie delle vie aeree, come ad esempio l'epitelio polmonare, sono ancora in fase di elaborazione 36-38.
Generazione iPSCs dal CNE ha il vantaggio di isolamento semplice e relativamente indolore delle cellule. Inoltre, è possibile che NEC-iPSCs offrono vantaggi rispetto iPSCs derivate da altri tipi di tessuto che possono essere sfruttate. L'impatto di epigenetica IPSC sulla successiva differenziazione iPSC non è completamente noto, anche se le prove indicano che topo e umani iPSCs porto memoria trascrizionale e epigenetica delle loro cellule somatiche diorigine e che questo favorisce selettivamente la loro differenziazione in lignaggi associati al tipo di cellule del donatore, mentre limitare altre sorti 5,26. Data l'importanza del tessuto di origine, e come questo impatti le proprietà funzionali di iPSCs, soprattutto per quanto riguarda la conservazione dei segnali epigenetici tessuto-specifici 39-45, linee IPSC devono essere studiati in modo più chiaro, al fine di comprendere meglio la impatto del tessuto di origine. È stato precedentemente dimostrato che iPSCs NEC derivati porto una firma metilazione genomica indica mantenimento di una memoria epigenetica del loro tessuto di origine 23. Tale memoria epigenetica trattenuto nel NEC-iPSCs può essere utile nella differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule delle vie aeree, come gli studi precedenti hanno dimostrato che iPSCs globuli derivati espositrici memoria epigenetica delle cellule ematiche di origine sono più facilmente differenziate in cellule del sangue di fibroblasti o liscio iPSCs muscolo-derivati privi Blood-specifica cella di memoria epigenetica 5,26. Dato l'enorme potenziale delle cellule delle vie aeree iPSC-derivati per le malattie polmonari modellazione, sarà importante studiare se NEC rappresentano un tipo di cellula ottimale per la differenziazione dei iPSCs nelle vie aeree cellule / tessuti. Inoltre, questa memoria stabilmente mantenuta può rappresentare posizioni cromosomiche resistenti alla riprogrammazione e candidati per la malattia di stati di cellule del donatore. Come protocolli per convertire iPSCs a prossimale e tipi di cellule polmonari distali sono sviluppati 36-38, questi NEC-iPSCs può avere un vantaggio in malattie modellazione delle vie respiratorie come l'asma, la BPCO, fibrosi cistica, e molti altri e in studio effetti ambientali sullo sviluppo del polmone e l'omeostasi.
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Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere il pluripotenti cellule staminali strumento e la Confocale Imaging Nucleo presso l'Ospedale dei bambini di Cincinnati. Questo lavoro è stato sostenuto da R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocol Step 1.1. |
| BEGM | Lonza | CC-3170 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocol Step 4.a. |
| cytosoft cytology brush | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocol Step 1.2. |
| trypan blue | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocol Step 2.1. |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocol Step 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocol Step 2.2. |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | Protocol Step 2.2. |
| cytospin funnel | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocol Step 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | Protocol Step 2.2. |
| blank slide | Fisher Scientific | S95933 | Protocol Step 2.2. |
| hema 3 stain kit | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocol Step 2.2. |
| Bovine Dermal Colagen, type 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocol Step 3.2. |
| T25 flask | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocol Step 3.3. |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | Protocol Step 5.2. |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | Protocol Step 5.2. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocol Step 5.5. |
| Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | Protocol Step 5.5. |
| polycistonic lentivirus* | e.g. Millipore | SCR511 | Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocol Step 6.4. |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | GSC-6301G | Protocol Step 6.4. |
| hESC media | See recipe included in protocol | Protocol Step 6.11. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Protocol Step 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocol Step 6.11. |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Protocol Step 6.11. |
| hESC-qualified Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Protocol Step 6.13. |
| Corning plate, 6 well | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocol Step 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | Protocol Step 6.13. |
| 250 ml disposable filter flask (0.22 µm) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocol Step 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocol Step 7.3. |
| cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocol Step 7.4. |
| hESC Media** | Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min |
||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Final Concentration |
| KO replacement serum (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
- Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
- Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
- Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
- Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
- Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
- Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
- Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
- Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
- Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
- Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
- Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
- Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
- Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
- Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
- Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
- Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
- Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
- Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
- Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
- Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
- Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
- Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
- Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).
