Introduction
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческих образцов (hiPSCs) являются быстро развивающейся технологии исследований стволовых клеток. Они предлагают альтернативу эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) исследования с гораздо меньшим количеством этических и моральных недостатков 1,2. Несмотря на то, что они не эпигенетически идентичны ЭСК 3-5, hiPSCs предлагают уникальный способ моделирования развития и болезней фенотип, и они могут быть получены из тканей , имеющих отношение к болезненному состоянию 5-8. Новые методы генерации hiPSCs постоянно изучается в целях определения оптимальных типов клеток для начала, как способ подготовки GMP качества ИПСК подходящие для трансплантации, а также для повышения оперативности и эффективности процесса перепрограммирования 6,9-11.
Эпителиальных клеток дыхательных путей имеют решающее значение в развитии аллергического воспаления 12, и эпителий является основной движущей силой аллергических реакций и ремоделирования дыхательных путей через взаимодействие с Immunе и стромальных клеток. Эпителий дыхательных путях играет существенную роль в возникновении и настойчивости легочных заболеваний, таких как астма. Тем не менее, нижних дыхательных путей эпителиальные клетки трудно получить в клинической практике, особенно у здоровых пациентов контрольной группы и детей. Данные нескольких исследований подтверждают предположение , что эпителиальные клетки слизистой оболочки носа являются действительным и практичным прокси - сервер для нижних дыхательных путей эпителиальных клеток 13-20, особенно при изучении ответов на загрязнителей воздуха и аллергенов. Слизистую оболочку носа состоит из более чем 90% ресничная эпителиальных клеток дыхательных путей и отбор проб эти носовые эпителиальные клетки (НИКС) могут быть легко выполнены в детей в возрасте четырех лет или пять, так как она является менее инвазивным, чем другие методы отбора проб клеток / тканей и связано с минимальным риском развития побочных эффектов , таких как инфекции 20-23. Он предлагает быстрый и простой способ попробовать как здоровых, так и больных детей, оставшихся без длительного, ненужного, и часто болезненного бронхоскопии процедуры, применяемыеРез, которые требуют седации. Предыдущие исследования показали , что болезнь подтипы , связанные с тяжестью астмы можно выделить как в слизистой оболочке носа, а также образцы бронхиальных клеток , взятых у детей , страдающих астмой, и экспрессия генов между этими двумя типами тканей была одинаковой в примерно 90% не повсеместным генов 22 , 24. В качестве источника для ИПСК, НПВ, имеют преимущества перед другими часто используемыми типами клеток. Фибробласты часто используются для генерации иПСК, но хотя эти клетки могут легко быть выращены из биопсии кожи, этот процесс обычно требует местной анестезии, надрез, и шовные материалы, и связано с некоторым риском инфицирования. Таким образом, получения информированного согласия пациентов для этого типа биопсии может быть трудно 25. Одной из альтернатив фибробластов является мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Тем не менее, это может быть трудно получить достаточное количество крови для генерации иПСК от педиатрических больных. Кроме того, существуют ограничения нижнего течения ардля фибробластов складки и производных ИПСК клеток крови, в особенности их дифференциации способности к определенным типам клеток 5,26. Поэтому, учитывая относительную доступность и низкий риск побочных эффектов после их сбора, НИКС представляют собой идеальный источник клеток для генерации иПСК из педиатрической популяции.
иПСК получили много внимания в последнее время в качестве платформы для изучения развития человеческого потенциала, создавая новые модели заболеваний, и как потенциальный источник клеток для персонализированной терапии. Перед тем как полный потенциал этой технологии могут быть реализованы, молекулярные основ процесса перепрограммирования должны быть выяснены, но сейчас этот протокол и процедуры, изложенные в поясняют исследования исследований, направленных на дыхательных путях воздействия, а также обеспечить платформу для изучая эффекты персонализированной медицины с участием иПСК.
Совместная работа нескольких лабораторий привела к Generatioп успешной методики не только отбор проб слизистой оболочки носа, но и культивированием НИКС и перепрограммирования эти клетки ИПСК 23. В данной статье приводится краткое описание протокола для оптимального отбора образцов, культивирования и условий перепрограммирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол следует рекомендациям институтов человеческого комитета по этике.
1. Отбор проб слизистой оболочки полости носа
Примечание: Получение образцов из предметов, которые являются свободными от признаков респираторной вирусной инфекции.
- Приготовьте 15 мл коническую свежим перед участником визита и добавляют 2 мл BEGM (бронхиальные эпителиальные ростовая среда Cell) плюс 20 мкл стерильной Пенна / Стрептококковое / Fungizone (P / S / F), (0,01%).
- Открыть цитологии кисти непосредственно перед тем как взять пробу, и не забудьте сохранить кисть стерильной и не прикасайтесь к нему любых поверхностей, кроме носовых поверхностей.
- Попросите участников, чтобы сидеть неподвижно и наклонить голову в сторону потолка. Есть меньше или больше беспокойных детей сидеть на руках и / или лежа, чтобы избежать прихлопнул смахнуть.
- Цель кисти на задней части носа, где проход суживается (выглядит как небольшая черная дыра). Вставьте щетку вниз и скрутить запястья, как щетка удалена из Nostriл.
- Поместите щетку в конической и погрузить в BEGM. Отрежьте лишнюю кисть и заменить крышку на трубе. НЕ VORTEX.
Примечание: Если участник желает, получить вторую кисть таким же образом, но во втором ноздрю. Получение чистить щеткой обе ноздри приведет к более высокой вероятности того, что выборка будет успешным. Выборка же ноздрю может привести к кровотечению и не будет, вероятно, улучшит образец. - Хранить образцы как можно ближе к 37 ° С, как это возможно во время транспортировки, используя химический стакан с теплой водой.
2. Сотовый граф и Cytospin
- Аккуратно агитировать щетку в BEGM и возьмите 10 мкл образца для подсчета клеток с использованием гемоцитометра. Добавьте 10 мкл живого / мертвого пятна и рассчитывать только живые клетки под микроскопом.
- Принимать по 50 мкл образца и разбавляют до 200 мкл с помощью 1х PBS. Добавить в цитоспина воронку, присоединенную к стеклу и спина при 300 оборотах в минуту в течение 2 мин. Пусть скользят сухой O / N и морилки слайд followinИнструкция г изготовителя. Дайте высохнуть O / N, предпочтительно в темноте.
- Пятно слайдов с Хема 3 Stain
- Передача каждого раствора (Хема закрепитель, светло-голубой, Хема 3 Решение I, розовый, и Хема 3 Раствор II, темно-синий) в окрашивании блюдо; Хранить покрыты когда он не используется. Вставьте слайды в слайд окрашивания лодки
- Dip слайды непрерывно в фиксаторе в течение 30 секунд, затем дайте стечь избыток. Dip непрерывно скользит в растворе I в течение 30 секунд, затем дайте стечь избыток. Dip слайды непрерывно в растворе II в течение 30 секунд, затем дайте стечь избыток
- Полоскание деионизированной водой, пока вода не станет чистой. Дайте высохнуть O / N, предпочтительно в темноте
- Посмотрите на слайд под микроскопом и количества клеток, определяют процент эпителиальных клеток. Должно быть 90% или больше, если выборка хорошо.
3. Посев клеток
Примечание: Выполнить все процедуры клеточной культуры в правильной и сертифицированной культуре тканикапюшон с использованием стерильной техники.
- Coat пластины с бычьим коллагеном (Кожное BDC), тип 1. Добавить 0,5 мл 3 мг / мл НМТ разводили в 49,5 мл 1x PBS. Подготовьте менее, если будет использоваться только несколько пластин. Шерсть Т25 колбу с 2 мл НМТ и инкубировать в стерильных капот O / N или при температуре 37 ° С в течение 2 ч, при необходимости.
- После инкубации, аспирация оставшуюся жидкость. Expose колб УФ-светом в течение 30 минут в стерильных капот. Храните колбах на срок до одного месяца при 4 ° С, но довести их до комнатной температуры или 37 ° C перед посевом клеток.
- Держите щетку и клетки в BEGM при 37 ° С до готовности семян. Аккуратно взмах кисти внутри конической, но не вихря.
- Пластина 7 × 10 5 клеток в T25 колбу. Если есть меньше, использовать меньший контейнер, например, одну лунку 6-луночного планшета. Этот размер пластины требуется около 3 х 10 5 клеток.
Примечание: Если нет этого многие клетки, не рекомендуется продолжать.
- Пластина 7 × 10 5 клеток в T25 колбу. Если есть меньше, использовать меньший контейнер, например, одну лунку 6-луночного планшета. Этот размер пластины требуется около 3 х 10 5 клеток.
- Под капотом стерильной, возьмите щетку из трубки и геntly повернуть кисть на поверхности колбы с покрытием, соблюдая осторожность, чтобы не поцарапать покрытие. Выбросьте щетку в соответствующий контейнер для биологически опасных отходов.
- Медленно пипетку оставшиеся клетки в BEGM из конической и в T25 колбу. Обратите внимание на клетки под микроскопом. Будет наблюдаться ряд плавающих клеток и может быть некоторый мусор из носа, что приемлемо на данном этапе (рисунок 3 , а ).
4. Культура клеток
- После посева клеток, пусть они оседать в течение 48 часов без нарушения работы (рисунок 3). Через 48 ч медленно и осторожно добавляют 2 мл теплой BEGM и 20 мкл стерильной бензилпенициллин / стрептомицин / Fungizone (P / S / F).
ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ аспирация оригинал 2 мл среды. - На 4 - й день после посева, тщательно аспирата всю жидкость, и заменить 4 мл свежей, подогреваемые BEGM плюс 1x Pen / Strep (Fungizone больше не требуется). Изменение среды каждые два дня и оценить клетки для присоединятьния, роста и слияния. Когда клетки достигают ~ 80% слияния, как правило, через 2-3 недели, они будут готовы к пассировать.
- Одна T25 колбу (около 2,5 х 10 6 клеток , когда сливная) могут быть пассировать на три колбы Т25 или Т75 одной колбе. После первого прохода, клетки должны быть прочными и здоровыми, достигая впадения примерно каждые три дня.
5. пассирования клетки
- Аккуратно аспирата носитель из пластины. Добавить 1 мл 0,05% раствора трипсина на T25 колбу на пластине и место в инкубаторе в течение примерно 4 мин, или до тех пор, пока клетки не отделяются от пластины. Проверьте уровень отрыва клеток каждые 2 мин и не оставляют трипсина на дольше, чем 10 мин.
- Добавьте 5 мл трипсин нейтрализующим раствором (TNS) или сыворотки, содержащей носитель для нейтрализации фермента. Удалите всю жидкость и клетки из колбы и поместить в 15 мл коническую трубку.
- Центрифуга при 200g (ускорение 0 замедления 0) в течение 5 мин, чтобы получить клеточный осадок. Отберите supernaTant и ресуспендирования клеток в BEGM + P / S в объеме, требуемом для новых флаконах (4 мл для T25 колбу, 10 мл для T75 колбу)
- Выполните подсчет клеток с живой / мертвой пятно, как описано выше (2.1). Добавьте соответствующее количество BEGM и клеток в колбы с покрытием и возвращают в инкубатор. Поддерживать как подробно описано выше , или в криоконсервируют замораживания среды (70% BEGM, 20% FBS и 10% ДМСО) в концентрации 0,5-2 х 10 6 клеток на мл.
6. Перепрограммирование для ИПСК
Примечание: Перед созданием ИПСК, обеспечить соблюдение всех институциональных положений, регулирующих формирование и использование человеческих ИПСК. Стерильный метод особенно важен для IPSC культур, так как питательная среда обычно не содержит антибиотики. Крайне важно, чтобы НПВ кажутся здоровыми и робастно пролиферативная для успешного перепрограммирования.
- Пластина 5 × 10 5 НИКС на лунку 6 скважин тканевой культуры планшета. Через 24 часа, добавляют полибренчтобы BEGM до конечной концентрации 8 мкг / мл и трансдукции ИЭС путем добавления лентивирусов частиц, выражающих Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc к средствам массовой информации. Цель добиться множественности инфекции (MOI) от 5 ~ 27.
- Для определения MOI, готовят серийные разведения концентрированного-лентивирусов запаса и преобразовывают HT1080 клетки с этими разведений. После первого недвусмысленно обнаружения экспрессии dTomato в HT1080 клетках, вычисляют количество "трансдуцирующих единиц / мл", забив количество dTomato-позитивных клеток / небольшие скопления клеток в каждом разведении.
Примечание: Как правило, там будет разведений, которые слишком высоки (все dTomato положительный) и слишком низкая (ни один или только несколько положительных клеток). - Выполните скоринг из разведений, в котором зафиксировано дискретные положительных клеток / маленькие комочки клеток. Определить титр путем коррекции количества трансдукции ед / мл с соответствующим коэффициентом разбавления. MOI является то отношение числатрансдуцированных клеток к количеству вирусных частиц 27.
Примечание: Предполагается, что каждый dTomato позитивна клетка / маленький комок возникает из одной вирусной частицы.
- Для определения MOI, готовят серийные разведения концентрированного-лентивирусов запаса и преобразовывают HT1080 клетки с этими разведений. После первого недвусмысленно обнаружения экспрессии dTomato в HT1080 клетках, вычисляют количество "трансдуцирующих единиц / мл", забив количество dTomato-позитивных клеток / небольшие скопления клеток в каждом разведении.
- Около 3 ч после трансдукции, удалите материал и замените свежим BEGM. Откажитесь Лентивирус содержащих носитель с помощью институционально утвержденных процедур. Возвращение трансдуцированных НИКС в инкубаторе в течение 3-х дней.
- На 3-й день, замените носитель свежей BEGM, а затем инкубируют еще в течение 3-х дней. Отберите провел СМИ, мыть клетки с 1x PBS и добавляют 1 мл 0,05% раствора трипсина в скважину. Прохождение клетки с помощью трипсина, как написано выше (раздел 5). Тщательно аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 4 мл BEGM + P / S. Клетки могут быть пассировать в новую лунку 6-луночного планшета с покрытием с НМТ, или добавляют к MEF культурам, если готов к работе (см следующий шаг).
- Подготовка MEF пластин с покрытием. На 4-й день добавляют 0,1% раствор желатина (1 мл / лунку) 2 лунки 6 скважины (для выполнения +/- Thiazovivin (SPT) см шаг 6.6). На следующийдень оттепели флакон инактивированных MEFs 28.
- Поместите MEFs в 10 мл MEF сред (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Спин при 200g в течение 5 минут, чтобы осадить. Ресуспендируют в MEF СМИ. Отберите желатин из 6 - луночного планшета и добавить 1,87 х 10 5 MEFs на лунку желатин покрытием 6 - луночный планшет. Выдержите O / N при 37 ° С, или в течение минимум 24 часов.
- Передача 2 мл BEGM содержащих трансдуцированных клеток на лунку в 2 лунки предварительно покрытой пластины 6 и инкубировать O / N. На следующий день, замените BEGM 2,5 мл на лунку стандартных средах, содержащих чЭСК 4 нг / мл основного фактора роста фибробластов. Поток клеток свежей чЭСК СМИ +/- SPT ежедневно в течение 10 дней
Примечание: Можно добавить коктейль из малых молекул (SB431542, PD0325901 и Thiazovivin (SPT) коктейль) для повышения эффективности и кинетики перепрограммирования для ИЭС 23. - Через десять дней, продолжают кормить ежедневно с использованием чЭСК СМИ без СПТ. Кормите культур ежедневно до чЭСК подобных колонийпоявляются (рисунок 5A, P0 колонию). Определить колонии, несущие предположительные ИПСК их высокой ядра: цитоплазматический соотношение и выраженными ядрышками.
- Вручную акцизные и переноса колоний с чЭСК морфологией к отдельным скважинам для культуры и расширения в виде отдельных линий в фидерной системе без. Вырезанные колонии должны быстро адаптироваться к этим условиям.
- После того, как гальванических вырезают колоний эти дискретные мнимые линии IPSC в настоящее время считаются канал 1 (p1). Кормовые культуры ежедневно с mTeSR1. Прохождение и расширение IPSC линий с использованием стандартных процедур. Это может занять несколько дней до недели для p1 колонии достигают размеров, при которых они должны быть пассировать.
7. Поддержание ИПСК в культуре
- Корма и оценки культур ежедневно. Вручную акцизные зоны выставляется откровенного дифференциацию путем соскоба со стерильной стеклянной пипетки или микро кончика пипетки. Изменение средств массовой информации после ежедневного сбора.
- Прохождение клетки после того, как приближенииДЕТАЛЬ каждые четыре дня: Осторожно аспирата СМИ, добавляют 1 мл теплой диспазу (1 мг / мл) на лунку 6-луночного планшета (половина объема кормления), а затем инкубировать при температуре 37 ° С в течение примерно 4 мин. Края колоний начнут поднимать, который выглядит как белый контур вокруг колонии. Аккуратно аспирата диспазу и промыть 3 раза с подогреваемой DMEM / F12.
- Добавьте 2 мл mTeSR1 и использовать мобильный подъемник для подъема колоний от пластины. Используйте 5 мл серологические пипетки или P1000 микропипетки осторожно растирают клетки, пока колонии не будут разбиты на более мелкие кластеры.
- Избегайте производить очень маленькие группы или отдельные клетки, а выживание и последующее распространение будет неоптимальным. При повторном металлизированный колонии, 1: с 4 до 1: 6 сплит будет поддерживать оптимальную плотность колоний. Осторожно удалите колонии и среды от плиты и добавить новые, покрытые матригелем скважин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Начальная часть носа, называется преддверия носа, является область окружена хряще 29. Кисть должна идти гладко мимо этой области носа, за носового клапана (устьем Internum, или "черную дыру" видели в задней части НАРЭ), и образец получается из нижней носовой раковины (рис 1). Носовых раковинах костные структуры , которые увеличивают площадь поверхности носа 29, что делает их идеальным местом для отбора проб. В районе также выстлана васкуляризированной ткани слизистой оболочки, которая близко напоминает обкладки нижних дыхательных путей и также активно участвует в иммунной реакции на воздействия окружающей среды.
Отбор проб правильную ткань гарантирует, что клетки, которые перепрограммировать являются эпителиальные клетки. Это можно оценить с помощью начального числа клеток и цитоспина, но и путем наблюдения клеток в культуре.цитоспина, один раз осаждали, сушат и окрашивают, показывает состав образца. Большинство образцов состоят из эпителиальных клеток, которые являются столбчатые и реснитчатые, с одним круглым ядром. С помощью комплекта пятен Хема 3, они окрашиваются в светло - голубой цвет с более темным фиолетовым ядром (Рисунок 2), и часто , когда берется непосредственно из носа они видели слипаются вместе. Несмотря на то, назальные Образцы клеток первоначально смесь типов клеток, а также мусор из носа, с течением времени в культуре и с изменениями медиа, эпителиальные клетки становятся преобладающими (рис 3А, В). Когда эпителиальные клетки растут до слияния, они имеют такую форму , как только что треснувшего яйца, где ядро большой и расположен в центре и цитоплазма является своего рода "охвата" и растяжения , как клетка готовится разделить (рис 3B). По мере того как клетки растут вместе, они начинают брать на себя больше футбольной формы, и подходят друг к другу плотно в блюдо (рис3C).
После того, как клетки трансдуцированных, они выражают tdTomato флуоресцентный маркер в ядре. На рисунке 4 показаны клетки , когда они были трансдуцированных, в светлое поле, флуоресценцию и оба изображения объединяются. Не каждая клетка выражает маркер, и поэтому не каждая клетка была трансдуцированная, но каждая скважина должна иметь около 90 процентов эффективности трансдукции, и это увеличит вероятность того, что некоторые клетки будут достигать плюрипотентности после высевают на MEFs.
После того, как совместно культивировали с MEFs и как клетки начинают образовывать колонии, они будут постепенно прекратить выражать tdTomato. Тем не менее, это не является лучшим показателем образования колоний. Лучшим показателем формирования колонии является визуальное подтверждение. чЭСК колонии, которые являются "золотым стандартом" плюрипотентности, в основном круглые и состоят из множества маленьких, круглых клеток с LARGе ядра и высокое ядро соотношение цитоплазме. Каждая клетка появляется в основном состоят из ядер и других органелл, не видны. После IPSC урожая колонии и культуры в стандартных фидерных свободных условиях, вновь образованные IPSC колонии должны выглядеть так же, как их коллеги чЭСК, и отдельные клетки практически идентичны фенотипа чЭСК, как показано на рисунке 5В.
Прежде чем использовать иПСК генерироваться из носовых эпителиальных клеток (NEC-ИПСК) в экспериментах, рекомендуется оценить качество новых линий. Это, как правило, включает в себя оценку кариотипа, экспрессия маркеров плюрипотентности, а также способность ИПСК дифференцироваться в каждой из 3-х эмбриональных зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы). Емкость Дифференциация может быть проверена во многих отношениях, но в настоящее время самым строгим анализ является анализ тератомы 2,23,30. Более полные анализы, такие как транскрипционные и эпигеномном профилирование полезны для определения того , введены перепрограммированием 23 любые хромосомные аномалии.
Рисунок 1. Движение нижней носовой раковины. Отбор проб и целевой выборки, нижняя носовая, обозначается черной стрелкой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Cytospin. Большая часть образца состоит из эпителиальных клеток, которые являются длинными и столбчатый, с ресничек на одном конце и круглого ядра на другом. Они часто слипаются вместе, когда пробы непосредственно из НАРЭ. Стрелки указывают на отдельные эпителиальные клетки."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Первичные носовые эпителиальные клетки в культуре. (A) Плавающие клетки и мусор только после того, как образец собирается и хромирование. (B) Клетки один день после того , как пассировать. Морфология клеток согласуется и культура в основном состоит из носовых эпителиальных клеток, 10 - кратным увеличением, и (С) 5X увеличения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Трансдукция ИЭС. Клетки будучи трансдуцированная подхватили вектор и показать красную флуоресценцию маркера tdTomato. Этот маркер должен исчезать по мере их продвижения в направлении плюрипотентных государства. (A) Светлое поле образ трансдуцированных клеток. (В) флуоресцентное изображение трансдуцированных клеток. (C) Накладка светлого поля и флуоресцентных изображений (панели А и В). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. IPSC стволовых клеток , как колонии. (А) Выращивание на MEFs, колония в основном круглые по краям и показывает практически нет дифференциации. (B) Отдельные клетки демонстрируют типичные чЭСК морфологию, с маленькими круглыми клетками с крупными ядрами.5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Носовые эпителиальные клетки (НПВ) являются доступными платформой для изучения заболеваний дыхательных путей, а также NEC-иПСК предлагают захватывающий авеню , чтобы исследовать развитие болезни, лечение и терапию 1,31,32. НИКС могут быть легко получены без стрессовых или потенциально вредных процедур 6,23. По нашему опыту, отбор проб слизистой оболочки носа, как описано в данном протоколе, как представляется, менее напряженным и лучше воспринимается, чем сбор крови для детей. Таким образом, этот метод может оказаться особенно полезным в популяциях больных детей и отношение к изучению заболеваний дыхательных путей. Другим преимуществом является то, что ИЭС, когда они находятся в культуре, эпителиальные клетки выбирают для со средствами массовой информации и условий культивирования и стать однородной. Это выгодно, чем использование сложной ткани, такие как клетки крови и делает его легче оценить влияние клеточного происхождения в результате IPSC линий с использованием транскриптомных и эпигенетических подходов.
когдаотбор проб слизистую оболочку носа, важно , что правильная область носа оцифровывается так , что в основном эпителиальные клетки извлекаются, о чем свидетельствует просмотр цитоспина под микроскопом (рисунок 2). Правильная выборка даст ≥90% эпителиальные клетки. Очень важно, чтобы получить образцы от здоровых пациентов, и, чтобы гарантировать, что образец собирают надлежащим образом для того, чтобы максимально увеличить количество клеток, полученную и высевают. Движение скручивание описано в разделе 1.5 (протокол), гарантирует, что щетка входит в контакт с, как большая часть поверхности носовой, насколько это возможно. Это естественный рефлекс, чтобы превратить свою голову, когда посторонний предмет движется к своему лицу. Поэтому, в том случае, если ребенок поворачивает его голову или отрывается, важно, что отбор проб происходит быстро и точно. С помощью этих методов позволит повысить эффективность любого другого шага протокола, и определить вероятность успешного перепрограммирования. Попросив ребенкалечь, и даже поставить свои руки под ними или иметь один из родителей или братьев и сестер держать свои руки это хороший способ, чтобы побудить их лежать неподвижно и, чтобы помочь гарантировать плавный и безболезненный сбор образцов.
В последнее время некоторые другие методы отбора проб были оценены для комфорта, легкости и примеров результатов, на основе содержимого ячейки и композиции, а также РНК и ДНК дает 33. Группа рассмотрела выборку с цитологической щетки в сравнении с полиэфирным тампоном, и они оба пробы нижней носовой, а также передние ноздрей энергично закрученного кистью или тампоном вокруг ноздрей. Отбор проб нижней носовой раковины с помощью кисти было установлено, что немного неудобно, хотя это действительно дают наилучшие урожаи РНК и состояла из самых ресничных эпителиальных клеток, по сравнению с полиэфирным тампоном. Метод, предложенный в этом протоколе, таким образом, проверяется, как наиболее надежный метод выборки носовые эпителий как способ изучения дыхательной проходимости дыхательных путейэпителий.
После того, как образец получается, она должна поддерживаться на уровне 37 ° С. Одним из наиболее эффективных способов является нагреть стакан воды до более чем 37 ° C и прижимаются его в пенопластовый контейнер для безопасной транспортировки во время подготовки для удовлетворения участника. Непосредственно перед тем образец собирают, добавьте холодную воду, так что температуру поднимают до приблизительно 37 ° С, и добавляют коническую трубку со средствами массовой информации. Когда кисть добавляют в коническую пробирку, возвращают трубку непосредственно в ванну с водой и держать его там до тех пор, пока не может быть возвращен в лабораторию, после чего трубка должна быть помещена в регулируемом ванну 37 ° C водой до тех пор, пока клетки не являются высевали в культуральной колбе. Во всех точках, стерильность следует использовать, чтобы избежать введения чужеродных агентов в культуру.
Значительное количество изменчивости среди образцов был замечен, когда клетки были введены в культуру. Эта изменчивость, казалось, проистекают из обоих источников доноров, а такжесамо качество образца. Одним из способов повышения качества образца является получение одной кисти от каждой ноздре, или две щетки для каждого участника. После засева свежий образец, а так как клетки пассируют, состояние клеток следует регулярно контролировать, чтобы убедиться, что они подходят для перепрограммирования. Клетки, которые делают лучших кандидатов являются те, которые принимают к культуре и размножаться быстро. Не известно, почему клетки от некоторых доноров являются более надежными, чем из других клеток, но это может быть из-за таких факторов, как возраст, размер носа, а также состояния здоровья донора в момент отбора проб. Когда образец доходности очень мало клеток, или же лишь небольшое число клеток высевали раз с присоединением, образец вряд ли будет расти до слияния. Если культура борется делает достичь слияния, клетки имеют тенденцию быть слабыми и многие клетки умирают во время пассирования. Этот тип выборки является очень плохим кандидатом для перепрограммирования, поскольку важно, чтобы клетки быть быстро и энергично пролиферирующие, и что онитрансдуцированная в кратчайшие возможные числа прохода. Не рекомендуется для трансфекции клеток, которые растут медленно, связано ли это с изменчивостью доноров, плохой отбор проб, или пересева культур слишком тонким. Если перепрограммирование попытка с бедной клеточной культуре, то вряд ли приступить к осуществлению.
Подготовка клеток для трансдукции является частью протокола, который является наиболее трудным для подготовки. На основе роста клеток, 2 х 10 5 до 5 × 10 5 клеток предлагаются для трансдукции и это может зависеть от конкретных образцов пациентов. Поэтому может потребоваться несколько скважин с гальваническим покрытием из различного количества клеток, чтобы получить идеальное число.
Этот протокол описывает не только легкость выборки, но и относительную легкость и сроки установления первичных клеточных культур, а также последующее перепрограммирование этих первичных клеточных культур до IPSC линий для более устойчивых и универсальных возможностей в области исследований. ЦеликомПроцесс от клиники к созданию дискретных ИПСК в культуре занимает около 3 -х месяцев, а также новые способы сокращения времени перепрограммирования разрабатываются 6,34,35. Это поле быстро развивается, чтобы найти более эффективные и полные пути для преобразования первичных клеток к ИПСК, и впоследствии дифференцируются ИПСК в определенные клеточные и тканевые типов, представляющих интерес. Тем не менее, дифференцировка протоколы для тканей , важных для заболеваний дыхательных путей, таких как эпителий легких, все еще разрабатываются 36-38.
Генерирование ИПСК из ИЭС имеет преимущество простой и относительно безболезненно выделения клеток. Кроме того, вполне возможно, что NEC-иПСК имеют преимущества перед ИПСК, полученных из других типов тканей, которые могут быть использованы. Влияние IPSC эпигенетике на последующей дифференциации иПСК не до конца понятен, хотя данные свидетельствуют о том, что мыши и человека иПСК гавани транскрипционный и эпигенетическую память об их соматической клеткиПроисхождение и что это селективно способствует их дифференциации в родословных , связанных с типом клеток донора в то время как другие ограничения судьбы 5,26. Ввиду важности ткани происхождения, и как это влияет на функциональные свойства ИПСК, особенно в отношении к сохранению тканеспецифических эпигенетических 39-45, IPSC линии должны быть более четко изучены для того , чтобы лучше понял воздействие ткани происхождения. Ранее было показано , что NEC полученные из иПСК гавани геномного метилирования подпись , указывающую сохранение эпигенетическом памяти их ткани происхождения 23. Такая эпигенетической памяти сохраняется в NEC-ИПСК может быть полезным в дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в клетки дыхательных путей, как и предыдущие исследования показали, что полученные клетки крови ИПСК, проявляющие эпигенетическую память клеток крови происхождения более легко дифференцируются в клетки крови, чем фибробластами или гладких мышц, полученных иПСК, не имеющие Blood для соты эпигенетическое памяти 5,26. Учитывая огромный потенциал IPSC-клеток, полученных в дыхательных путях при заболеваниях легких моделей, это будет иметь большое значение для изучения НИКС представляют ли оптимальный тип клеток для дифференциации ИПСК в дыхательные пути клеток / ткани. Кроме того, это стабильно сохраняется память может представлять хромосомные местах, устойчивых к перепрограммированию и кандидатов для лечения болезни состояний донорских клеток. Как протоколы для преобразования ИПСК проксимальных и дистальных типы клеток легких развиваются 36-38, эти NEC-иПСК могут иметь преимущество при заболеваниях дыхательных путей моделирования , таких как астма, ХОБЛ, кистозный фиброз, и многие другие , а также в изучении экологических последствий для развития легких и гомеостаз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить плюрипотентных стволовых клеток Facility и конфокальной микроскопии керн при Детской больницы Цинциннати. Эта работа была поддержана R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) и 2U19AI70235 (GKKH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocol Step 1.1. |
| BEGM | Lonza | CC-3170 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocol Step 4.a. |
| cytosoft cytology brush | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocol Step 1.2. |
| trypan blue | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocol Step 2.1. |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocol Step 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocol Step 2.2. |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | Protocol Step 2.2. |
| cytospin funnel | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocol Step 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | Protocol Step 2.2. |
| blank slide | Fisher Scientific | S95933 | Protocol Step 2.2. |
| hema 3 stain kit | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocol Step 2.2. |
| Bovine Dermal Colagen, type 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocol Step 3.2. |
| T25 flask | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocol Step 3.3. |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | Protocol Step 5.2. |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | Protocol Step 5.2. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocol Step 5.5. |
| Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | Protocol Step 5.5. |
| polycistonic lentivirus* | e.g. Millipore | SCR511 | Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocol Step 6.4. |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | GSC-6301G | Protocol Step 6.4. |
| hESC media | See recipe included in protocol | Protocol Step 6.11. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Protocol Step 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocol Step 6.11. |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Protocol Step 6.11. |
| hESC-qualified Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Protocol Step 6.13. |
| Corning plate, 6 well | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocol Step 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | Protocol Step 6.13. |
| 250 ml disposable filter flask (0.22 µm) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocol Step 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocol Step 7.3. |
| cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocol Step 7.4. |
| hESC Media** | Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min |
||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Final Concentration |
| KO replacement serum (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
- Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
- Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
- Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
- Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
- Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
- Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
- Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
- Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
- Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
- Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
- Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
- Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
- Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
- Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
- Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
- Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
- Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
- Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
- Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
- Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
- Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
- Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
- Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).
