Introduction
Induserte pluripotente stamceller fra humane prøver (hiPSCs) er en rask utvikle teknologi for stamcelleforskning. De tilbyr et alternativ til embryonale stamceller (hESC) forskning med langt færre etiske og moralske ulemper 1,2. Selv om de ikke er identiske med epigenetiske hESCs 3-5, hiPSCs tilbyr en unik måte for å modellere utvikling og sykdoms fenotyper, og de kan være avledet fra vev som er relevante for den sykdomstilstanden 5-8. Nye metoder for å generere hiPSCs blir stadig utforsket å identifisere optimale celletyper til å begynne med, som en måte å forberede GMP kvalitet iPSCs egnet for transplantasjon, og også for å øke punktligheten og effektiviteten av omprogrammering prosessen 6,9-11.
Luftveis-epitelceller er kritiske for utviklingen av allergisk inflammasjon 12 og epitelet er en viktig driver av allergiske responser og luftvei remodellering gjennom interaksjon med immune og stromale celler. Luftveisepitelet spiller en avgjørende rolle i opprinnelsen og utholdenhet av lungesykdommer som astma. Imidlertid nedre luftveier epitelceller er vanskelig å oppnå i et klinisk miljø, spesielt fra friske kontroll pasienter og barn. Data fra flere studier støtter forutsetningen at epitelceller fra neseslimhinnen er en gyldig og praktisk proxy for nedre luftveis epitelceller 13-20, spesielt når studere reaksjoner på luftforurensning og allergener. Neseslimhinnen består av mer enn 90% ciliated Airway epitelceller og prøvetaking disse nese epitelceller (NEC) kan lett utføres i barn så unge som fire år gammel eller fem, som det er mindre invasiv enn andre celle / vev sampling teknikker og er assosiert med minimal risiko for bivirkninger som infeksjon 20-23. Det tilbyr en rask og enkel måte å smake både friske og syke barn uten lang, unødvendig, og ofte smertefull bronkoskopi procedures som nødvendig sedasjon. Tidligere studier har funnet at sykdoms subtyper relatert til astma alvorlighetsgrad kan skilles i begge neseslimhinnen, så vel som bronkial celleprøvene tatt fra astmatiske barn, og genekspresjon mellom de to typer vev var lik i omtrent 90% av ikke-allestedsnærværende gener 22 , 24. Som en kilde for iPSCs, NEC har fordeler fremfor andre ofte benyttes celletyper. Fibroblaster er ofte brukt for IPSC generasjon, men selv om disse cellene lett kan bli dyrket fra en hud biopsi, denne prosessen krever typisk lokalbedøvelse, et innsnitt, og suturer, og er forbundet med en viss risiko for infeksjon. Derfor innhente informert samtykke fra pasienter for denne typen biopsi kan være vanskelig 25. Et alternativ til fibroblaster er perifere mononukleære blodceller (PBMC). Imidlertid kan det være vanskelig å få nok blod for IPSC generasjon fra pediatriske pasienter. I tillegg er det begrensninger i nedstrøms apkasjoner for fibroblast og blodceller avledet iPSCs, spesielt deres differensiering kapasitet til visse celletyper 5,26. Derfor, gitt den relative tilgjengelighet og lav risiko for bivirkninger etter sin samling, NEC representerer en ideell celle kilde for IPSC generasjon fra pediatriske populasjoner.
iPSCs har fått mye oppmerksomhet den siste tiden som en plattform for å studere menneskelig utvikling, genererer nye sykdomsmodeller, og som en potensiell kilde til celler for personlig terapi. Før det fulle potensialet i denne teknologien kan realiseres, de molekylære grunnlaget for omprogrammering prosessen må bli belyst, men for nå denne protokollen og prosedyrene beskrevet innenfor vil belyse de undersøkelser fokusert på luftveis eksponeringer, samt gi en plattform for studere effekten av personlig medisin involverer iPSCs.
Et samarbeid mellom flere laboratorier har ført til genen for en vellykket teknikk for ikke bare prøvetaking neseslimhinnen, men også dyrking av NEC, og omprogrammering disse cellene til å iPSCs 23. Denne artikkelen gir en oversikt over en protokoll for optimal prøvetaking, dyrking, og omprogrammering forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll følger retningslinjene for institusjoner menneskelige forskningsetisk komité.
1. Prøvetaking neseslimhinnen
MERK: Skaffe prøver fra personer som er fri for tegn på luftveis virusinfeksjon.
- Forbered en 15 ml konisk frisk før deltakeren besøk og tilsett 2 ml BEGM (bronkial epitelcelledifferensiering vekstmedium) pluss 20 mL sterilt Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- Åpne cytologi børste like før du tar prøven, og sørg for å holde penselen sterile og ikke røre det til alle overflater i tillegg til nese overflater.
- Be deltaker til å sitte stille og bøye hodet opp mot taket. Har mindre eller mer urolige barn sitte på hendene og / eller liggende for å unngå slå i hjel børste bort.
- Sikt børste på baksiden av nesen der passasjen smalner (ser ut som en liten svart hull). Skyv børsten ned og vri håndleddene som børsten blir fjernet fra nostril.
- Plasser børsten i konisk og senk i BEGM. Skjær av overflødig børste og erstatte hetten på tube. IKKE VORTEX.
MERK: Hvis deltakeren er villig, få en andre børste på samme måte, men i den andre neseboret. Innhenting av en børsting av begge neseborene vil resultere i en høyere sannsynlighet for at prøvetaking vil bli vellykket. Prøvetaking den samme nesebor kan føre til blødning og vil sannsynligvis ikke forbedre prøven. - Oppbevare prøver så nær 37 ° C som mulig under transport ved hjelp av et begerglass med varmt vann.
2. Cell Count og Cytospin
- Beveg børsten i BEGM og ta 10 mL av prøven for et celletall ved hjelp av en hemacytometer. Tilsett 10 mL av en levende / død flekken og teller bare leve cellene under et mikroskop.
- Ta 50 ul av prøven og fortynn til 200 pl med 1 x PBS. Legg til cytospin trakt festet til glass slide og spinn ved 300 rpm i 2 min. La skyver tørr O / N og beis lysbilde following produsentens anvisninger. La det tørke O / N, fortrinnsvis i mørket.
- Stain Slide med Hema tre flekken
- Overfør hver løsning (Hema fiksativ, lyseblå, Hema 3 Solution jeg, rosa, og Hema 3 Solution II, dyp blå) i en flekker rett; Hold dekket når den ikke er i bruk. Sett glir inn lysbilde flekker båt
- Dypp lysbilder kontinuerlig i fiksativ i 30 sek, deretter la overflødig å renne. Dip glir kontinuerlig i Solution jeg i 30 sek, deretter la overflødig å renne. Dip glir kontinuerlig i Solution II i 30 sek, deretter la overflødig å drenere
- Skyll med avionisert vann inntil vannet er klart. La det tørke O / N, fortrinnsvis i mørket
- Se på skyve under mikroskop og telle celler, bestemme prosentandel av epitelceller. Bør være 90% eller mer hvis prøvetaking er bra.
3. Seeding Cells
MERK: Utfør alle cellekultur prosedyrer på en forsvarlig og sertifisert vev kulturhetten med steril teknikk.
- Coat plater med Bovine Dermal Collagen (BDC), type 1. Legg 0,5 ml 3 mg / ml BDC fortynnet i 49,5 ml 1x PBS. Fremstille mindre om bare noen få plater vil bli brukt. Belegge en T25-kolbe med 2 ml BDC og inkuber i steril hette O / N eller ved 37 ° C i 2 timer, om nødvendig.
- Etter inkubering aspireres eventuell gjenværende væske. Expose kolber til UV-lys for 30min i steril hette. Lagre flasker for inntil en måned ved 4 ° C, men ta dem med til RT eller 37 ° C før såing celler.
- Hold pensel og celler i BEGM ved 37 ° C til den er klar til frø. Forsiktig kul ut børste innvendig konisk, men gjør ikke virvelen.
- Plate 7 x 10 5 celler i en T25-kolbe. Hvis det er mindre, bruke en mindre beholder, for eksempel en brønn i en 6-brønns plate. Denne størrelsen plate krever ca 3 x 10 5 celler.
MERK: Hvis det ikke er så mange celler, er det ikke tilrådelig å fortsette.
- Plate 7 x 10 5 celler i en T25-kolbe. Hvis det er mindre, bruke en mindre beholder, for eksempel en brønn i en 6-brønns plate. Denne størrelsen plate krever ca 3 x 10 5 celler.
- Under en steril hette, ta børsten ut av røret og gently rotere børste på overflaten av den belagte kolbe, være forsiktig så du ikke riper i belegget. Kast pensel i en passende avfallsbeholder.
- Sakte pipette de gjenværende cellene i BEGM ut av den koniske og inn i T25-kolbe. Observer cellene i henhold mikroskop. Et antall flytelegemer vil bli observert, og det kan være noen rester fra nesen, som er akseptabelt på dette stadium (figur 3A).
4. Cell Culture
- Etter såing celler, la dem bosette i 48 timer uten avbrudd (figur 3). Etter 48 timer, sakte og forsiktig tilsett 2 ml varm BEGM og 20 ul sterilt penicillin / streptomycin / Fungizone (P / S / F).
MERK: IKKE aspirer de opprinnelige 2 ml media. - Den 4. dagen etter såing, nøye aspirer all væske, og erstatte med 4 ml fersk, varmet BEGM pluss 1x Pen / Strep (Fungizone er ikke lenger nødvendig). Endre media annenhver dag og vurdere celler for festement, vekst, og samløpet. Når cellene når ~ 80% samløpet, vanligvis i 2-3 uker, er de klare til å bli passert.
- En T25-kolbe (ca. 2,5 x 10 6 celler når sammenflytende) kan bli passert i tre T25 kolber eller en T75-kolbe. Etter den første gangen, bør cellene være robust og sunn, og nådde samløpet ca hver tredje dag.
5. aging Cells
- Forsiktig aspirer media fra platen. Tilsett 1 ml 0,05% Trypsin løsning per T25 kolbe til plate og plass i inkubatoren i ca 4 min, eller til cellene løsner fra platen. Sjekk nivået på avløsning av celler hver 2 min og ikke la Trypsin på lenger enn 10 min.
- Tilsett 5 ml Trypsin nøytraliserende løsning (TNS), eller seruminneholdende medium for å nøytralisere enzymet. Fjerne all væske og celler fra kolben og plasser i et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger ved 200 xg (akselerasjon 0 0 retardasjon) i 5 minutter for å oppnå en cellepellet. Sug supernaste og resuspender cellene i BEGM + P / S i volumet som kreves for de nye kolber (4 ml for en T25 kolbe, 10 ml for en T75 kolbe)
- Utfør celletall med et levende / død flekken som beskrevet ovenfor (2.1). Legg passende mengde BEGM og celler til de belagte kolber og gå tilbake til inkubatoren. Oppretthold som detaljert ovenfor, eller fryse ned i frysemedium (70% BEGM, 20% FBS og 10% DMSO) i en konsentrasjon på 0,5-2 x 10 6 celler pr ml.
6. Omprogrammering til iPSCs
MERK: Før generere iPSCs, sikre etterlevelse av alle institusjonelle bestemmelser om produksjon og bruk av menneskelige iPSCs. Steril teknikk er spesielt viktig for IPSC kulturer, som kulturmedium ikke rutinemessig inneholde antibiotika. Det er viktig at NEC skal vises sunn og er robust proliferativ for vellykket omprogrammering.
- Plate 5 x 10 5 NEC per brønn i en 6 brønners vevskulturplate. Etter 24 timer, legger polybrenetil BEGM til en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml og transdusere NEC ved tilsetning av lentivirale partikler som uttrykker Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc til media. Mål å oppnå et mangfold av infeksjon (MOI) på ~ 5 27.
- For å bestemme MOI, forberede serielle fortynninger av konsentrert-lentiviral lager og transduce HT1080 celler med disse fortynninger. Etter første utvetydig påvisning av dTomato uttrykk i HT1080 celler, beregne antall "transduse enheter / ml" etter scoring antall dTomato-positive celler / små klumper av celler i hver fortynning.
MERK: Vanligvis vil det være fortynninger som er for høy (alt er dTomato positiv) og for lavt (ingen eller bare et par positive celler). - Utfør scoring fra fortynninger hvor diskrete positive celler / små klumper av celler er identifisert. Bestemme titeren ved å korrigere antall overførende enheter / ml med fortynningsfaktoren. MOI er da forholdet mellom antallav transduserte celler til antall viruspartikler 27.
MERK: Hver dTomato positiv celle / liten klump antas å oppstå fra en enkelt virus partikkel.
- For å bestemme MOI, forberede serielle fortynninger av konsentrert-lentiviral lager og transduce HT1080 celler med disse fortynninger. Etter første utvetydig påvisning av dTomato uttrykk i HT1080 celler, beregne antall "transduse enheter / ml" etter scoring antall dTomato-positive celler / små klumper av celler i hver fortynning.
- Om tre timer etter transduksjon, fjerne media og erstatte med frisk BEGM. Kast lentivirus holdige medier med institusjonelt-godkjente prosedyrer. Returner omsatte NEC til inkubatoren i 3 dager.
- På dag tre, erstatte media med frisk BEGM, og deretter inkuberes i ytterligere 3 dager. Aspirer brukt media, vask cellene med 1 x PBS og tilsett 1 ml 0,05% trypsinoppløsning til brønnen. Passage celler med Trypsin som skrevet ovenfor (kapittel 5). Nøye aspirer supernatanten og resuspender cellene i 4 ml BEGM + P / S. Celler kan bli passert i en ny brønn i en 6-brønners plate belagt med BDC, eller tilsettes til MEF kulturer, hvis klar (se neste trinn).
- Forbered MEF belagte plater. På dag fire legge 0,1% gelatin løsning (1 ml / brønn) til 2 brønner på en seks godt (for å utføre +/- Thiazovivin (SPT) se trinn 6.6). På den nestedag, tine en ampulle med inaktiv MEFs 28.
- Plasser MEFs i 10 ml MEF media (DMEM + 1x NEAA + 10% DFCS). Spin 200 xg i 5 min til pellet. Resuspender i MEF media. Sug gelatin fra 6 brønn plate og tilsett 1,87 x 10 5 MEFs per brønn av gelatin-belagt seks brønn plate. Inkuber O / N ved 37 ° C, eller i minimum 24 timer.
- Overfør 2 ml BEGM inneholder transduced celler per brønn inn i 2 brønner på en tidligere belagt seks brønn plate og inkuber O / N. På den neste dag, erstatte BEGM med 2,5 ml per brønn av standard hESC media inneholdende 4 ng / ml basisk fibroblast vekstfaktor. Mate celler med frisk hESC media +/- SPT daglig i 10 dager
MERK: Det er mulig å legge til en cocktail av små molekyler (SB431542, PD0325901, og Thiazovivin (SPT) cocktail) for å forbedre effektiviteten og kinetikk av omprogrammering for NEC 23. - Etter ti dager, fortsette å mate daglig bruker hESC media uten SPT. Mate kulturer daglig inntil hESC-lignende koloniervises (Figur 5A, P0 koloni). Identifisere kolonier skjuler antatte iPSCs av sin høye kjerne: cytoplasma ratio og fremtredende nukleoli.
- Manuelt avgifter og overføre kolonier med hESC-lignende morfologi å skille brønner for kultur og ekspansjon som separate linjer i en mater fritt system. Skåret kolonier bør tilpasse seg raskt til disse forholdene.
- Etter plating skåret kolonier disse diskrete antatte IPSC linjer anses nå passasje 1 (p1). Fôr kulturer daglig med mTeSR1. Passage og utvide IPSC linjer ved hjelp av standard prosedyrer. Det kan ta flere dager til en uke for p1 kolonier å nå hvilken størrelse de skal passeres.
7. Vedlike iPSCs i Kultur
- Fôr og evaluere kulturer daglig. Manuelt avgifts områder stiller overt differensiering ved å skrape med en steril glass pipette eller mikro pipette tips. Endre media etter daglig plukking.
- Passage celler etter den tilnærmetdelbart etter fire dager: Forsiktig aspirer media, tilsett 1 ml varm dispase (1 mg / ml) per brønn i en 6-brønns plate (halvparten av mate volum), og deretter inkuberes ved 37 ° C i ca 4 min. Kantene av koloniene vil begynne å løfte, som ser ut som en hvit omriss rundt kolonien. Forsiktig aspirer Dispase og vask 3x med varmet DMEM / F12.
- Tilsett 2 ml mTeSR1 og bruke en celle løfteren å løfte koloniene fra platen. Bruk en 5 ml serologisk pipette eller P1000 Mikropipette å forsiktig triturer cellene til koloniene er brutt opp i mindre grupper.
- Unngå å produsere svært små klynger eller enkeltceller, som overlevelse og påfølgende spredning vil være sub-optimal. Når re-plating kolonier, en 1: 4 til 1: Det vil seks split opprettholde optimal kolonien tetthet. Fjern forsiktig kolonier og media fra platen og legg til nye, Matrigel-belagte brønner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den innledende del av nesen, kalt nese vestibyle, er det området som er omgitt av brusk 29. Børsten må gå jevnt forbi dette området av nesen, utover neseventilen (ostium internum, eller den "sorte hull" sett på baksiden av nblir), og prøven blir oppnådd fra det mindreverdige turbinate (figur 1). Nesemusling er beinstrukturer som øker overflatearealet av nesen 29, noe som gjør dem til et ideelt sted for prøvetaking. Området er også omgitt av vaskularisert mucosal vev, som ligner fôr av nedre luftveier og er også aktiv i immunresponsen mot miljømessige eksponeringer.
Prøvetaking riktig vev sørger for at cellene som er omprogrammeres er epitelceller. Dette kan evalueres ved den initielle celletall og cytospin, men også ved å observere cellene i kultur. Decytospin, en gang spunnet ned, tørket og farget, viser sammensetningen av prøven. De fleste prøvene består av epitelceller, som er søyleformet og prikk, med en rund kjerne. Med Hema 3 flekken kit, beis de en lys blå farge med en mørkere lilla kjerne (figur 2), og ofte når det tas direkte fra nesen de er sett klumpet seg sammen. Selv om nasale celleprøver er i utgangspunktet en blanding av celletyper, så vel som rester fra nesen, med tiden i kultur og med medier som er byttet, epitelcellene blir dominerende (figur 3A, B). Når epitelceller vokser til samløpet, de er formet som en fersk sprakk egg, der kjernen er stor og ligger i sentrum og cytoplasma er slags "nå ut" og strekker seg så cellen forbereder seg på å dele (figur 3B). Som cellene vokse sammen, begynner de å ta på seg mer av en fotball form, og passer sammen tett i fatet (Figur3C).
Når cellene blir omformet, vil de uttrykke tdTomato fluoriserende fargestoff i kjernen. Figur 4 viser cellene når de har blitt omformet, i lyse felt, fluorescens og med både bilder slått sammen. Ikke hver celle uttrykker markør, og derfor ikke hver celle ble omformet, men hver brønn bør ha om lag 90 prosent transduksjon effektivitet, og dette vil øke sannsynligheten for at noen celler vil oppnå pluripotency etter å ha blitt belagt på MEFs.
Når co-kultivert med MEFs og som cellene begynner å danne kolonier, vil de gradvis slutte å uttrykke tdTomato. Imidlertid er dette ikke den beste indikasjonen på kolonidannelse. Den beste indikasjonen på kolonidannelse er visuell bekreftelse. hESC kolonier, som er "gullstandarden" av pluripotency, er for det meste rundt og er sammensatt av mange små, runde celler med large kjerner og en høy kjernen til cytoplasma-forhold. Hver celle virker for det meste sammensatt av kjerner og andre organeller ikke er klart synlig. Etter IPSC koloni høst, og kultur i standard mater-frie forhold, bør nydannede IPSC kolonier ser mye som sine hESC kolleger, og de enkelte cellene er nesten identisk med hESC fenotype, som vist i figur 5B.
Før utnytte iPSCs generert fra nasale epitelceller (NEC-iPSCs) i forsøk, er det anbefalt å vurdere kvaliteten på nye linjer. Dette omfatter typisk vurdering av karyotype, ekspresjonen av pluripotency markører, og evne til å differensiere iPSCs inn i hver av de 3 embryonale bakterie lag (endoderm, mesoderm og ektoderm). Differensiering kapasitet kan testes på mange måter, men for øyeblikket er den strengeste analysen av teratom analysen 2,23,30. Mer omfattende analyser som transkripsjonen og epigenomic profilering er nyttig for å avgjøre om eventuelle kromosomavvik er innført ved å omprogrammere 23.
Figur 1. Inferior turbinat. Prøvetaking bevegelse og prøvetaking målet, mindreverdig turbinate, er angitt med svart pil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Cytospin. Mesteparten av prøven består av epitelceller, som er lange og søyleformede, med flimmerhårene i den ene enden og en rund kjerne i den andre. De er ofte klumpet seg sammen når samplet direkte fra nblir. Pilene viser enkelte epitelceller."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Primære nasale epitelceller i kultur. (A) Flytende celler og rusk rett etter prøven er samlet inn og belagt. (B) Celler en dag etter at de er passert. Cell morfologi er konsekvent og kultur består hovedsakelig av nese epitelceller, 10X forstørrelse, og (C) 5X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Transduksjon av NEC. Cells blir omformet har tatt opp vektoren og vise den røde fluorescens markør tdTomato. Denne markøren skal falme når de går videre mot en pluripotent tilstand. (A) Bright felt bilde av transduced celler. (B) Fluorescent bilde av transduced celler. (C) Overlegg av lyse felt og fluoriserende bilder (paneler A og B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. IPSC stamcellelignende kolonier. (A) vokser på MEFs, er koloni for det meste rundt på kantene, og viser liten eller ingen differensiering. (B) Individuelle cellene vise typisk hESC-lignende morfologi, med små runde celler med store kjerner.5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nese epitelceller (NEC) er en tilgjengelig plattform for å studere luftveissykdom, og NEC-iPSCs tilby en spennende vei å utforske sykdomsutvikling, behandling og terapi 1,31,32. NEC kan lett fås uten stressende eller potensielt skadelige prosedyrer 6,23. I vår erfaring, prøvetaking av neseslimhinnen som beskrevet i denne protokollen ser ut til å være mindre stressende og bedre oppfattet enn blodprøvetaking for barn. Derfor kan denne metoden være spesielt nyttig i pediatriske pasientpopulasjoner og relevant å studere luftveissykdommer. Den andre fordelen av NEC er at når de er i kultur, epitelceller valgt for med media og kultur tilstand og blir homogen. Dette er fordelaktig enn å bruke et komplekst vev slik som blodceller, og gjør det lettere å evaluere virkningen av celleopprinnelse i følge IPSC linjer ved hjelp av transcriptomic og epigenetiske tilnærminger.
Nårprøvetaking neseslimhinnen, er det viktig at den riktige området av nesen er samplet, slik at det meste epitelceller blir hentet frem, som vist ved å se på cytospin under et mikroskop (figur 2). Riktig prøvetaking vil gi ≥90% epitelceller. Det er viktig å innhente prøver fra friske pasienter, og for å sikre at prøven er samlet på riktig måte for å maksimalisere cellenummer innhentet og belagt. Den vridende bevegelse som er beskrevet i protokollen (avsnitt 1.5) sikrer at børsten kommer i kontakt med så mye av den nasale overflate som mulig. Det er en naturlig refleks å slå en hode når et fremmedlegeme er på vei mot ens ansikt. Derfor, i tilfelle av at et barn slår hans eller hennes hode eller trekker bort, er det viktig at samplingen skjer raskt og nøyaktig. Ved hjelp av disse teknikker vil øke effektiviteten av hver andre trinn av protokollen, og bestemme sannsynligheten for vellykket omprogrammering. Spør barnetå legge seg ned, og selv å plassere hendene under dem eller har en forelder eller søsken holde hendene er en god måte å oppmuntre dem til å ligge stille og bidra til å sikre en jevn og smertefri prøvetaking.
Nylig har noen andre sampling teknikker blitt evaluert for komfort, letthet, og sample utfall, basert på celleinnhold og sammensetning samt RNA og DNA gir 33. Gruppen anmeldt prøvetaking med en cytologi pensel kontra en polyesterpinne, og de samplet både dårligere turbinate samt fremre svelget av kraftig virvlende børsten eller pinne rundt svelget. Prøvetaking av mindreverdig turbinate med en pensel ble funnet å være litt ubehagelig, selv om det gir de beste utbytter RNA og besto av de cilierte epitelceller, sammenlignet med en polyester pinne. Metoden foreslått i denne protokollen er derfor verifisert som den mest pålitelige metoden for prøvetaking nasal epitel som en måte å studere luftveieneepitel.
Når prøven er oppnådd, må den holdes ved 37 ° C. En av de mest effektive måtene er å varme et beger med vann til mer enn 37 ° C og Nestlé det inn i et Styrofoam beholder for sikker transport under klargjøring for å møte deltakeren. Like før prøven er samlet, tilsett kaldt vann, slik at temperaturen er brakt til 37 ° C, og tilsett konisk rør med media. Når børsten tilsettes til den koniske tube, returnere røret umiddelbart til vannbadet og holde den der inntil den kan bli returnert til laboratoriet, noe som medførte at røret skal sette inn en regulert 37 ° C vannbad inntil cellene seeded på en kultur kolbe. På alle punkter, bør steril teknikk brukes for å unngå innføring av fremmede stoffer i kulturen.
En betydelig mengde av variabilitet blant prøvene ble observert når cellene ble satt i kultur. Denne variasjonen så ut til å stamme fra både donor kilde samtprøven kvaliteten selv. En måte å øke prøvekvaliteten er å skaffe en børste fra hvert nesebor, eller to børster pr deltaker. Etter såing ny prøve, og som cellene passeres, tilstanden til cellene bør overvåkes jevnlig for å være sikker på at de er skikket til å være nytt. Celler som gjør de beste kandidatene for er de som tar til kultur og sprer raskt. Det er ikke kjent hvorfor celler fra enkelte donorer er mer robuste enn de fra andre celler, men det kan skyldes faktorer som alder, størrelse på nesen, og helsen til donor på tidspunktet for prøvetaking. Når en prøve gir svært få celler, eller bare et lite antall celler legg ved en gang belagt, er usannsynlig å vokse til samløpet prøven. Hvis en sliter kultur gjør nå samløpet, cellene har en tendens til å være svak og mange celler dør under aging. Denne type prøve er en meget dårlig kandidat for omprogrammering, da det er vesentlig at cellene være prolifererende hurtig og robust, og at de ertransduced på et tidligst mulig passasje nummer. Det er ikke tilrådelig å transfektere celler som vokser sakte, enten dette skyldes donor variasjon, dårlig sampling, eller aging kulturer for tynn. Hvis omprogrammering er forsøkt med en dårlig cellekultur, er det lite sannsynlig å fortsette å realiseres.
Fremstilling av cellene for transduksjon er en del av protokollen som er mest vanskelig å fremstille for. Basert på veksten av celler, 2 x 10 5 til 5 x 10 5 celler er foreslått for transduksjon og dette kan avhengig av spesielle pasientprøver. Derfor kan det kreve noen brønner belagt med varierende celle tall for å oppnå det ideelle antallet.
Denne protokollen beskriver ikke bare den enkle prøvetaking, men også relativt enkelt og tidslinjer for å etablere primære cellekulturer, og påfølgende omprogrammering av de primære cellekulturer til IPSC linjer for mer bærekraftige og allsidige muligheter forskning. HeleProsessen fra klinikk til etablering av diskrete iPSCs i kultur tar ca 3 måneder, og nye metoder for å forkorte omprogrammering ganger blir utviklet 6,34,35. Dette feltet er i rask utvikling for å finne mer effektive og komplette måter å konvertere primære celler til iPSCs, og deretter å differensiere iPSCs i spesifikke celler og vevstyper av interesse. Imidlertid differensiering protokoller for vev som er viktige for luftveissykdom, slik som lunge epitel, fortsatt blir utdrevet 36-38.
Generering iPSCs fra NEC har fordelen av enkel og relativt smertefri isolering av celler. Videre er det mulig at NEC-iPSCs tilby fordeler fremfor iPSCs avledet fra andre vevstyper som kan utnyttes. Virkningen av IPSC epigenetikk ved etterfølgende IPSC differensiering er ikke helt forstått, selv om bevis indikerer at mus og menneskelige iPSCs havnen transkripsjonen og epigenetisk minne om deres somatisk celleopprinnelse og at denne selektivt favoriserer deres differensiering til linjene er forbundet med donorcelletype mens begrenser andre skjebner 5,26. På grunn av viktigheten av vev av opprinnelse, og hvordan dette påvirker funksjonelle egenskaper iPSCs, særlig med hensyn til oppbevaring av vevsspesifikke epigenetiske merker 39-45, IPSC linjer må tydeligere studert for å bedre forstått virkningen av vev av opprinnelse. Det har tidligere blitt vist at NEC-avledet iPSCs havn en genomisk metylering signatur som angir retensjon av et epigenetisk minne om deres vev opprinnelses 23. Slike epigenetisk minne beholdt i NEC-iPSCs kan være fordelaktig i differensiering av pluripotente stamceller til luftveis celler, som tidligere studier har vist at blodceller avledet iPSCs stiller epigenetisk minne om blodcellene opprinnelses lettere differensiert i blodceller enn fibroblast eller glatte muskelceller-avledet iPSCs mangler blood celle-spesifikke epigenetisk minne 5,26. Gitt den enorme potensialet i IPSC-avledede luftveisceller for modellering lungesykdommer, vil det være viktig å undersøke hvorvidt NEC skal representere en optimal celletype for differensiering av iPSCs inn i luftveiene celler / vev. I tillegg kan denne opprettholdes stabilt minne representerer kromosom steder resistente mot omprogrammering og kandidater til sykdomstilstander av donorceller. Som protokoller for å konvertere iPSCs til nære og fjerne lunge celletyper utvikles 36-38, kan disse NEC-iPSCs har en fordel i modellering luftveissykdommer som astma, KOLS, cystisk fibrose, og mange andre, og i å studere miljøeffekter på lunge utvikling og homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne pluripotent Stem Cell Facility og Confocal Imaging Core ved Cincinnati Children Hospital. Dette arbeidet ble støttet av R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) og 2U19AI70235 (GKKH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocol Step 1.1. |
| BEGM | Lonza | CC-3170 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocol Step 4.a. |
| cytosoft cytology brush | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocol Step 1.2. |
| trypan blue | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocol Step 2.1. |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocol Step 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocol Step 2.2. |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | Protocol Step 2.2. |
| cytospin funnel | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocol Step 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | Protocol Step 2.2. |
| blank slide | Fisher Scientific | S95933 | Protocol Step 2.2. |
| hema 3 stain kit | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocol Step 2.2. |
| Bovine Dermal Colagen, type 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocol Step 3.2. |
| T25 flask | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocol Step 3.3. |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | Protocol Step 5.2. |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | Protocol Step 5.2. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocol Step 5.5. |
| Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | Protocol Step 5.5. |
| polycistonic lentivirus* | e.g. Millipore | SCR511 | Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocol Step 6.4. |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | GSC-6301G | Protocol Step 6.4. |
| hESC media | See recipe included in protocol | Protocol Step 6.11. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Protocol Step 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocol Step 6.11. |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Protocol Step 6.11. |
| hESC-qualified Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Protocol Step 6.13. |
| Corning plate, 6 well | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocol Step 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | Protocol Step 6.13. |
| 250 ml disposable filter flask (0.22 µm) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocol Step 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocol Step 7.3. |
| cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocol Step 7.4. |
| hESC Media** | Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min |
||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Final Concentration |
| KO replacement serum (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
- Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
- Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
- Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
- Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
- Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
- Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
- Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
- Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
- Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
- Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
- Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
- Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
- Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
- Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
- Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
- Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
- Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
- Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
- Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
- Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
- Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
- Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
- Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).
