Method Article

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

DOI:

10.3791/53814

⸱

March 10th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayın, çocuklardan nazal epitel mukozasının başarılı bir şekilde örneklenmesi ve kültürlenmesi ve bu hücrelerin indüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için yöntemleri göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nazal epitel hücreleri (NEC'ler), hava yollarının hava kirleticilerine yanıt veren kısmıdır ve solunum yolu virüsleri ile enfekte olmuş ilk hücrelerdir. Ayrıca doğuştan gelen bağışıklık tepkileri ve bağışıklık ve hava yolu stromal hücreleri ile etkileşimleri yoluyla birçok hava yolu hastalığında rol oynarlar. NEC'ler, klinik ziyaretler sırasında erişilebilirlikleri nedeniyle çocuklarda yapılan çalışmalar için özellikle ilgi çekicidir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) birden fazla hücre tipinden üretilmiştir ve insan gelişimini ve hastalığını modellemenin yanı sıra rejeneratif tıptaki potansiyel uygulamaları için güçlü bir araçtır. Bu, araştırma amacıyla pediatrik katılımcılardan türetilen NEC'lerden iPSC'lerin başarılı bir şekilde üretilmesi için yöntemler ortaya koyan ilk protokoldür. Çocuklardan nazal epitel hücrelerinin nasıl elde edileceğini, bu örneklerden birincil NEC kültürlerinin nasıl oluşturulacağını ve birincil NEC'lerin iyi karakterize edilmiş iPSC'lere nasıl yeniden programlanacağını açıklar. Burun mukozası örnekleri, çocuklarda hava kirliliğinin etkileri ile ilgili epidemiyolojik çalışmalarda faydalıdır ve hava yolu hastalığını incelemek için önemli bir araç sağlar. Birincil burun hücreleri ve bunlardan türetilen iPSC'ler, astım ve KOAH araştırmaları da dahil olmak üzere hava yolu epitel biyolojisinin çeşitli alanlarında hastaya özgü araştırmalar için sınırsız materyal sağlamak için bir araç olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

insan örneklerinde (hiPSCs) den uyarılmış pluripotent kök hücreler kök hücre araştırmalarının bir hızla gelişen teknolojidir. Onlar çok daha az etik ve ahlaki sakıncaları 1,2 ile embriyonik kök hücre (hESC) araştırma bir alternatif sunuyoruz. Bunlar HESC 3-5 epigenetik özdeş olmayan, ancak hiPSCs gelişimi ve hastalığın fenotipleri modellemek için benzersiz bir yol sunar, ve hastalık durumunun 5-8 ilgili dokulardan elde edilebilir. Üreten hiPSCs yeni yöntemler sürekli transplantasyon için uygun GMP kalite iPSCs hazırlamak ve aynı zamanda yeniden programlama sürecinin 6,9-11 zamanında ve verimliliği artırmak için bir yol olar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki protokol kurumları insan araştırma etik komitesinin kuralları takip eder.

1. Burun mukozasının Örnekleme

NOT: viral solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ücretsiz konulardan örnekler alın.

  1. katılımcı ziyareti öncesinde bir 15 ml konik taze hazırlayın ve 2 ml Begm (Bronş Epitel Hücre Büyümesi Orta) artı 20 ul steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (% 0,01) ekleyin.
  2. Açık sitoloji sadece örnek almadan önce fırça ve steril fırça tutmak için emin olun ve burun yüzeyleri dışında herhangi bir yüzeye dokunmayın.
  3. Hala oturup tavana doğru kafasını eğmek için katılımcı isteyin.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burun girişinde adı burun ilk kısmı, kıkırdak 29 ile alandır. Fırça burun valfi (ostium iç dünyasıyla, ya da Nare arkasında görülen "kara delik") ötesinde, burun bu alandaki geçmiş sorunsuz gitmek gerekiyor, ve örnek alt konka (Şekil 1) elde edilir. Burun konkalar, burun 29 yüzey alanını arttırmak örnekleme için onları ideal bir konuma yapma kemiksi yapıları vardır. Alan da yakından alt solunum yollarının balataları benzer ve çevresel maruziyet immü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burun epitel hücreleri (UEM) havayolu hastalığı eğitimi için erişilebilir bir platform olup, NEC-iPSCs hastalık geliştirme, tedavi ve terapi 1,31,32 keşfetmek için heyecan verici bir cadde sunuyoruz. UEM kolayca stresli ya da potansiyel olarak zararlı prosedürler 6,23 olmadan elde edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu protokol açıklandığı gibi nazal mukozanın örnekleme daha az stresli ve daha iyi çocuklar için kan toplama daha algılanan gibi görünüyor. Bu nedenle, bu yöntem havayolu hastalıkla.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Pluripotent Kök Hücre Tesisi ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Konfokal Görüntüleme Çekirdek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ve 2U19AI70235 (GKKH) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml konikFisher Scientific14-959-49DProtokolü Adım 1.1.
BEGMLonzaCC-3170Protokolü Adım 1.1.
Penn/Strep/FungisitYaşam Teknolojileri15240-062Protokolü Adım 1.1.
Penn/StrepYaşam Teknolojileri15140-122Protokolü Adım 4.a.
cytosoft sitoloji fırçasıFisher Scientific22-263-357Protokolü Adım 1.2.
tripan mavisiFisher ScientificMT-25-900-CIProtokolü Adım 2.1.
hemasitometreFisher Scientific02-671-54Protokolü Adım 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4Protokolü Adım 2.2.
Sitoloji Huni KlipsleriFisher Scientific10-357Protokolü Adım 2.2.
cytospin hunisiFisher Scientific23-640-320Protokolü Adım 2.2.
Cytospin 4Fisher BilimselA78300003Protokolü Adım 2.2.
boş slaytFisher ScientificS95933Protokolü Adım 2.2.
hema 3 leke kitiFisher Scientific22-122-911Protokol Adım 2.2.
Sığır Dermal Kolagen, tip 1Yaşam TeknolojileriA1064401Protokolü Adım 3.2.
T25 şişesiFisher Scientific08-772-45Protokol Adım 3.3.
TrypsinLonzaCC-5012Protokolü Adım 5.2.
Tripsin Nötralize Edici ÇözeltiLonzaCC-5002Protokolü Adım 5.2.
Fetal Sığır Serumu (FBS), 65 ° C'de ısıyla sterilize edilmiş; 30 dakika için CSigma-AldrichF2442Protokolü Adım 5.5.
Dimetil sülfoksit Hybri-Max™, steril filtreli, BioReagent, hibridoma için uygun, &; %99.7Sigma-AldrichD2650Protokolü Adım 5.5.
polisistonik lentivirüs*ör MilliporeSCR511Protokolü Adım 6.4. 
Ticari bir yeniden programlama vektörü kaynağı listelenmiştir. Voelkel ve arkadaşları (PMID: 20385817) tarafından bildirilen 4'ü 1 arada plazmidi rutin olarak VSV-G-psödotipli polisistronik yeniden programlama lentivirüsünü kurum içinde oluşturmak için kullanıyoruz. Bu plazmit ile iletişime geçilerek elde edilebilir 
polibreneSanta Cruz Biyoteknolojisc-134220Protokolü Adım 6.4.
Işınlanmış CF1 MEF'lerGlobalStem GSC-6301GProtokolü Adım 6.4.
hESC ortamıAdım 6.11'deyer alan tarife bakın
SB431542Stemgent04-0010Protokolü Adım 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006Protokolü Adım 6.11.
Tiazovivin Stemgent04-0017Protokol Adım 6.11.
hESC nitelikli MatrigelBD Biosciences354277Protokolü Adım 6.13.
Corning plakası, 6 kuyuluFisher Scientific08-772-1BProtokolü Adım 6.13.
mTeSR1Kök Hücre5850Protokolü Adım 6.13.
250 ml tek kullanımlık filtre şişesi (0.22 & mikro; m)FisherSCGP-U02-RE 
dispaseStemCell7923Protokolü Adım 7.3.
DMEM/F12Yaşam Teknolojileri11320-033Protokol Adım 7.3.
hücre kaldırıcıFisher Scientific08-100-240Protokolü Adım 7.4.
hESC Ortamı**Protokol Adım 6.11.
bileşenleri karıştırılmalı ve ardından filtre ile sterilize edilmelidir. Medya 4 & derecede tutulabilir; İki haftaya kadar C. Ortamı ısıtırken 37 ° C'de bırakmayın; C 15 dakikadan daha uzun
DMEM-F12 50/50 medyaInvitrogen  11330-032Son Konsantrasyon
KO replasman serumu (KO-SR)İnvitrojen10828-0280.2
200 mM L-glutaminInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-merkaptoetanolInvitrogen21985-0230.1 mM
100x esansiyel olmayan amino asitlerInvitrogen11140-0501x
2 &mikro; g/ml Bazik-Fibroblast Büyüme Faktörü (b-FGF)İnvitrojen13256-0294 ng/ml
Protokol .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nasal Epithelial CellsInduced Pluripotent Stem CellsPrimary Cell CultureLentiviral TransductionReprogramming ProtocolPediatric Airway SamplinghESC MediumMEF CoatingColony ExpansionFeeder Free System

Related Articles