Introduction
Células madre pluripotentes inducidas a partir de muestras humanas (hiPSCs) son una tecnología en rápido desarrollo de la investigación de células madre. Ellos ofrecen una alternativa a la investigación con células madre embrionarias (células madre) con muchos menos inconvenientes éticos y morales 1,2. Aunque no son idénticos a epigenetically CMEh 3-5, hiPSCs ofrecen una forma única para modelar desarrollo y la enfermedad fenotipos, y que se pueden derivar de tejidos relevantes para el estado de la enfermedad 5-8. Se están explorando constantemente nuevos métodos de generación de hiPSCs para identificar tipos de células óptimas para empezar, como una manera de preparar iPSCs GMP calidad adecuadas para el trasplante, y también para aumentar la rapidez y la eficacia del proceso de reprogramación 6,9-11.
Las células epiteliales de las vías respiratorias son fundamentales en el desarrollo de la inflamación alérgica 12, y el epitelio es un importante motor de las respuestas alérgicas y remodelación de las vías a través de la interacción con Immune y del estroma células. El epitelio de la vía aérea juega un papel esencial en el origen y persistencia de enfermedades pulmonares tales como asma. Sin embargo, las células epiteliales de las vías respiratorias inferiores son difíciles de obtener en un entorno clínico, en especial a partir de pacientes de control sanos y los niños. Los datos de varios estudios apoyan la premisa de que las células epiteliales de la mucosa nasal son un indicador válido y práctico para las células epiteliales de la vía aérea inferior 13-20, especialmente en el estudio de las respuestas a los contaminantes del aire y los alergenos. La mucosa nasal se compone de más del 90% de las células epiteliales de las vías aéreas ciliadas y el muestreo de estas células epiteliales nasales (CNE) se puede realizar fácilmente en niños a partir de cuatro o cinco años, ya que es menos invasivo que otras técnicas de muestreo de células / tejidos y está asociado con un riesgo mínimo de efectos adversos tales como la infección 20-23. Ofrece una forma rápida y sencilla a la muestra tanto en niños sanos y enfermos, sin tiempo, innecesaria, ya menudo dolorosa procedi broncoscopiares que requieren sedación. Estudios previos han encontrado que los subtipos de enfermedad relacionados con la gravedad del asma se pueden distinguir tanto en la mucosa nasal, así como muestras de células bronquiales tomadas de niños asmáticos, y la expresión génica entre los dos tipos de tejido fue similar en aproximadamente 90% de los genes no ubicuos 22 , 24. Como fuente para iPSCs, CNE ofrecen ventajas sobre otros tipos de células utilizadas con frecuencia. Los fibroblastos se utilizan a menudo para la generación de IPSC, pero aunque estas células pueden cultivarse fácilmente a partir de una biopsia de la piel, este proceso normalmente requiere anestesia local, una incisión, y las suturas, y se asocia con algún riesgo de infección. Por lo tanto, obtener el consentimiento informado de los pacientes de este tipo de biopsia puede ser difícil 25. Una alternativa a los fibroblastos son células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Sin embargo, puede ser difícil de obtener sangre suficiente para la generación de IPSC de pacientes pediátricos. Además, existen limitaciones de aguas abajo apcomplicaciones de fibroblastos y células iPS derivadas de células sanguíneas, especialmente su capacidad de diferenciación de ciertos tipos de células 5,26. Por lo tanto, dada la accesibilidad relativa y el bajo riesgo de efectos secundarios después de su recolección, CNE representan una fuente ideal de células para la generación de IPSC de la población pediátrica.
iPSCs han recibido mucha atención recientemente como una plataforma para el estudio del desarrollo humano, la generación de nuevos modelos de enfermedad, y como una fuente potencial de células para terapias personalizadas. Antes de que el pleno potencial de esta tecnología se puede realizar, las bases moleculares del proceso de reprogramación necesitan ser dilucidado, pero por ahora este protocolo y los procedimientos descritos en aclararán los estudios de investigación se centraron en las exposiciones de las vías respiratorias, así como proporcionar una plataforma para estudiar los efectos de la medicina personalizada que involucra células iPS.
El trabajo de colaboración de varios laboratorios ha llevado a la generation de una técnica con éxito, no sólo para el muestreo de la mucosa nasal, pero también el cultivo de los CNE, y la reprogramación de estas células a iPSCs 23. En este artículo se presenta un esquema de un protocolo para el muestreo óptimo, el cultivo, y las condiciones de reprogramación.
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Protocol
El siguiente protocolo sigue las directrices del comité de ética de la investigación humana instituciones.
1. El muestreo de la mucosa nasal
NOTA: Obtener muestras de sujetos que no presentan signos de infección viral respiratoria.
- Preparar una fresca 15 ml cónica antes de la visita de los participantes y añadir 2 ml BEGM (epitelial bronquial medio de crecimiento celular), además de 20 l estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- cepillo de citología abierta justo antes de tomar la muestra, y asegúrese de mantener el cepillo estéril y no lo toque a cualquier superficie además de las superficies nasales.
- Pregunta participante para permanecer sentado y la inclinación de la cabeza hacia el techo. Tienen más pequeño o más hijos inquietos se sientan en sus manos y / o acostado para evitar golpear con fuerza el cepillo de distancia.
- Objetivo del cepillo en la parte posterior de la nariz, donde el paso se estrecha (se parece a un pequeño agujero negro). Deslice el cepillo hacia abajo y girar las muñecas mientras el cepillo se retira de nostril.
- Coloque el cepillo en forma cónica y sumergirse en BEGM. Corte el exceso de cepillo y coloque la tapa en el tubo. NO HACER vórtice.
NOTA: Si el participante está dispuesto, obtener un segundo cepillo de la misma manera pero en la segunda fosa nasal. La obtención de un cepillado de ambas fosas nasales se traducirá en una mayor probabilidad de que el muestreo sea un éxito. El muestreo de la misma fosa nasal puede causar sangrado y probablemente no mejorará la muestra. - Mantener las muestras lo más cercano a 37 ° C como sea posible durante el transporte usando un vaso de precipitados con agua tibia.
2. Recuento de Células y Cytospin
- Agitar suavemente el cepillo en BEGM y tomar 10 l de la muestra para un recuento de células usando un hemocitómetro. Añadir 10 l de una mancha en vivo / muerto y contar sólo las células vivas con un microscopio.
- Tomar 50 l de la muestra y diluir a 200 l con 1x PBS. Añadir al embudo de citospina unido a portaobjetos de vidrio y centrifugado a 300 rpm durante 2 min. Dejarlo deslizar seca O / N y tinción de diapositivas following instrucciones del fabricante. Deje secar O / N, preferiblemente en la oscuridad.
- Slide mancha con Hema 3 mancha
- Transferir cada solución (fijador Hema, azul claro; Hema 3 Solución I, rosa, y Hema 3 Solución II, azul profundo) en una placa de tinción; Mantenga cubiertos cuando no estén en uso. Insertar diapositivas en barco de tinción de portaobjetos
- diapositivas Dip continuamente en fijador durante 30 segundos, a continuación, permiten que el exceso se escurra. Dip desliza continuamente en la solución I durante 30 segundos, y luego permitir que el exceso se escurra. Dip desliza continuamente en la solución II durante 30 segundos, y luego permitir que drene el exceso
- Enjuague con agua desionizada hasta que el agua salga clara. Deje secar O / N, de preferencia en la oscuridad
- Mira la diapositiva bajo el microscopio las células y el recuento, determinar el porcentaje de células epiteliales. Debe ser de 90% o más si el muestreo es bueno.
3. Las células de siembra
NOTA: Llevar a cabo todos los procedimientos de cultivo de células en un cultivo tisular adecuado y certificadocampana mediante una técnica estéril.
- placas de capa con bovina de colágeno dérmico (BDC), el tipo 1. Añadir 0,5 ml de 3 mg / ml BDC diluido en 49,5 ml de PBS 1x. Preparar menos si se utilizan sólo unas pocas placas. Escudo un matraz T25 con 2 ml y se incuban en BDC O campana estéril / N o a 37 ° C durante 2 horas, si es necesario.
- Después de la incubación, aspirar cualquier líquido restante. Exponer frascos a la luz UV durante 30 minutos en la campana estéril. frascos para almacenaje de hasta un mes a 4 ° C, pero los lleva a RT o 37 ° C antes de la siembra de células.
- Mantenga cepillo y las células en BEGM a 37 ° C hasta el momento de sembrar. Cepille suavemente buches interior cónica, pero no lo hacen vórtice.
- Placa de 7 x 10 5 células en un matraz T25. Si hay menos, utilizar un recipiente más pequeño, tal como un pocillo de una placa de 6 pocillos. Esta placa de tamaño requiere aproximadamente 3 x 10 5 células.
NOTA: Si no hay esta cantidad de células, no es aconsejable continuar.
- Placa de 7 x 10 5 células en un matraz T25. Si hay menos, utilizar un recipiente más pequeño, tal como un pocillo de una placa de 6 pocillos. Esta placa de tamaño requiere aproximadamente 3 x 10 5 células.
- Bajo una campana estéril, tomar el cepillo de tubo y gently girar el cepillo en la superficie del matraz recubierto, teniendo cuidado de no rayar el revestimiento. Desechar el cepillo en un contenedor de residuos sanitarios apropiados.
- Lentamente pipetear las células restantes en BEGM fuera de la cónica y en el matraz T25. Observar las células bajo el microscopio. Se observó un número de células flotantes y puede haber algunos restos de la nariz, que es aceptable en esta etapa (figura 3A).
4. Cultura de la célula
- Después de la siembra de células, se dejan reposar durante 48 horas sin interrupción (Figura 3). Después de 48 horas, lenta y suavemente añadir 2 ml cálida BEGM y 20 l estéril Penicilina / estreptomicina / Fungizone (P / S / F).
NOTA: NO aspirar los originales 2 ml de medio. - En el 4º día después de la siembra, aspirar cuidadosamente todo el líquido, y reemplazar con 4 ml frescas, se calienta más el BEGM 1x penicilina / estreptomicina (Fungizone ya no es necesario). Cambiar el medio cada dos días y evaluar células para adjuntarción, el crecimiento y la confluencia. Cuando las células alcanzan ~ 80% de confluencia, normalmente en 2-3 semanas, que están listos para ser pasado.
- Un matraz T25 (alrededor de 2,5 x 10 6 células cuando confluente) puede ser pasado en tres matraces T25 o un frasco T75. Después de la primera paso, las células deben ser robustos y saludable, de alcanzar la confluencia cada tres días.
5. Las células pases
- Se aspira suavemente el soporte de la placa. Añadir 1 ml de solución de tripsina al 0,05% por matraz T25 a la placa y colocar en la incubadora durante aproximadamente 4 minutos, o hasta que las células se desprenden de la placa. Comprobar el nivel de desprendimiento de las células cada 2 min y no deje de tripsina en más de 10 min.
- Añadir 5 ml de solución de tripsina de neutralización (TNS), o medios que contienen suero para neutralizar la enzima. Eliminar todo el líquido y las células del frasco y colocar en un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar a 200 xg (aceleración 0 deceleración 0) durante 5 minutos para obtener un sedimento celular. Aspirar supernatantes células y resuspender en BEGM + P / S en el volumen requerido para los nuevos frascos (4 ml de un matraz T25, 10 ml de un matraz T75)
- Realizar el recuento de células con una tinción Live / muerto como se describe anteriormente (2.1). Añadir la cantidad apropiada de BEGM y las células a los matraces recubiertos y volver a la incubadora. Mantener como se detalla anteriormente o criopreservar en medio de congelación (70% BEGM, 20% de FBS y 10% de DMSO) a una concentración de 0,5-2 x 10 6 células por ml.
6. La reprogramación de células iPS
NOTA: Antes de generar células iPS, garantizar el cumplimiento de todas las normas institucionales que rigen la generación y uso de células iPS humanas. La técnica estéril es especialmente importante para las culturas de IPSC, como medio de cultivo no contiene antibióticos de forma rutinaria. Es fundamental que los CNE parece sana y robusta son proliferativa para la reprogramación éxito.
- La placa 5 x 10 5 CNE por pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. Después de 24 horas, añadir polibrenoa BEGM a una concentración final de 8 mg / ml y transducir CNE mediante la adición de partículas lentivirales que expresan Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc a los medios de comunicación. Tratar de lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 5 ~ 27.
- Para la determinación de la MOI, preparar diluciones en serie de la madre concentradas-lentiviral y transducir células HT1080 con estas diluciones. Después de la primera detección de la expresión inequívoca dTomato en las células HT1080, calcular el número de "unidades de transducción / ml", al anotar el número de células positivas dTomato / pequeños grupos de células en cada dilución.
NOTA: Por lo general, no será diluciones que son demasiado altos (todo es dTomato positivo) y muy bajo (ninguno o sólo un par de células positivas). - Realizar la puntuación de las diluciones en las que se identificaron células positivas discretos / pequeños grupos de células. Determinar el título mediante la corrección del número de transducir unidades / ml con el factor de dilución apropiado. MOI es entonces la relación del númerode las células transducidas con el número de partículas de virus 27.
NOTA: Cada dTomato celular positiva / pequeña masa se supone que surgen de una sola partícula de virus.
- Para la determinación de la MOI, preparar diluciones en serie de la madre concentradas-lentiviral y transducir células HT1080 con estas diluciones. Después de la primera detección de la expresión inequívoca dTomato en las células HT1080, calcular el número de "unidades de transducción / ml", al anotar el número de células positivas dTomato / pequeños grupos de células en cada dilución.
- Alrededor de 3 horas después de la transducción, retire y vuelva a colocar los medios de comunicación con BEGM fresco. Desechar los medios de comunicación que contienen lentivirus utilizando procedimientos aprobados institucionalmente. Volver CNE transducidas a la incubadora durante 3 días.
- El día 3, sustitución de los medios con BEGM fresca, y luego se incuba durante otros 3 días. Aspirar pasó medios de comunicación, se lavan las células con PBS 1x y añadir 1 ml de solución de tripsina al 0,05% al pozo. las células con tripsina de paso lo escrito anteriormente (sección 5). aspirar cuidadosamente las células sobrenadante y resuspender en 4 ml BEGM + P / S. Las células pueden ser pasados a un nuevo pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con BDC, o se añaden a cultivos de MEF, si listo (véase el paso siguiente).
- Preparar placas recubiertas MEF. En el día 4 añadir solución de gelatina al 0,1% (1 ml / pocillo) a 2 pocillos de una de 6 pocillos (+/- para realizar Thiazovivin (SPT), véase el paso 6.6). En el siguientedía, descongelar un vial de 28 MEFs inactivadas.
- Coloque MEFs en 10 ml de medio DMEM (MEF + 1x NEAA + 10% DFCS). Centrifugado a 200 xg durante 5 min para sedimentar. Resuspender en medios MEF. Gelatina Aspirar de placa de 6 pocillos y añadir 1,87 x 10 5 MEFs por pocillo de la placa de 6 pocillos recubierta con gelatina. Incubar O / N a 37 ° C, o durante un mínimo de 24 horas.
- Pasar 2 ml de BEGM que contiene células transducidas por pocillo en 2 pocillos de una placa de 6 pocillos recubiertos previamente e incubar S / N. En el día siguiente, reemplazar BEGM con 2,5 ml por pocillo de medio de células madre estándar que contienen factor de 4 ng / ml de crecimiento fibroblástico básico. Alimentar las células con medio fresco +/- células madre SPT al día durante 10 días
NOTA: Es posible añadir un cóctel de moléculas pequeñas (SB431542, PD0325901 y Thiazovivin (SPT) cóctel) para mejorar la eficiencia y la cinética de la reprogramación para CNE 23. - Después de diez días, seguir alimentando a diario usando los medios de comunicación células madre sin SPT. Alimentar las culturas diaria hasta que las colonias de células madre similares aaparecerá (Figura 5A, P0 colonia). Identificar las colonias que albergan iPSCs putativos por su gran núcleo: citoplasma y nucleolos prominentes.
- Manual sobre el consumo y la transferencia de colonias con morfología similar a células madre para separar los pozos de cultivo y expansión como líneas separadas en un sistema libre de alimentador. colonias extirpados deben adaptarse rápidamente a estas condiciones.
- Después de colonias de chapado extirpado estas líneas de IPSC putativos discretos ahora se consideran el paso 1 (P1). culturas alimentación diaria con mTeSR1. Pasaje y ampliar las líneas de IPSC utilizando procedimientos estándar. Puede tomar varios días a una semana de colonias p1 para alcanzar el tamaño en el que se debería realizar pases.
7. El mantenimiento de células iPS en Cultura
- Alimentar y evaluar las culturas diaria. Manualmente las zonas especiales que presenta la diferenciación manifiesta raspando con una pipeta de vidrio estéril o micro punta de la pipeta. Cambiar los medios de comunicación después de la recolección diaria.
- células de paso después de approximatamente cada cuatro días: Suavemente medios de aspirado, se añade 1 ml de dispasa caliente (1 mg / ml) por pocillo de una placa de 6 pocillos (la mitad del volumen de la alimentación), y luego se incuban a 37 ° C durante unos 4 minutos. Los bordes de las colonias empezarán a levantar, que se parece a un contorno blanco alrededor de la colonia. Se aspira suavemente la dispasa y se lava 3 veces con DMEM calentado / F12.
- Añadir 2 ml mTeSR1 y usar un levantador de células para levantar las colonias de la placa. Utilice una pipeta serológica de 5 ml o micropipeta P1000 para triturar suavemente las células hasta que las colonias se dividen en grupos más pequeños.
- Evitar la producción de muy pequeños grupos o las células individuales, como la supervivencia y la posterior proliferación será sub-óptima. Cuando re-plating colonias, una mezcla 1: 4 a 1: 6 dividida mantendrá densidad de las colonias óptima. Retire con cuidado las colonias y los medios de comunicación de la placa y añadir a nuevos pozos, matrigel-revestido.
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Representative Results
La parte inicial de la nariz, llamado el vestíbulo nasal, es el área rodeada por el cartílago 29. El cepillo tiene que ir sin problemas más allá de esta zona de la nariz, más allá de la válvula nasal (Internum ostium, o el "agujero negro" que se ve en la parte posterior del orificio nasal), y la muestra se obtiene a partir del cornete inferior (Figura 1). Los cornetes nasales son estructuras óseas que aumentan el área de superficie de la nariz 29, por lo que una ubicación ideal para el muestreo. La zona también está revestida por tejido de la mucosa vascularizada, que se asemeja mucho a las paredes de las vías respiratorias inferiores y también está activo en la respuesta inmune a las exposiciones ambientales.
Toma de muestras del tejido correcta asegura que las células que son reprogramadas son células epiteliales. Esto puede ser evaluado por el recuento de células inicial y cytospin, sino también por la observación de las células en cultivo. loscytospin, una vez centrifugó, se secó, y se tiñó, muestra la composición de la muestra. La mayoría de las muestras consisten en células epiteliales, que son columnar y ciliado, con un núcleo redondo. Con el kit de tinción Hema 3, que se tiñen de un color azul claro con un núcleo de color púrpura oscuro (Figura 2), y, a menudo cuando se toma directamente de la nariz se ven agrupados juntos. Aunque las muestras de células nasales son inicialmente una mezcla de tipos de células, así como los residuos de la nariz, con el tiempo en cultivo y con cambios de medio, las células epiteliales se vuelven predominantes (Figura 3A, B). Cuando las células epiteliales están creciendo hasta la confluencia, que tienen la forma de un huevo recién abierto, donde el núcleo es grande y situado en el centro y el citoplasma es una especie de "llegar" y que se extiende como la célula se prepara para dividirse (Figura 3B). A medida que las células crecen juntos, empiezan a asumir más de una forma de fútbol, y encajan perfectamente en el plato (figura3C).
Una vez que se transducen las células, que expresarán la tdTomato marcador fluorescente en el núcleo. La Figura 4 muestra las células una vez que han sido transducidas, en campo claro, fluorescencia y con las dos imágenes fusionadas. No todas las células expresa el marcador, y por lo tanto se transducidas no todas las células, pero cada pocillo debe tener la eficacia de transducción de 90 por ciento, y esto aumentará la probabilidad de que algunas células lograrán la pluripotencia después de haber sido chapada en MEFs.
Una vez co-cultivadas con células MEFs y como se empiezan a formar colonias, dejarán progresivamente expresando tdTomato. Sin embargo, esta no es la mejor indicación de la formación de colonias. La mejor indicación de la formación de colonias es una confirmación visual. colonias de células madre, que son el "patrón oro" de la pluripotencia, son en su mayoría redondo y se componen de muchas células pequeñas, redondas con large núcleos y una alta relación núcleo al citoplasma. Cada celda aparece en su mayoría compuesto por los núcleos, y otros orgánulos no son claramente visibles. Después de la cosecha de colonias IPSC, y la cultura en condiciones estándar libres de alimentador, colonias IPSC recién formados deben parecen mucho a sus homólogos de células madre y las células individuales son casi idénticos al fenotipo de células madre, como se ve en la figura 5B.
Antes de iPSCs que utilizan generan a partir de las células epiteliales nasales (NEC-iPSCs) en los experimentos, se aconseja para evaluar la calidad de las nuevas líneas. Esto típicamente implica la evaluación del cariotipo, la expresión de marcadores de pluripotencia, y la capacidad de iPSCs de diferenciarse en cada una de las capas germinales embrionarias 3 (endodermo, mesodermo y ectodermo). Capacidad de diferenciación puede ser probado en muchas formas, pero en la actualidad, el ensayo más riguroso es el ensayo de teratoma 2,23,30. Los ensayos más amplios tales como la transcripción y perfilado epigenómico son útiles para determinar si las anomalías cromosómicas se introducen mediante la reprogramación de 23.
Figura 1. cornete inferior. Movimiento de toma de muestras y el objetivo de muestreo, el cornete inferior, está indicada por la flecha negro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Cytospin. La mayor parte de la muestra consiste en células epiteliales, que son largas y columnar, con cilios en un extremo y un núcleo redondo en el otro. A menudo se agrupan juntos cuando la muestra directamente desde el orificio nasal. Las flechas indican las células epiteliales individuales.objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Las células primarias epiteliales nasales en cultivo de células flotantes. (A) y justo después de los desechos se han recogido y plateado de la muestra. (B) Las células un día después de que se pasaron. La morfología celular es consistente y la cultura se compone principalmente de células epiteliales nasales, 10 aumentos, y de ampliación (C) 5X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Transducción de CNE. Las células siendo transducidas han tomado el vector y mostrar el tdTomato marcador de fluorescencia roja. Este marcador se desvanecen a medida que avanzan hacia un estado pluripotente. La imagen de campo claro de las células transducidas (A). (B) Imagen de fluorescencia de las células transducidas. (C) Superposición de campo brillante y las imágenes fluorescentes (paneles A y B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. IPSC vástago colonias de células similares. (A) que crece en MEFs, colonia es principalmente redonda sobre bordes y muestra poca o ninguna diferenciación. (B) Las células individuales muestran la morfología típica de células madre similares, con pequeñas células redondas con núcleos grandes.5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Células epiteliales nasales (CNE) son una plataforma accesible para el estudio de la enfermedad de las vías respiratorias, y NEC-iPSCs ofrecen una buena posibilidad para explorar el desarrollo de la enfermedad, el tratamiento y la terapia 1,31,32. CNE se puede obtener fácilmente sin procedimientos nocivos potencialmente estresantes o 6,23. En nuestra experiencia, la toma de muestras de la mucosa nasal como se describe en este protocolo parece ser menos estresante y sentir mejor, que la extracción de sangre para los niños. Por lo tanto, este método puede ser particularmente útil en las poblaciones de pacientes pediátricos y relevante para el estudio de enfermedades de las vías respiratorias. La otra ventaja de la CNE es que una vez que están en cultivo, se seleccionaron las células epiteliales de los medios y condiciones de cultivo y se convierten homogénea. Esto es ventajoso que el uso de un tejido complejo como células de sangre y hace que sea más fácil evaluar el impacto de origen celular en líneas de IPSC resultante utilizando enfoques de transcriptómica y epigenéticos.
Cuandoel muestreo de la mucosa nasal, es importante que el área correcta de la nariz se muestrea de manera que se recuperan las células epiteliales en su mayoría, como se evidencia mediante la visualización de la cytospin bajo un microscopio (Figura 2). toma de muestras correcta producirá ≥90% de células epiteliales. Es fundamental para obtener muestras de pacientes sanos, y para asegurar que la muestra se recoge adecuadamente a fin de maximizar el número de células obtenido y plateado. El movimiento de giro se describe en el protocolo (sección 1.5) se asegura de que el cepillo se pone en contacto con la mayor cantidad de la superficie nasal como sea posible. Es un reflejo natural a girar la cabeza cuando un objeto extraño se dirige hacia la cara. Por lo tanto, en el caso de que un niño gira su cabeza o se aleja, es esencial que el muestreo se produce con rapidez y precisión. El uso de estas técnicas aumentará la eficiencia de cada paso del protocolo, y determinar la probabilidad de reprogramación éxito. Pedir al niñoacostarse, e incluso para colocar sus manos por debajo de ellos o tienen padres o hermanos tienen sus manos es una buena manera de animarles a permanecer inmóvil y para garantizar una recogida de muestras sin problemas y sin dolor.
Recientemente, algunas otras técnicas de muestreo se han evaluado para la comodidad, facilidad, y los resultados de la muestra, basado en el contenido celular y la composición, así como ARN y ADN produce 33. El grupo examinó el muestreo con un cepillo de citología en comparación con una torunda de poliéster, y se tomaron muestras tanto del cornete inferior, así como las fosas nasales anteriores haciendo girar vigorosamente el pincel o hisopo alrededor de las fosas nasales. El muestreo de la cornete inferior con un cepillo se encontró que era un poco incómodo, aunque dió los mejores rendimientos de ARN y consistió en las células epiteliales ciliadas más, en comparación con un hisopo de poliéster. Por consiguiente, el método propuesto en este protocolo se verifica como el método más fiable de muestrear las epitelio nasal como una manera de estudiar la vía aérea respiratoriaepitelio.
Una vez que se obtiene la muestra, que debe mantenerse a 37 ° C. Una de las maneras más efectivas es para calentar un vaso de precipitados de agua a más de 37 ° C y Nestlé en un recipiente de espuma de poliestireno para el transporte seguro mientras se prepara para cumplir con el participante. Justo antes de tomar la muestra, añadir agua fría para que se lleva la temperatura a aproximadamente 37 ° C y añadir el tubo cónico con los medios de comunicación. Cuando se añade el cepillo para el tubo cónico, devuelva el tubo inmediatamente al baño de agua y mantenerlo allí hasta que pueda ser devuelto al laboratorio, momento en el que el tubo debe ser puesto en un baño de agua a 37 ° regulada hasta que las células son sin semillas en un frasco de cultivo. En todos los puntos, una técnica estéril se debe utilizar para evitar la introducción de agentes extraños en la cultura.
Una cantidad considerable de variabilidad entre las muestras se observó cuando se pusieron las células en cultivo. Esta variabilidad parece tener su origen en tanto la fuente de donantes, así comola calidad de la muestra en sí. Una forma de aumentar la calidad de la muestra es la obtención de una escobilla de cada fosa nasal, o dos cepillos por participante. Después de sembrar la muestra fresca, y como se pasan las células, el estado de las células debe ser monitoreado regularmente para asegurarse de que están en condiciones de ser reprogramado. Las células que hacen que los mejores candidatos para son los que llevan a la cultura y proliferan rápidamente. No se sabe por qué las células de algunos donantes son más robustas que las de otras células, pero puede ser debido a factores tales como la edad, el tamaño de la nariz, y la salud del donante en el momento del muestreo. Cuando una muestra rendimientos muy pocas células, o sólo un pequeño número de células adjuntar una vez plateado, la muestra es improbable que crezca hasta confluencia. Si una cultura que lucha hace llegar a la confluencia, las células tienden a ser débiles y muchas células mueren durante los pases. Este tipo de muestra es un candidato muy pobre para la reprogramación, ya que es esencial que las células sean de proliferación rápida y robusta, y que sontransducidas en el número de pases antes posible. No es aconsejable para transfectar células que están creciendo lentamente, si esto se debe a la variabilidad de los donantes, la mala toma de muestras o cultivos de pases demasiado delgada. Si se intenta realizar una reprogramación con un cultivo celular pobre, es poco probable que continúe a buen término.
Preparación de las células para la transducción es una parte del protocolo que es más difícil de preparar. Basándose en el crecimiento de las células, 2 x 10 5 a 5 x 10 5 células se sugieren para la transducción y esto dependientes pueden en muestras específicas del paciente. Por lo tanto, puede requerir varios pozos chapados con diferentes números de células para obtener el número ideal.
Este protocolo describe no sólo la facilidad de toma de muestras, sino también la relativa facilidad y líneas de tiempo de establecimiento de cultivos de células primarias, y la posterior reprogramación de los cultivos de células primarias a las líneas de IPSC para oportunidades de investigación más sostenibles y versátiles. La totalidadproceso de clínica en el establecimiento de células iPS discretos en cultivo dura aproximadamente 3 meses, y nuevos métodos para reducir los tiempos de reprogramación se están desarrollando 6,34,35. Este campo está evolucionando rápidamente para encontrar formas más eficientes y completos para convertir células primarias de células iPS, y posteriormente para diferenciar células iPS en tipos de células y tejidos específicos de interés. Sin embargo, los protocolos de diferenciación de tejidos importantes para la enfermedad de las vías respiratorias, tales como el epitelio pulmonar, todavía se están elaborando 36-38.
La generación de iPSCs de CNE tiene la ventaja de aislamiento simple y relativamente sin dolor de las células. Además, es posible que NEC-iPSCs ofrecer ventajas sobre iPSCs derivados de otros tipos de tejidos que pueden ser explotadas. El impacto de la epigenética en IPSC posterior diferenciación IPSC no se entiende completamente, aunque la evidencia indica que el ratón y humanos iPSCs albergan la memoria epigenética de la transcripción y de sus células somáticas deorigen y que esto favorece selectivamente su diferenciación en linajes asociados con el tipo de célula donante, pero restringe otros destinos 5,26. Debido a la importancia del tejido de origen, y cómo esto afecta a las propiedades funcionales de las células iPS, particularmente con respecto a la retención de las marcas epigenéticas específicas de tejido 39-45, líneas de IPSC deben ser estudiados con mayor claridad con el fin de entender mejor la impacto del tejido de origen. Previamente se ha demostrado que iPSCs derivados de NEC albergan una firma metilación genómica que indica la retención de una memoria epigenética de su tejido de origen 23. Dicha memoria epigenética retenido en NEC-iPSCs puede ser beneficioso en la diferenciación de las células madre pluripotentes en células de las vías respiratorias, ya que estudios previos han demostrado que las células iPS células sanguíneas derivadas expositoras memoria epigenética de las células sanguíneas de origen se distinguen más fácilmente en los glóbulos de fibroblastos o iPS derivadas de músculo liso que carecen de Bloo-celda específica d 5,26 memoria epigenética. Dado el enorme potencial de las células de las vías respiratorias derivadas de IPSC para enfermedades pulmonares modelado, será importante estudiar si los CNE representan un tipo celular óptimo para la diferenciación de las células iPS en las vías respiratorias células / tejido. Además, esta memoria de forma estable mantenido puede representar localizaciones cromosómicas resistentes a la reprogramación y candidatos a estados de enfermedad de células del donante. Como protocolos para convertir células iPS para proximales y distales tipos de células de pulmón se desarrollan 36-38, éstos NEC-iPSCs puede tener una ventaja en las enfermedades de las vías respiratorias de modelado como el asma, EPOC, fibrosis quística, y muchos otros y en el estudio de los efectos ambientales sobre el desarrollo pulmonar y la homeostasis.
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Acknowledgments
Los autores desean reconocer la Facilidad de células madre pluripotentes y la Imagen confocal Core en el Hospital de Niños de Cincinnati. Este trabajo fue apoyado por R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) y 2U19AI70235 (GKKH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocol Step 1.1. |
| BEGM | Lonza | CC-3170 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocol Step 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocol Step 4.a. |
| cytosoft cytology brush | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocol Step 1.2. |
| trypan blue | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocol Step 2.1. |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocol Step 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocol Step 2.2. |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | Protocol Step 2.2. |
| cytospin funnel | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocol Step 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | Protocol Step 2.2. |
| blank slide | Fisher Scientific | S95933 | Protocol Step 2.2. |
| hema 3 stain kit | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocol Step 2.2. |
| Bovine Dermal Colagen, type 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocol Step 3.2. |
| T25 flask | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocol Step 3.3. |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | Protocol Step 5.2. |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | Protocol Step 5.2. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocol Step 5.5. |
| Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | Protocol Step 5.5. |
| polycistonic lentivirus* | e.g. Millipore | SCR511 | Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocol Step 6.4. |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | GSC-6301G | Protocol Step 6.4. |
| hESC media | See recipe included in protocol | Protocol Step 6.11. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Protocol Step 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocol Step 6.11. |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Protocol Step 6.11. |
| hESC-qualified Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Protocol Step 6.13. |
| Corning plate, 6 well | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocol Step 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | Protocol Step 6.13. |
| 250 ml disposable filter flask (0.22 µm) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocol Step 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocol Step 7.3. |
| cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocol Step 7.4. |
| hESC Media** | Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min |
||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Final Concentration |
| KO replacement serum (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
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