Developmental Biology

子供からプライマリ鼻上皮細胞を培養し、人工多能性幹細胞に再プログラム

Published: March 10, 2016 doi: 10.3791/53814

Ashley Ulm¹, Christopher N. Mayhew², Jason Debley³, Gurjit K. Khurana Hershey⁴, Hong Ji^1,4

¹Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, ²Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, ³Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, ⁴Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

Introduction

ヒトサンプル（hiPSCs）から誘導された多能性幹細胞は、幹細胞研究の急速な発展技術です。彼らは、胚性幹細胞（hESCの）はるかに少ない倫理的、道徳的な欠点^1,2との研究に代わるものを提供しています。彼らはヒトES細胞^3-5のエピジェネティックに同一ではないですが、hiPSCsは、開発および疾患の表現型をモデル化するためのユニークな方法を提供し、彼らは、疾患状態^5-8に関連する組織に由来することができます。生成hiPSCsの新しい方法は、常に移植に適したGMP品質のiPS細胞を作製する方法として、で開始し、また、再プログラミングプロセス^6,9-11の適時性と効率性を高めるために最適な細胞型を同定するために探索されています。

気道上皮細胞は、アレルギー性炎症¹²の開発において重要である、と上皮はIMMUNとの相互作用を介してアレルギー反応と気道リモデリングの主要なドライバですeとの間質細胞。気道上皮は、喘息などの肺疾患の起源および持続性において重要な役割を果たしています。しかし、下気道上皮細胞は、特に健康な対照患者や子どもたちから、臨床の場で得ることは困難です。いくつかの研究からのデータは、大気汚染物質やアレルゲンに対する応答を研究する場合は特に、鼻粘膜から上皮細胞が下気道上皮細胞のための有効かつ実用的なプロキシであることを前提^13-20をサポートしています。鼻粘膜は、90％以上の繊毛気道上皮細胞で構成され、それが他の細胞/組織サンプリング技術よりも低侵襲性であるとされ、これらの鼻上皮細胞（NECS）をサンプリングすることは容易に、年齢4または5のように幼い子供にして行うことができますこのような感染^20-23のような有害事象のリスクが最小限に関連付けられています。それは、長い間、不必要な、そしてしばしば痛みを伴う気管支鏡。手順なしで健康と病気の両方の子をサンプリングするために迅速かつ簡単な方法を提供しています鎮静を必要と解像度。以前の研究は、喘息の重症度に関連する疾患のサブタイプは鼻粘膜、ならびに喘息の子供から採取した気管支細胞試料の両方で識別することができることを見出しており、2つの組織タイプ間の遺伝子発現は、非ユビキタス遺伝子²²の約90％で類似していました^、24。 iPS細胞の供給源としては、NECSは、他の頻繁に利用される細胞型に比べて利点を提供します。線維芽細胞は、多くの場合、IPSCを生成するために使用されているが、これらの細胞は容易に皮膚生検から培養することができるが、このプロセスは、典型的には、局所麻酔、切開、および縫合糸を必要とし、感染症のいくつかのリスクと関連しています。したがって、生検のこのタイプの患者からインフォームドコンセントを得ることが²⁵困難な場合があります。線維芽細胞の一つの代替は、末梢血単核細胞（PBMC）です。しかし、小児患者からIPSCを生成するために十分な血液を得ることが困難となります。また、下流APの制限があります線維芽細胞および血液細胞由来のiPS細胞、特定の細胞タイプ^5,26、特にそれらの分化能のために襞。したがって、相対的なアクセシビリティとその収集以下の副作用のリスクが低い与えられ、NECSは、小児集団からのIPSCを生成するための理想的な細胞源を表します。

性IPSCは、新規疾患モデルを生成し、人間開発を研究するためのプラットフォームとして、最近多くの注目を受け、パーソナライズされた治療用細胞の潜在的な供給源としています。この技術の全潜在能力を実現することができる前に、リプログラミング過程の分子基盤を解明する必要がありますが、今の内に概説され、このプロトコルおよび手順は、気道曝露に焦点を当てた調査研究を解明し、同様のためのプラットフォームを提供しますiPS細胞が関与する個別化医療の効果を研究します。

いくつかの研究室の共同作業はGENERATIOにつながっています鼻粘膜を採取するだけでなく、NECSを培養し、iPS細胞²³に、これらの細胞を再プログラミングするだけでなく、ために成功した技術のn個。この記事では、最適なサンプリング、培養、および再プログラミング条件のためのプロトコルの概要を提供します。

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Protocol

以下のプロトコルは、金融機関、人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。

1.鼻粘膜をサンプリング

注：呼吸器ウイルス感染の兆候がない被験者からのサンプルを入手します。

参加者の訪問の前に、15ミリリットルの円錐形の新鮮なを準備し、2ミリリットルBEGM（気管支上皮細胞増殖培地）を加えた20μlの滅菌ペン/連鎖球菌/ファンギゾン（P / S / F）（0.01％）を追加します。
オープン細胞診だけで試料を採取する前に、ブラシ、および滅菌ブラシを保つようにしてくださいと鼻の表面以外の任意の表面に触れないでください。
じっと座っていると天井に向かって頭を傾けるために参加者を確認して下さい。小さい以上の落ち着きのない子供たちは手の上および/または離れてブラシを叩き避けるために横たわって座っています。
（小さなブラックホールのように見える）の通路が狭く鼻の奥にブラシを目指します。ダウンブラシをスライドさせ、ブラシがnostriから除去される手首をねじりますリットル。
円錐形にブラシを配置し、BEGMに水没。余分なブラシをカットし、チューブのキャップを交換してください。 VORTEXしないでください。
注：参加者が喜んであれば、同じようにが、第2の鼻孔に第2のブラシを得ます。両方の鼻孔のブラッシングを得ることは、サンプリングが成功する可能性が高くになります。同じ鼻孔をサンプリングする出血になることがあり、おそらくサンプルを改善されません。
暖かい水を入れたビーカーを使用して輸送中、可能な限り37°Cに近いサンプルを保管してください。

2.セル数とサイトスピン

ゆっくりBEGMにブラシを攪拌し、血球計を用いて、細胞数のために10μlのサンプルを取ります。生/死染色の10μlを添加して、顕微鏡下でのみ生きた細胞を数えます。
50μlのサンプルを取り、1×PBSで200μlに希釈します。 2分間300rpmでスライドガラスとスピンに取り付けられたサイトスピン漏斗に追加します。 followinドライO / Nと染色スライドをスライドさせてみましょうグラムの製造元の指示。好ましくは暗闇の中で、O / Nを乾燥することができます。
ヘマ3ステインで染色スライド
1. 染色皿に（とヘマ3溶液II、深い青色;私はピンク、ヘマ3ソリューションヘマ固定液、ライトブルー）の各溶液を移します。使用しないときに覆われて保管してください。スライド染色ボートにスライドを挿入
2. ディップスライドは連続して30秒間固定液で、次いで過剰を排出することができます。ディップは、私が30秒間、次いで過剰を排出することを可能にするソリューションで連続的にスライドします。ディップは、30秒間溶液IIで連続的にスライドし、次いで過剰を排出することを可能にします
3. 水が透明に実行されるまで脱イオン水ですすいでください。暗闇の中で好ましくは、O / Nを乾燥することができます
顕微鏡下でスライドを見て、細胞をカウントし、上皮細胞の割合を決定します。サンプリングが良好であれば90％以上でなければなりません。

3.播種細胞

注：適切と認定された組織培養内のすべての細胞培養手順を実行しフードは、無菌技術を使用して。

ウシ真皮コラーゲン（BDC）でコーティングプレートは、タイプ1は49.5ミリリットル1×PBSで希釈した3 mg / mlとBDCの0.5ミリリットルを追加します。ほんの数プレートを使用する場合は以下を準備します。コート2ミリリットルBDCとT25フラスコ、必要に応じて、2時間、無菌フードのO / Nまたは37℃でインキュベートします。
インキュベーション後、残りの液体を吸引します。無菌フードで30分間UV光にフラスコを公開します。ストア4℃で最大1ヶ月間のフラスコが、細胞を播種する前に、RTまたは37℃にそれらをもたらします。
シード準備ができるまで、37℃でBEGMにブラシと細胞を保管してください。静かにスウィッシュ円錐形の内部にブラシが、渦ありません。
1. プレートT25フラスコ中の7×10 ⁵個^の細胞。以下である場合、例えば、6ウェルプレートの1ウェルとして小さな容器を使用します。このサイズのプレートは、約3×10 ⁵個^の細胞を必要とします。
  注：この多くの細胞が存在していない場合は、継続することはお勧めできません。
無菌フードの下では、チューブの外にブラシを取るとGEntlyコーティングに傷を付けないように注意して、コーティングされたフラスコの表面にブラシを回転させます。適切なバイオハザード容器にブラシを破棄します。
ゆっくりと円錐の外とT25フラスコにBEGMで残りの細胞をピペット。顕微鏡下で細胞を観察します。浮遊細胞の数が観察され、この段階（ 図3A）で許容される鼻からのいくつかの破片があってもよいです。

4.細胞培養

細胞を播種した後、それらを中断せずに48時間（ 図3）のために解決しましょう。 48時間後、ゆっくりと優しく暖かいBEGM 2ミリリットルを追加し、20μlの滅菌ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン（P / S / F）。
注：メディアの元の2ミリリットルを吸引しないでください。
播種後4 ^日目に、慎重にすべての液体を吸引し、新鮮な4ミリリットルと交換し、BEGMプラス1×ペニシリン/ストレプトマイシンが（ファンギゾンはもはや必要ではない）温めました。 2日毎に培地を変更し、添付のための細胞を評価しますメント、成長、および合流。細胞は〜80％コンフルエンスに達した場合、通常2-3週間で、彼らは継代する準備ができています。
One T25フラスコ3 T25フラスコまたは1 T75フラスコに継代することができる（コンフルエントは、約2.5×10 ⁶細胞）。最初の継代後、細胞を3日ごとに約コンフルエンスに達し、堅牢かつ健康でなければなりません。

5.継代細胞

静かにプレートから培地を吸引除去します。約4分のためのインキュベーターでプレートと場所にT25フラスコあたり1ミリリットル0.05％トリプシン溶液を追加し、または細胞がプレートから剥がれるまで。セルごとに2分の剥離のレベルをチェックし、より長い10分にトリプシンを放置しないでください。
酵素を中和するために5ミリリットルのトリプシン中和溶液（TNS）、または血清含有培地を追加します。 15ミリリットルコニカルチューブにフラスコと場所からすべての液体とセルを削除します。
5分間200×gで（加速0減速0）における遠心分離、細胞ペレットを得ました。吸引しsuperna新しいフラスコに必要な量でS BEGMで+ P /タント再懸濁細胞（T75フラスコ用T25フラスコのための4ミリリットル、10ミリリットル）
（2.1）上記のように生/死染色で細胞数を実行します。コートフラスコにBEGM、細胞の適切な量を追加し、インキュベーターに戻します。上記に詳述したように維持するか、または1mlあたり0.5〜2×10 ⁶細胞の濃度で（70％BEGM、20％FBSおよび10％DMSO）凍結培地中で凍結保存。

性IPSC 6.リプログラミング

注：iPS細胞を生成する前に、人間性IPSCの生成と使用を管理するすべての機関の規制の遵守を確保します。培養培地は、日常的な抗生物質が含まれていないとして、滅菌技術は、IPSC培養のために特に重要です。 NECSは健康に見えるとロバスト成功した再プログラミングのために増殖していることが重要です。

プレート6ウェル組織培養プレートのウェル当たり5×10 ⁵ NECS。 24時間後、ポリブレンを追加BEGMへのメディアへのOct4、Sox2の、Klf4の、のc-mycを発現するレンチウイルス粒子を添加することにより、8 / mlのと伝達NECSの最終濃度まで。〜5 ²⁷の感染多重度（MOI）を達成することを目指しています。
1. MOIを決定するために、集中レンチウイルスストックの連続希釈液を準備し、これらの希釈液でHT1080細胞を形質導入。 HT1080細胞におけるdTomato式の明確に最初の検出後、dTomato陽性細胞/各希釈における細胞の小塊の数を採点することによって「形質導入単位/ ml」の数を計算します。
  注：一般的に、高すぎる希釈（すべてがdTomato正）と低すぎる（noneまたは陽性細胞の夫婦のみ）があります。
2. 細胞の離散陽性細胞/小塊が識別された希釈液からスコアリングを行います。適切な希釈率で単位/ mlの形質導入の数を補正することにより力価を決定します。 MOIは、その後数の割合でありますウイルス粒子²⁷の数に形質導入した細胞の。
  注：各dTomato陽性細胞/小塊は、単一のウイルス粒子から発生すると想定されます。
約3時間形質導入後、メディアを取り出し、新鮮なBEGMと交換します。制度-承認された手順を使用して、レンチウイルス含有培地を捨てます。 3日間インキュベーターに形質導入さNECSを返します。
3日目に、新鮮なBEGMでメディアを交換してから、別の3日間インキュベートします。吸引除去は、メディアが、1×PBSで細胞を洗浄し、ウェルに1ミリリットル0.05％トリプシン溶液を添加過ごしました。上に書いたようにトリプシンで継代細胞（セクション5）。慎重に4ミリリットルBEGM + P / Sで上清と再懸濁細胞を吸引します。準備ができた場合細胞は、（次の手順を参照）、BDCでコーティングした6ウェルプレートの新しいウェルに継代し、またはMEF培養物に添加することができます。
MEFコーティングしたプレートを準備します。 4日目に、6ウェルの2ウェルに0.1％ゼラチン溶液を（1ミリリットル/ウェル）（実行するには+/- Thiazovivin（SPT）は、ステップ6.6を参照）を追加します。次の上当日は、不活性化されたMEF ²⁸のバイアルを解凍します。
MEF培地（DMEM + 1×NEAA + 10％のDFC）の10ミリリットルにしたMEFを置きます。ペレットに5分間200×gでスピン。 MEF培地で再懸濁。 6ウェルプレートから吸引したゼラチン及びゼラチンでコーティングした6ウェルプレートのウェル当たり1.87×10 ⁵のMEFを追加します。 O / N、37℃で、または24時間の最小インキュベート。
BEGMが以前にコーティングした6ウェルプレートの2ウェルにウェル当たり形質導入した細胞を含有し、O / Nインキュベートの譲渡2ミリリットル。翌日、4 ngの/ mlの塩基性線維芽細胞成長因子を含む標準hESC媒体のウェル当たり2.5ミリリットルでBEGMを交換してください。 10日間毎日新鮮なhESC媒体+/- SPTで細胞をフィード
注：それはNECS ²³再プログラミングの効率と速度を向上させるために、小分子（SB431542、PD0325901、およびThiazovivin（SPT）のカクテル）のカクテルを追加することが可能です。
10日後、SPTなしのhESCのメディアを使用して、毎日餌を続けます。ヒトES細胞様コロニーまで毎日文化をフィード表示される（ 図5A、P0コロニー）。細胞質比および顕著な核小体：その高い核によって推定されるiPS細胞を保有するコロニーを特定します。
ヒトES細胞様の形態を使用して手動で物品税と移転コロニーは、フィーダーフリーシステムで別々のラインとしての文化や拡張のために井戸を分離します。切除されたコロニーは、これらの条件に迅速に適応する必要があります。
1. 切除されたコロニーをメッキした後、これらの離散推定されるIPSCラインは現在、継代1（P1）と考えられています。 mTeSR1で毎日文化を養います。パッセージとは、標準的な手順を用いてIPSCラインを展開します。 p1のコロニーは、彼らが継代されるべきサイズに到達することは、週に数日かかる場合があります。

7.文化でiPS細胞を維持

フィードと毎日文化を評価します。手動で消費税の領域は滅菌ガラスピペットまたはマイクロピペットチップでこすることによって明白な分化を示します。毎日のピッキング後にメディアを変更します。
approxima後の継代細胞tely 4日毎：優しく吸引メディアは、6ウェルプレート（半分送り量）のウェルあたり1ミリリットル暖かいディスパーゼ（1mg / ml）を追加し、その後、約4分間37℃でインキュベートします。コロニーの縁は、コロニーの周りに白い輪郭のように見えている、持ち上げるために開始されます。静かにディスパーゼを吸引し、温めたDMEM / F12で3回洗います。
2ミリリットルmTeSR1を追加し、プレートからコロニーを持ち上げるために、セルリフターを使用します。コロニーが小さいクラスタに分割されるまで、細胞を穏やかに粉砕するために5ミリリットルの血清学的ピペットまたはP1000マイクロピペットを使用してください。
1. 生存とその後の増殖が次善であるように、非常に小さなクラスターまたは単一細胞を産生することは避けてください。コロニーを再メッキすると、1：4〜1：6分割が最適なコロニー密度を維持します。静かにプレートからコロニーとメディアを削除し、新しい、マトリゲル被覆ウェルに追加します。

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Representative Results

鼻前庭と呼ばれる鼻の最初の部分は、軟骨²⁹で囲まれた領域です。ブラシは鼻弁（口のinternum、または鼻孔の奥に見える「ブラックホール」）を超えて、鼻のこの領域を超えてスムーズに行く必要があり、サンプルは下鼻甲介（ 図1）から得られます。鼻甲介は、それらのサンプリングのための理想的な場所作り、鼻²⁹の表面積を増加させる骨構造です。領域も密接に下気道のライニングに似ており、環境曝露に対する免疫応答にもアクティブである血管新生し粘膜組織によって裏打ちされています。

正しい組織をサンプリングする再プログラムされた細胞が上皮細胞であることが保証されます。これは、初期細胞数及びサイトスピンによってだけでなく、培養中の細胞を観察することによって評価することができます。ザサイトスピンは、一度乾燥させ、スピンダウンし、そして染色された、サンプルの構成を示しています。ほとんどのサンプルは、1ラウンドの核で、柱状および繊毛ある上皮細胞からなります。ヘマ3ステインキットを使用すると、彼らは暗い紫色の核（ 図2）とライトブルーの色を染色し、鼻から直接取得するとき、多くの場合、彼らは一緒に凝集が見られます。鼻の細胞試料は鼻から最初の細胞種のミックスだけでなく、破片であるが、文化の中で、メディアの変化と時間の経過とともに、上皮細胞は（図3A、B）優勢になります。上皮細胞がコンフルエントに成長しているとき、それらは核が大きく、中心部に位置し、細胞質は、「手を差し伸べる」とセルが（ 図3B）を分割するための準備として、ストレッチの一種である。たて割れ卵、のような形をしています細胞が一緒に成長するにつれ、彼らは（図サッカーの形状の多くを取るために開始し、皿にぴったりと一緒にフィット3C）。

細胞が形質導入されると、それらは、核内tdTomato蛍光マーカーを発現する。 図4は、それらが明視野で、形質導入された後、細胞を示す蛍光との両方の画像がマージされて。必ずしもすべての細胞は、マーカーを発現し、ありませんので、すべての細胞が形質導入されたが、各ウェルは、約90％の形質導入効率を持つ必要があり、これは、いくつかの細胞がMEFの上にメッキされた後、多能性を達成する可能性を増加します。

共培養したMEFと、細胞などがコロニーを形成し始めると、それらは次第にtdTomatoを発現して停止します。しかし、これは、コロニー形成の最良の指標ではありません。コロニー形成の最良の指標で目視確認です。多能性の「ゴールドスタンダード」であるhESCコロニーは、ほとんどがラウンドであり、ラーグと多くの小さな丸い細胞で構成されています電子核と細胞質の比が高く核。各セルは、主に核で構成される表示され、他の細胞小器官は、明確に表示されません。標準の無フィーダー条件でIPSCコロニーの収穫、および文化に続いて、新たに形成されたIPSCのコロニーはずっと彼らのヒトES細胞の対応のように見えるべきであり、 図5Bに見られるように、個々の細胞は、ヒトES細胞の表現型とほぼ同じです。

実験では、鼻上皮細胞（NEC-性IPSC）から生成されたiPS細胞を利用する前に、新しい行の品質を評価することをお勧めします。これは、典型的には核型、多能性マーカーの発現、および3胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）のそれぞれへの分化iPS細胞の能力を評価することを含みます。分化能は、多くの方法で試験することができるが、現在、最も厳しいアッセイは、奇形腫アッセイ^2,23,30です。このような転写などのより包括的なアッセイそして、エピゲノムプロファイリングは、任意の染色体異常が^23を再プログラミングすることによって導入されているかどうかを判断するのに有用です。

図1.下鼻甲介。サンプリング動きとサンプリング対象、下鼻甲介は、黒い矢印で示されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.サイトスピン。サンプルのほとんどは、一端に繊毛および他で円形の核で、長い柱状である上皮細胞で構成されています。鼻孔から直接サンプリングしたときに彼らはよく一緒に凝集されています。矢印は個々の上皮細胞を示しています。「https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

サンプルが収集され、メッキされた直後に、培養中の図3.プライマリ鼻の上皮細胞。（A）浮遊細胞および残骸。 （B）細胞を1日後に継代されています。細胞の形態は一貫しており、文化は主に鼻上皮細胞、倍率10倍、および（C）5X倍率で構成されています。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

NECSの図4.形質導入。細胞ベクトルを取り、赤色蛍光マーカーtdTomatoを示している形質導入されています。彼らは多能性状態に向かって進行するように、このマーカーは、フェードインする必要があります。 （A）形質導入細胞の明視野像。 （B）形質導入された細胞の蛍光画像。 （C）明視野のオーバーレイおよび蛍光画像（パネルAおよびB）。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5. IPSCは、細胞様コロニーを幹。（A）のMEFに成長、コロニーはほとんど縁に円形であり、ノー分化に少しを示しています。 （B）個々の細胞は、大きな核を有する小さな丸い細胞を用いて、典型的なヒトES細胞様の形態を示しています。5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

鼻上皮細胞（NECS）気道疾患を研究するためのアクセス可能なプラットフォームであり、NEC-iPS細胞は、疾患の発症、治療および治療^1,31,32を探索するエキサイティングな道を提供しています。 NECSは簡単にストレスの多いまたは潜在的に有害な手順^6,23なく得ることができます。我々の経験では、このプロトコルで説明したように鼻粘膜のサンプリングは、子供のための採血よりも知覚ストレスの少ない、より良いように思われます。したがって、この方法は、特に小児患者集団において有用と気道疾患の研究に関連し得ます。 NECSの他の利点は、それらが培養されているならば、上皮細胞は、培地および培養条件にするために選択され、均質になることです。これは、血液細胞のような複雑な組織を使用するよりも有利であり、それは容易にトランスクリプトームおよびエピジェネティックなアプローチを使用して、IPSCラインの結果として生じるで細胞起源の影響を評価することができます。

いつ鼻粘膜のサンプリングは、主に上皮細胞が取得されるように、顕微鏡（ 図2）の下にサイトスピンを見て明らかなように、鼻の正しい領域がサンプリングされることが重要です。正しいサンプリングは≥90％上皮細胞が得られます。健康な患者からのサンプルを得ること、及びサンプルが得られ、めっきセルの数を最大にするために適切に収集されることを確実にするために重要です。プロトコル（セクション1.5）で説明したねじれ運動は、ブラシができるだけ鼻表面のできるだけ多くに接触することを保証します。異物が自分の顔に向かっているときに頭をオンにする自然な反射です。したがって、子供が彼または彼女の頭を回すか、引き離された場合には、サンプルを迅速かつ正確に発生することが不可欠です。これらの技術を使用して、プロトコルの他のすべてのステップの効率を高め、成功した再プログラミングの可能性を決定します。子供を頼みます横になる、とさえ、それらの下に手を置いたり、親または兄弟が自分の手を握り持っていることはまだ嘘をつくと、滑らかかつ無痛サンプル収集を保証するために役立つことを奨励するための良い方法です。

最近、いくつかの他のサンプリング技術は、セルの内容や組成に基づいて、快適性、使いやすさ、およびサンプルの成果について評価されているだけでなく、RNAとDNAは^33が得られます。グループは、ポリエステル綿棒対細胞診ブラシでサンプリングを見直し、彼らが積極的に鼻孔の周りにブラシや綿棒を旋回することにより下鼻甲介だけでなく、前鼻孔の両方をサンプリングしました。それは最高のRNA収量を得なかったとポリエステル綿棒に比べて、ほとんどの繊毛上皮細胞で構成されているがブラシで下鼻甲介のサンプリングは、少し不快であることが判明しました。このプロトコルで提案された方法は、したがって、呼吸気道を研究するための方法として、鼻上皮をサンプリングする最も信頼性の高い方法であることを検証します上皮。

試料が得られたら、それを37℃に維持されなければなりません。最も効果的な方法の1つは、参加者を満たすために準備をしながら、安全な輸送のための発泡スチロールの容器により大きい37°Cと寄り添うそれにビーカーの水を温めることです。サンプルが収集される直前に、温度を約37℃になるように冷たい水を追加し、メディアとコニカルチューブを追加します。ブラシが円錐管に添加した場合、水槽に直ちにチューブを返し、それが実験室に戻すことができるまで、そこに維持し、チューブをその時点で細胞がなるまで規制を37℃の水浴に置かれるべきです培養フラスコに播種。すべての点では、無菌技術が文化に外国人のエージェントを導入することを避けるために使用されるべきです。

細胞は培養中に置かれたときにサンプル間の変動のかなりの量が見られました。この変動は、ドナーソースの両方に由来するように見えただけでなく、サンプルの質そのもの。サンプルの品質を向上させる一つの方法は、各鼻孔からの1つのブラシ、または参加者ごとに2つのブラシを得ることです。細胞が継代されるように新鮮なサンプルを播種した後、及び、細胞の状態は、彼らが再プログラムすることが適合していることを確認するために定期的に監視する必要があります。以下のための最良の候補を作る細胞は、培養に取り、迅速に増殖するものです。これは、特定のドナーからの細胞を他の細胞からのものよりも堅牢である理由は不明であるが、それは、このようなサンプリング時の年齢、鼻の大きさ、およびドナーの健康のような要因に起因し得ます。サンプルの収量は非常に少数の細胞、または少数の細胞のみが、一度メッキアタッチすると、サンプルは、コンフルエンスまで成長することはほとんどありません。苦労文化がコンフルエンスに達しない場合は、細胞が弱くなる傾向があり、多くの細胞が継代中に死亡します。細胞が迅速かつ確実に増殖することが必須であるように、サンプルのこのタイプは、再プログラミングのために非常に悪い候補であり、それらはあること可能な限り早期の継代数で形質導入されました。薄すぎるドナーの変動、貧困層のサンプリング、または継代培養によるものかどうか、ゆっくりと成長している細胞をトランスフェクトすることはお勧めできません。再プログラミングが悪い細胞培養を試みている場合、結実に進むことはほとんどありません。

形質導入のために、細胞を準備するための準備が最も困難であるプロトコルの一部です。細胞の成長に基づいて、2×10 ^5〜5×10 ⁵の細胞を形質導入し、特定の患者のサンプルに依存するこの月のために提案されています。したがって、理想的な数を得るために細胞数を変えてめっき少数のウェルを必要とし得ます。

このプロトコルは、サンプリングの容易さだけでなく、より持続可能で汎用性の高い研究の機会のためのIPSCラインに比較的容易とスケジュール初代細胞培養物を確立する、およびそれらの初代細胞培養物のその後の再プログラミングだけでなく、概要を説明します。全体診療所からの文化の中で個別のiPS細胞の樹立にプロセスは、約3ヶ月かかり、再プログラミング時間を短縮するための新しい方法は^{、6,34,35を}開発されています。このフィールドは、急速にiPS細胞に一次細胞を変換するために、その後、目的の特定の細胞および組織型にiPS細胞を区別するために、より効率的かつ完全な方法を見つけるために進化しています。しかし、このような肺上皮などの気道疾患のための重要な組織のための分化プロトコルは、まだ^36-38を働いされています。

NECSからiPS細胞を生成することは、細胞の単純かつ比較的簡単分離の利点を有しています。また、NEC-iPS細胞を利用することができる他の組織型に由来するiPS細胞上の利点を提供することが可能です。証拠はマウスおよびヒトiPS細胞は、それらの体細胞の転写とエピジェネティックなメモリを抱いていることを示しているが、その後のIPSCの分化に対するIPSCのエピジェネティクスの影響は完全には理解されていません起源とこれが選択他の運命^5,26を制限しながら、ドナー細胞の種類に関連付けられている系統への分化に有利に働くこと。原因起源の組織の重要性、そしてどのようにこの影響特に組織特異的なエピジェネティックマークの保持^39-45に対するiPS細胞の機能特性に、IPSCラインがより明確によりよく理解するために研究する必要があります起源の組織の影響。以前にNEC由来のiPS細胞は、起源²³のそれらの組織のエピジェネティックな記憶の保持を示すゲノムのメチル化署名を保有することが示されています。以前の研究は、より容易に、線維芽細胞またはより血液細胞に分化された起源の血液細胞のエピジェネティックなメモリを示し、血液細胞由来のiPS細胞が示されているようにNEC-性IPSCに保持そのようなエピジェネティックなメモリは、気道細胞への多能性幹細胞の分化において有益であり得ますblooを欠く平滑筋由来のiPS細胞dは細胞特異的なエピジェネティックなメモリ^5,26。モデリング肺疾患のためのIPSC由来の気道細胞の巨大な可能性を考えると、NECSは気道細胞/組織へのiPS細胞の分化のための最適な細胞の種類を表しているかどうかを検討することが重要になります。また、この安定に維持メモリは再プログラミング及びドナー細胞の疾患状態の候補に耐性の染色体位置を表すことができます。 iPS細胞を変換するためのプロトコルは、近位にし、遠位の肺の細胞型が^{36から38を}開発しているように、これらのNEC-性IPSCは、喘息、COPD、嚢胞性線維症、およびその他多くの肺の開発に環境への影響を研究する上でのモデリング気道疾患に利点を有していてもよいですそして、恒常性。

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Acknowledgments

著者らは、多能性幹細胞機能とシンシナティ小児病院での共焦点イメージングコアを承認したいと思います。この作品は、R21AI119236（HJ）、R21AI101375（HJ）、NIH / NCATS 8UL1TR000077-04（HJ）、U19 AI070412（HJ）と2U19AI70235（GKKH）によってサポートされていました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical	Fisher Scientific	14-959-49D	Protocol Step 1.1.
BEGM	Lonza	CC-3170	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide	Life Technologies	15240-062	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep	Life Technologies	15140-122	Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush	Fisher Scientific	22-263-357	Protocol Step 1.2.
trypan blue	Fisher Scientific	MT-25-900-CI	Protocol Step 2.1.
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-54	Protocol Step 2.1.
PBS	Fisher Scientific	BP2438-4	Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357	Protocol Step 2.2.
cytospin funnel	Fisher Scientific	23-640-320	Protocol Step 2.2.
Cytospin 4	Fisher Scientific	A78300003	Protocol Step 2.2.
blank slide	Fisher Scientific	S95933	Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit	Fisher Scientific	22-122-911	Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1	Life Technologies	A1064401	Protocol Step 3.2.
T25 flask	Fisher Scientific	08-772-45	Protocol Step 3.3.
Trypsin	Lonza	CC-5012	Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002	Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min	Sigma-Aldrich	F2442	Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650	Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus*	e.g. Millipore	SCR511	Protocol Step 6.4. A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting
polybrene	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220	Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	GSC-6301G	Protocol Step 6.4.
hESC media	See recipe included in protocol		Protocol Step 6.11.
SB431542	Stemgent	04-0010	Protocol Step 6.11.
PD0325901	Stemgent	04-0006	Protocol Step 6.11.
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel	BD Biosciences	354277	Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well	Fisher Scientific	08-772-1B	Protocol Step 6.13.
mTeSR1	StemCell	5850	Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm)	Fisher	SCGP-U02-RE
dispase	StemCell	7923	Protocol Step 7.3.
DMEM/F12	Life Technologies	11320-033	Protocol Step 7.3.
cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240	Protocol Step 7.4.
hESC Media**			Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media	Invitrogen	11330-032	Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR)	Invitrogen	10828-028	0.2
200 mM L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	0.1 mM
100x non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)	Invitrogen	13256-029	4 ng/ml