Summary
Мы опишем весь Mount-гибридизация процедуру мульти-целевой хромогенную (MC-желанию) в интактных эмбрионов дрозофилы, позволяющих одновременно и конкретное обнаружение трех различных моделей распределения мРНК путем контрастных цветовых выделений.
Abstract
Для анализа генов регуляторных сетей активные во время эмбрионального развития и органогенеза, что имеет важное значение для точного определения того, как различные гены экспрессируются в пространственном отношении друг к другу на месте. Мульти-целевой Хромогенный вся монтажа в гибридизация (MC-желанию) значительно облегчает мгновенное сравнение паттернов экспрессии генов, так как она позволяет отличительный визуализации различных видов мРНК в контрастные цвета в том же образце пробы. Это обеспечивает возможность связать экспрессии генов домены топографически друг к другу с высокой точностью и определить уникальные и перекрывающиеся участки экспрессии. В представленном протоколе мы опишем процедуру MC-Wish для сравнения мРНК из структур различных генов в эмбрионах дрозофилы. До трех РНК-зондов, каждый конкретный другого гена и помечены другим гаптена, одновременно гибридизации с образцами зародышей и впоследствии обнаружены щелочипе фосфатазы основе колориметрического иммуногистохимии. Описанная процедура подробно здесь дрозофилы, но одинаково хорошо работает с эмбрионами данио.
Introduction
В гибридизация (ISH) является стандартным методом для обнаружения и локализации РНК-транскриптов в морфологической контексте, в клетках, тканях и организмах 1. Сигналы, полученные в соответствии с процедурой ISH обычно визуализируется радиоактивных, люминесцентных и пигментных систем обнаружения. В последние годы значительные технологические достижения в люминесцентной ISH (FISH) 2 привело к резко улучшить чувствительность и разрешение, что позволяет обнаружения и количественного выражения РНК в одной ячейки и суб-клеточном уровнях и РНК визуализации до единичных молекул 3,4 .while изощренные методы одиночных молекул FISH используются для более специализированных приложений, Хромогенный ISH широко распространена в качестве рутинной РНК в месте обнаружения метода в исследования и клинической диагностики. Для хромогенным обнаружения фермента реакции осаждения используются, которые генерируют видимые продукты в контрастные цвета на сайтахгибридизации 5. Это имеет то преимущество, что РНК визуализации могут быть объединены с обычными гистологическими пятен и морфологической контексте сразу видно, с помощью стандартной светлого микроскопии. Кроме того, многочисленные применяемых цветовых подложках произвести осадок, которые стабильны в органических и / или водных средах монтажных, так что постоянные препараты образец может быть получен 5.
В дрозофилы, начальные протоколы ISH применяется радиоизотопных меченых зондов для обнаружения стенограммы на секционного материала 6. Хотя это трудно восстановить из срезов тканей полная расшифровка моделей целых эмбрионов или системы органов, применение хромогенных процедур ISH с не радиоактивно меченых зондов делает возможным обнаружение распределения глобально РНК в цельной крепления 7. Хотя многие вариации хромогенным ISH существует, в типичных вся монтажа в гибридизация (желанию) протоколы Hybridized гаптен-меченых зондов обнаруживаются анти-гаптен антител, конъюгированных с ферментом-репортером и транскрипты мРНК визуализируются осаждающего хромогена.
Палитра разноцветных осадков, производимых ферментов-репортеров щелочную фосфатазу (AP), пероксидазу хрена (POD) и бета-галактозидазы (GAL) учитывает отличительные детектирования нескольких мишеней в одном и том же образце 8-14. Тем не менее, POD ферментативная активность длится только в течение ограниченного периода времени и GAL колориметрический реакция несколько менее чувствительны, так что без дополнительного (tyramide) усиление сигнала 15 обнаружения менее обильными стенограммы может быть сложным с этими ферментами. В отличие от этого, непреходящая деятельность AP позволяет для длительного оборота подложки и высоким соотношением сигнал-шум. Таким образом, последовательное обнаружение с помощью фермента-репортера AP с разноцветных подложек оказался успешным в обеспечении эффективного иОтличительной обнаружение до трех различных транскриптов в единичных эмбрионов 10-12,16.
Для этого мульти-целевой хромогенным WISH (МС-желанию) метода (рис 1) 14, меченые антисмысловые РНК-зонды порождаются в пробирке транскрипции и отмечены в одной из доступных гаптен- этикеток. Эмбрионы формальдегида фиксированной и проницаемыми путем обработки метанолом и протеиназы К пищеварения. Гибридизация эмбрионов одновременно осуществляется до трех разному маркированных антисмысловой РНК зондов, специфичных для каждого другого гена. После удаления несвязанного зонда по жесткости моет каждый гаптен-лейбл визуализируется в отдельном раунде обнаружения. Один раунд обнаружения состоит из инкубации эмбрионов с анти-гаптен антитела, связанного с АП и РНК визуализации путем приложения AP-субстрат, который производит локализованную стабильную цветовую осадок. После обнаружения антител и окрашивания, приложенное антитело-AP conjuВорота удаляют мытье низкой рН. В многоцветных экспериментов, каждый виток обнаружения использует антитело направлено против другого гаптена метки, и каждый образец транскрипт визуализировали другого цвета подложки (таблица 1). Эмбрионы установлены в глицерине и отображаемого под сложный микроскоп высокого разрешения с использованием дифференциального интерференционного контраста (DIC) оптики.
Protocol
1. Маркировка РНК-зондов с In Vitro транскрипции
- Соберите в пробирке реакция транскрипции в микропробирку 1,5 мл под РНКазы условиях: 10,5 мкл DEPC лечение Н 2 О, 4,0 мкл 5x буфера транскрипция, 1,0 мкл (1 мкг) линеаризовали, очищенная ДНК-матрицы в DEPC обработанной H 2 O, 1.3 мкл NTP смесь, 0,7 мкл гаптен- помечены UTP, 0,5 мкл РНК RiboLock ингибитор, 2,0 мкл РНК-полимеразы.
Примечание: Конечный объем реакции 20 мкл. - В зависимости от последовательности промотора Т7 использования шаблона, Т3 или SP6 РНК-полимеразы для транскрипции в пробирке (см ссылки 17).
- Выберите дигоксигенином-11-UTP, биотин-16-UTP или флуоресцеина-12-UTP в качестве метки для РНК зонда. Для более подробной информации см обсуждение гаптен- этикеток и концентрации зондовых в дискуссии.
- Смешайте реакции транскрипции и спин вниз в ближайшее время.
- Давайте расшифроватьв течение 3 ч при 37 ° С.
- Добавить 1 мкл РНКазы ДНКазы I в реакции транскрипции для удаления матричной ДНК, хорошо перемешать, и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С.
- Отрегулируйте с DEPC обработке H 2 O объем выборки 200 мкл.
- Добавить 100 мкл (0,5 объема) ацетат 7,5 М аммония и 600 мкл (3 т) этанола, чтобы осадить меченой РНК зонд. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Не используйте ледяной этанола, так как это может привести к нежелательному осаждению без образования юридического лица нуклеотидов.
- Спин вниз транскрипции РНК в контролируемой температурой центрифуге при максимальной скорости (20800) XG в течение 30 мин при температуре +20 ° С. Тщательно аспирата супернатант.
- Промыть Полученный осадок с 70% этанола при комнатной температуре и центрифуге при 20,800 х г в течение 10 мин при + 20 ° С.
- Удалить супернатант, и будьте осторожны, чтобы случайно не потерять аспирации осадок. Пусть воздух сухой осадок в микропробирку с открытой крышкой в течение нескольких минут при комнатной температуре.
- Дисрешить Полученный осадок в 100 мкл DEPC обработанных H 2 O.
- Добавить 300 мкл предварительно гибридизации буфер (50% об / об деионизированной формамида, 5x SSC, 50 мкг / мл гепарина натриевую соль, 0,1% об / об Твина-20, 5 мг / мл Torula РНК) и хранят при -20 ° C , Зонды могут быть долгосрочным хранили при -20 ° С.
Примечание: для первого испытания вновь транскрипции зонда разбавленной 3 мкл гаптен-меченой РНК зонд в 100 мкл буфера для гибридизации, чтобы получить конечную концентрацию для эксперимента желание.
2. Обработка эмбриона образцов с использованием вставки
Примечание: Использование микротрубки или нескольких пластин также для обработки эмбрионов через различные этапы инкубации несет риск потери значительных количеств эмбрионов, случайно аспирационных их при обмене решений. Чтобы избежать этих потерь, это может быть полезно использовать корзины (например, Netwell вставки) для проведения образцы эмбрионов с помощью процедуры. Эти полистирола входные с полиэфирной сетки в нижней (рис 2А), на котором эмбрионы отдохнуть во время обработки.
- Для обработки эмбрионов в порядке желание, собрать вставки в 12-луночного планшета (рис 2B) в и добавьте 2 мл соответствующего раствора в каждую лунку.
- Внесите эмбрионов в вставок синий кончик. Убедитесь, что все эмбрионы погружаются в жидкости.
- Когда время инкубации в течение месте эмбрион, содержащий вставки в другой 12-луночный планшет, который заполнен раствором на следующей стадии.
- Использование носителей и ручки (фиг.2С) передавать до 12 образцов одновременно от одного решения к другому (фиг 2D).
Примечание: Для того, чтобы уменьшить требуемые объемы, использовать 2,0 мл микропробирки для шагов до гибридизации / гибридизации (см ШАГ 4.1) и 24-луночных планшетах для окрашивания реакций (шаг 6.2). Гибридизации и окрашивания реакции проводят в объемах 1001; л и 400 мкл, соответственно.
- Использование носителей и ручки (фиг.2С) передавать до 12 образцов одновременно от одного решения к другому (фиг 2D).
3. Подготовка эмбрионов для гибридизации
- Сбор, dechorionate, исправить, и devitellinize эмбрионов с использованием стандартных процедур 14,18. Подготовленные эмбрионы хранятся обычно в метаноле при -20 ° С.
- Эмбрионы передачи, которые будут использоваться для в гибридизация до комнатной температуры и распределяют в вставками 12-луночного планшета, заполненной 2 мл метанола на лунку.
- Увлажняет эмбрионов через убывающей метанола серии при комнатной температуре. Инкубируйте эмбрионов каждый раз в течение 3 мин в: (I) 75% метанола в 1X PBS (II) 50% метанола в 1x PBS, 0,1% Tween-20 (III) 25% метанола в 1x PBS, 0,1% Tween-20 (IV ) 1X PBS, 0,1% Tween-20 (V) 1X PBS, 0,1% Tween-20.
- Предварительно исправить эмбрионов в 4% параформальдегида в PBS 1x в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Удалить фиксатором на 4 промывок в течение 3 мин в 1x PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре. Между тем таять и подготовить протеиназы К и глицина рабочих растворов.
- Остановить реакцию двух промывок 1 мин в 2 мг / мл глицина в 1x PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре.
- После фиксации эмбрионов в 4% параформальдегид в PBS 1x в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Впоследствии удалить параформальдегида фиксатором промывкой четыре раза в течение 3 мин в 1X PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре.
- Фиксировали эмбрионы передачи предварительно гибридизации буфер. Эмбрионы Хранить в предварительно гибридизации буфера при -20 ° С или непосредственно приступить гибридизации зондов.
4. Гибридизация зондов
- Эмбрионы передачи хранили при -20 ° С в предварительно гибридизации буфера до комнатной температуры. Распределить эмбрионов в предварительно гибридизации буфера в 2,0 мл microtubES.
- В течение 30 мин, как минимум, предварительно гибридизуются образцы эмбрионов при 65 ° С в предварительно гибридизации буфера.
Примечание: Для предварительной гибридизации и гибридизации шаги водяной бане используется. Во время предварительной гибридизации есть время, чтобы подготовить смесь зонда путем объединения до трех антисмысловой РНК зондов, каждый конкретный для другого транскрипта гена и помечены с другим гаптена. - Чтобы получить смесь зонда, сложить соответствующие количества (обычно от 1 мкл до 6 мкл) каждого желаемого оригинального гаптен-меченых антисмысловой РНК-зонда в 100 мкл гибридизации буфера (50% об / об деионизированной формамида, 5x SSC, 50 мкг / мл гепарина натриевую соль, 0,1% об / об Твина-20, 5 мг / мл РНК Torula, 5% вес / объем сульфата декстрана).
Примечание: Добавление декстрансульфата является необязательным. - Денатурации смеси зонда антисмысловой РНК в нагревательный блок при 80 ° С в течение 5 мин. Впоследствии передачи денатурированный зонд смесь непосредственно до 65 ° С.
- Удалить большую часть предварительной гибридизациибуфер из образцов эмбриональных и добавьте денатурированный смесь зонда.
- Пусть Образцы эмбриона гибридизации с зонд смесь O / N при 65 ° С.
Примечание: температурах в диапазоне от 55 ° C и 65 ° C, которые обычно используются для гибридизации, до и после гибридизации шагов. Гибридизации при 65 ° С обеспечивает наиболее жесткие условия и рекомендуется при фоновых задач при использовании более низких температур. Если нет фоновые задачи, гибридизацию при 55 ° С рекомендуется, что обеспечивает преимущество улучшенной силы сигнала и улучшенной целостности эмбриона. - На следующее утро, в первую передавать жесткость промывные растворы до 65 ° С, чтобы убедиться, что они нагреваются до нужной температуры во времени.
- Передача гибридизации смесь зонд с эмбрионов из микропробирок 2,0 мл в вставками 12-луночного планшета, содержащую 2 мл предварительно нагретого буфера гибридизации стирки (50% формамид в 2 х SSC, 0,1% Твин-20). Поместите 12-луночного планшета, содержащего ЭМОбразцы БРСМ в духовке и инкубировать в течение 20 мин при 65 ° С.
- Образцы Перенос эмбрионов в 2 мл буфера гибридизации нового стирки и инкубировать в течение 20 мин при 65 ° С. Повторите этот шаг еще раз.
- Удалить излишки зонд 20 мин стирок при температуре 65 ° С, один раз в 2 х SSC, 0,1% Твин-20 и три раза в 0,2 х SSC, 0,1% Твин-20.
- Передача образцов эмбрион 1x PBS, 0,1% Твин-20 при комнатной температуре.
- Инкубируйте эмбрионов в блокирующем буфере (8% овечьей сыворотки в 1x PBS, 0,1% Tween-20) в течение не менее 30 мин при комнатной температуре.
5. Выявление антител гаптен-меченых зондов
Примечание: В отличие от одновременного гибридизации всех трех зондов разному маркированных, каждый зонд обнаружена одна за другой в отдельных этапов инкубации антител и окрашивания. Таким образом, в каждом раунде обнаружения используется только одно антитело (или анти-дигоксигенином AP или антифлуоресцентного-AP или анти-биотин-AP).
- Выбор между STEP5.1.1 5.1.3 и продолжить подготовку соответствующего разведения антитела в соответствии с гаптен-этикетки, который должен быть обнаружен.
Примечание: В случае последовательного обнаружения разному меченых зондов, другой анти-гаптен-антитело применяется в каждом цикле обнаружения.- Для обнаружения меченого флуоресцеином зонда разбавленной антифлуоресцентного-AP конъюгатов 1: 4000 в блокирующем буфере.
- Для обнаружения дигоксигенином меченного зонда разбавить анти-дигоксигенином А.П. сопрягает 1: 4000 в блокирующем буфере.
- Для обнаружения биотин-меченным зондом подготовить анти-биотин-AP раствор конъюгата в разведении 1: 4000 в блокирующем буфере.
- Инкубируйте эмбрионов в растворе выбранного анти-гаптен-AP от 3 до 4 ч при комнатной температуре. В качестве альтернативы, инкубировать O / N при 4 ° С. Не применять все три антитела одновременно.
- Для того чтобы удалить несвязанного антитела мыть эмбрионов с 1x PBS, 0,1% Tween-20 в 4 раза 15 мин при комнатной температуре.
- Чтобы изменить буферные системы былоч в два раза 15 мин при комнатной температуре в TNT (0,1 М Трис-HCl рН 8,0, 0,1 М NaCl, 0,1% Твин-20).
6. щелочной фосфатазы Хромогенный Окрашивание
- После обнаружения антител выбирать между STEP 6.1.1 6.1.4 и заполните один из щелочной фосфатазы хромогенными реакций окрашивания, чтобы получить желаемый цвет сигнала (см таблицу 1). Для каждого раунда обнаружения другой хромогенного субстрата реакции применяется для выделения каждого транскрипта шаблон в другой цвет.
- Быстрый Красный Окрашивание
- Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в TT8.2 (0,1 М Трис-HCl рН 8,2, 0,1% Твин-20).
- В то время как мытье эмбрионов, подготовить Быстрая Red окрашивания раствора из Fast Красный TR / NAMP субстрата щелочной фосфатазы таблетки Set.
- Растворите буферную таблетку из планшета установлен в 1 мл дистиллированной воды и перемешивают на вортексе, чтобы получить 0,1 М Трис-HCl рН 8,2.
- Оставьте Быстрая таблетку Красный TR / NAMP в подготовленную ТРИС буфер и растворить встряхиванием для получения быстрого Red решение окрашивания.
- Ясно быстрого Красный окрашивание раствора от не-растворенных частиц через фильтр в шприце 0,2 мкм.
- Быстрый Голубой Окрашивание
- Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в свежем буфере окрашивания SB8.2 (0,1 М Трис-HCl рН 8,2, 0,1 М NaCl, 0,05 М MgCl 2, 0,1% Твин-20).
- При промывке эмбрионы, подготовить Fast Голубой красящий раствор из 50 мг / мл Быстрое Синий BB (ДМФА) в и 50 мг / мл фосфата нафтола (в ДМСО) маточных растворов.
- Свежий подготовить Быстрая Синий BB решение по 0,5 мг / мл в SB8.2.
- Свежий подготовить отдельный нафтол раствора фосфата в 0,5 мг / мл в SB8.2.
- По каплям добавляют подготовленную нафтол раствор фосфата в быстро Синий BB раствора при постоянном перемешивании с вихря. Полученную окончательный рабочий концентрация 0,25 мг / мл для обоих компонентов субстрата.
Примечание: Different Быстрая синий / НАФТОЛ phospКомбинации ненависти привести в различных цветовых оттенков (см таблицу 1).
- BCIP / НБТ Окрашивание
- Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в свежем буфере окрашивания SB9.5 (0,1 М Трис-HCl рН 9,5, 0,1 М NaCl, 0,05 М MgCl 2, 0,1% Твин-20).
- Для purpleblue хромогенным сигнала, недавно подготовить BCIP / NBT окрашивания решение, добавив 1 мкл левамизол, 3.5 мкл BCIP и 4,5 мкл NBT на мл буфера окрашивания SB9.5 и хорошо перемешать.
- INT Окрашивание
- Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в свежем буфере окрашивания SB9.5.
- Для yellowbrown хромогенным сигнала, недавно подготовить INT окрашивания решение путем добавления 1 мкл левамизол, 5 мкл Magenta-Фос и 5 мкл INT на мл буфера окрашивания SB9.5 и хорошо перемешать.
Примечание: Также можно использовать 7,5 мкл / мл BCIP / INT готов к использованию решение окрашивание.
- Быстрый Красный Окрашивание
- Для образцов эмбриональных окрашивание передачи реакцияв 24-луночный планшет. Инкубируют каждый образец в 400 мкл выбранного окрашивающим раствором в темноте.
- Монитор иногда сигнализировать развитие под стереомикроскопа. Остановить реакцию окрашивания, когда требуемая прочность сигнал получается и до наблюдается значительное фоновый сигнал.
- Чтобы остановить хромогенную реакцию, передавать окрашенные эмбрионы в вставками из 12-луночного планшета, содержащего 2 мл на лунку TNT. Промыть окрашенных эмбрионов два раза в тротиловом эквиваленте.
- Промыть эмбрионы два раза в течение 10 мин в 1 × PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре, чтобы удалить остатки субстрата.
7. Антитела удаления / инактивации щелочной фосфатазы
- Удалить антитела и инактивировать щелочную фосфатазу путем инкубации в 2 мл раствора с рН низкой останова (0,1 М глицин-HCl, рН 2,2, 0,1% Твин-20) в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Промыть в течение 1 мин с 2 мл 1 × PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза в течение 3 мин в 1X PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре.
8. Во-вторых обнаружения Круглый
- Для обнаружения картину распределения второго стенограммы продолжить обнаружения антитела гаптен-меченых зондов (шаг 5,1 до 5,4), используя антитело-AP конъюгатов, направленных против второго гаптен- этикетке.
- Выполните щелочной фосфатазы хромогенную окрашивание (STEP 6.1 до 6.5), применяя комбинацию подложки, который производит контрастный цвет на используемый в первом туре обнаружения (для цвета в наличии см таблицу 1).
- Удалить второе антитело-AP конъюгат, как описано в шаге 7.1 до 7.3.
9. В-третьих Обнаружение Круглый
- Для того чтобы обнаружить картину распределения третьего транскрипта, продолжить выявления антител гаптена-меченных зондов (шаг 5.1 до 5.4), используя антитело-AP конъюгаты, характерные для третьего гаптен-меткой.
- Выполните щелочной фосфатазы хромогенную окрашивание (STEP 6.1 до 6.5) применения комбинации материалов, что не было APкурсировали в предыдущих раундах обнаружения. Выберите хромогенную реакцию, которая производит цветной осадок легко отличить от предыдущих двух турах обнаружения (для выбора цвета см таблицу 1).
10. Монтаж и изображений
- Трансфер правильно окрашенных эмбрионов до 30% глицерина в PBS и инкубировать до эмбрионы полностью всасывается в растворе глицерина. Они хорошо уравновешенную, когда они опускаются на дно.
- Эмбрионы передачи до 70% глицерина в H 2 O, и пусть равновесие при комнатной температуре. Окрашенные эмбрионы могут быть сохранены в 70% глицерине при 4 ° С.
- Для монтажа, пипетки окрашенных эмбрионов в 70% глицерина капли на предметное стекло в и без касания прокладки приклеены к слайду (рисунок 3). Применить покровное.
- Посмотреть установлен эмбрионов при вскрытии микроскопом. Движение приложенной к покровным так, что эмбрионы вращаться в требуемом направлении.
- Соблюдайте правильноориентированные эмбрионы с высоким разрешением (20X, 40X цели) под микроскопом с соединением дифференциальных интерференционного контраста оптики.
- Захват изображения с цифровой цветной камерой и сэкономить на цифровые устройства хранения данных.
Representative Results
Описанный протокол позволяет одновременно визуализации нескольких шаблонов транскриптов в различных цветах. МС-WISH обеспечивает преимущество непосредственно сравнить характер экспрессии различных генов в той же эмбриона. В качестве примера, паттерны экспрессии пустых дыхальца (EMS) 19 Fushi tarazu (ЗСТ) 20 и неряшливо паре 1 (SLP1) 21 непосредственно сравниваются дрозофилы бластодермы стадии эмбрионов и визуализированы в различных цветовых оттенков (Рисунок 4) ,
Различные комбинации AP подложки можно получить панель контрастного цвета осадок (Таблица 1). Красный цвет осадок от быстрых красный и фиолетовый осадка, полученного по BCIP / НБТ может быть легко отличить и поэтому используются наиболее распространеннымLY в двухцветных экспериментов (4А). Тем не менее, пятно BCIP / НБТ может быстро превратиться в довольно темного цвета, так что быстрого Красный цвет маскируется в случае частичной совместном распространении транскриптов. Таким образом, применение Fast синий может быть преимуществом, которое генерирует синий, зеленый и фиолетовый продукты в сочетании с NAMP, NAGP и NABP, соответственно (таблица 1). Сочетание быстрого синий с NAMP дает светло-голубой цвет, который легко различимы от Fast Red продукта в соседних или перекрывающихся областей экспрессии, как показано здесь EMS и SLP1 сайтов экспрессии визуализированных в красный и синий, соответственно (рис 4б). Быстрое сочетание Голубой NAGP обеспечивает аналогичный сильный контраст с быстрым красное пятно, так что зеленый домена EMS явно отличительные от сайта красного SLP1 экспрессии (фиг.4С). Тем не менее, если EMS и SLP1 сайты экспрессии денал, Fast Голубой NABP и Fast Red, соответственно, в результате фиолетовый и красный цвет осадки менее заметны (рис 4D). Как уже упоминалось выше, быстрого Красный и Синий Быстрая NAGP легко отличить, как показано SLP1 и ЗСТ выражения в красный и зеленый, соответственно (рис 4D).
MagentaPhos в сочетании с INT производит желтый осадок, который используется, чтобы показать сегментную экспрессию СТЗ (фиг.4С, Е). Желтый цвет осадок и генерирует хороший контраст с синего цвета подложки, как на примере обнаружения SLP1 и ЗСТ с Fast Голубой NAMP и MAG / INT, соответственно (рис 4E). Тем не менее, желтый осадок легко различимы менее от быстрого Red продукта. Желтый домена окрашенных выражение EMS может быть чуть Дисти nguished от ростральной экспрессии SLP1 показано в красном (рис 4F). Таким образом, сочетание цветных подложек должен быть тщательно подобраны для каждого эксперимента.
Рисунок 1. Блок-схема MC-Wish. Для многоцветной визуализации из трех уникальных моделей стенограммы, выбирать между различными конъюгатов антитело-AP и комбинаций цвета подложки в каждом цикле обнаружения. Сокращения: AP, щелочной фосфатазы; БИО, биотин; DIG, дигоксигенин; FLUO, флуоресцеина. Для других сокращений см легенды Рисунок 4 и таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
S / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Вставки в качестве носителей эмбриона. (A) Вставки установлены внизу с полиэфирных мембран диаметром 15 мм и 74 мкм размер сетки используются в качестве носителей дрозофилы эмбрионов. (Б) вставки собраны в 12-луночных планшетах, которые функционируют как резервуара лотков для различных решений. (C) Доступные носители и ручки позволяют обработку (D) 12 проб / сэмплов эмбрион одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Установка окрашенных эмбрионов. Эмбрионы установлены в капле 70% глицерина между двумя пакетами покровные, которые функционируют как распорки. Нежный перемещение приложениялгал большой покровное помогает вращать установленные эмбрионов в нужной ориентации для наблюдения и фотографирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Многоцветный визуализация мРНК-транскриптов в эмбрионах дрозофилы. Примеры МС-WISH экспериментов в эмбрионах дрозофилы показано с боковым видом на. Паттерны экспрессии мРНК пустых дыхальца (EMS), Fushi tarazu (ЗСТ) и небрежно парные 1 (SLP1) визуализируются различных комбинаций субстрата цвета AP, которые указаны на каждой панели. Стенограммы были обнаружены (A) ЗСТ Fluo и EMS DIG, (
| Сочетание основания | Добавить 1 мл буфера А. П. | Concentraции [мкг / мл] | AP буфер | цвет | Чувствительность сигнала |
| BCIP НБТ | 3,5 мкл 4,5 мкл | 175 337,5 | SB9.5 | пурпурный | +++ |
| МАГ INT | 5 мкл 5 мкл | 250 250 | SB9.5 | желтый | + |
| BCIP / INT раствор | 7.5 мкл | 250 250 | SB9.5 | желтый | + |
| Быстрый Голубой NAMP | 5 мкл 5 мкл | 250 250 | SB8.2 | синий | ++ |
| Быстрый Голубой NABP | 20 мкл 10 мкл | 1000 500 | SB8.2 | Фиолетовый | ++ |
| Быстрый Голубой NAGP | 10 мкл 10 мкл | 500 500 | TT8.2 | зеленый | + |
| Быстрый Красный NAMP | 1 таблетка | 1000 400 | TT8.2 | красный | ++ |
Таблица 1. Комбинации подложки Сокращения: +++, сильный;. ++ Среднего; +, Слабый НБТ, хлорид 4-нитро-синего тетразолия-; BCIP, 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат; INT, 2- (4-иодфенил) -3- (4-нитрофенил) -5-фенил-тетразолия хлорида; МАГ, пурпурный-Фос, 5-бром-6-хлор-3-индолил-фосфат, NAMP, нафтол-AS-MX-фосфат; NABP, Нафтол-АС-БИ-фосфат; NAGP, Нафтол-АС-GR-фосфат; SB9.5, окрашивание буфера при рН 9,5; SB8.2, окрашивание буфере при рН 8,2; TT8.2, трис-Tween буфере при рН 8,2.
Discussion
В гибридизация (выход) с радиоактивно меченых зондов нуклеиновых кислот часто используется для определения локализации РНК на срезах тканей. Метод радиоактивных ISH, однако, требует много времени, менее чувствительны, и не позволяют признательность полных схем распределения стенограмма в целом-крепления. В противоположность этому, в настоящем документе метод описано МС-WISH позволяет непосредственное сравнение нескольких доменов экспрессии генов в контрастные цвета в интактных эмбрионов. МС-ЖЕЛАНИЕ имеет то преимущество, что гистологическое контексте сразу видно, и визуализировать просто стандартный светлого микроскопии. Это обеспечивает возможность связать экспрессии генов домены топографически друг к другу с высокой точностью и определить уникальные и перекрывающиеся участки выражение в быстрой и надежным способом. С другой стороны, мультиплексированный флуоресцентные ISH (FISH) является более мощным по отношению к чувствительности и разрешения и предпочтительно используется, если сотовой или даже субклеточном повторноРешение обнаружения мРНК требуется.
Широкий спектр транскриптов, что был картирован на MC-WISH предполагает, что практически любой транскрипт могут быть проанализированы не только в эмбриональных но также и в личиночной и тканей взрослого и в других, чем Drosophila видов. Действительно, описанная процедура подробно здесь дрозофилы, работает аналогично эффективным с эмбрионов данио 11,16,22. Кроме того, способ МС-WISH может быть адаптирована к широкому кругу беспозвоночных и позвоночных эмбрионов и образца ткани.
Гаптен- этикетки и концентрации зонда
Мы регулярно использовать флуоресцеин, дигоксигенином, и биотин, как гаптен этикетках РНК-зондов. Кроме того, динитрофенол-меченых зондов могут быть применены, который были введены в данио WISH экспериментов 23-25. Меченных флуоресцеином зонды отображения меньшую чувствительность по сравнению с другими гаптен-меток, так что флуоресцеин лучше всего использовать Fили обнаружение обильных транскриптов. Каждый вновь переписана зонд впервые опробован в одном ПОЖЕЛАНИЙ эксперимента, где его производительность оценивается либо с помощью BCIP / NBT или Fast красный в качестве субстрата. Концентрация зонда считается оптимальным, когда сильный сигнал без развития фона достигается в течение нескольких минут, чтобы ч.
Чтобы убедиться, что домены экспрессии интерес были обнаружены в их полном объеме по MC-желание, важно, чтобы визуализировать каждый транскрипт шаблон по одной метки экспериментов с использованием WISH наиболее чувствительный сочетание подложки, BCIP / NBT. Это гарантирует, что слабые домены экспрессии не забывают в нескольких целевой эксперимента в. Чтобы компенсировать меньшей чувствительности других комбинаций субстрата это необходимо использовать в два раза (три раза), чтобы концентрации зонда по сравнению со стандартными BCIP / NBT окрашивания.
Низкая инактивация рН
Инактивация шаг с низким рН может привести кчастичная дезинтеграция антисмысловых гаптен-меченой РНК зонд / чувство мРНК гибридов приводит к снижению обнаружения сигнала в втором и третьем раундах окрашивания. Чтобы свести к минимуму потерю чувствительности, шаги инактивации как можно короче. Мы испытали, что в 10 мин времени инкубации при низких рН является достаточным для ликвидации AP-деятельности. Последующие быстро смывает в больших объемах обеспечить быстрое разбавление несвязанных конъюгатов антитело-AP и предотвратить повторное связывание с haptenized зондов. Альтернативные процедуры включают параформальдегид фиксации и тепла инактивации. Тем не менее, некоторые из цветных выделений не термостабильной и фиксацией параформальдегидом не может быть достаточно для полной инактивации AP. Неполное инактивации первого прикладного антитело-AP, сопряженных может привести к повторной визуализации мРНК шаблона в следующий раунд обнаружения приводит к ложных срабатываний перекрытия в выражении с второго вида мРНК для обнаружения. Таким образом, в контрольном эксперименте йе эмбрионы разделить на две фракции после инактивации первого прикладного антитело-AP конъюгата. Второе антитело-AP конъюгат исключены из фракции управления и не должны формировать сигнал во второй цветной реакции. Тем не менее, если второе цветной реакции генерирует сигнал распределения рисунок, соответствующий первому, то процедура инактивации была неэффективной. В этом случае время инкубации в низком рН раствора остановки должны быть пролонгирован на следующий эксперимент.
Заказы А.П. применения подложки
Так чувствительность падает с каждым последующим тура обнаружения, желательно, чтобы обнаружить в меньшем количестве мРНК до более обильными транскриптов. Кроме того, быстрый красный и синий Быстрые комбинации субстрата значительно менее чувствительны, чем purpleblue BCIP / NBT пятна, так что быстро красители предпочтительно наносят в первом раунде окрашивания для обнаружения сильного выраженной транскрипта. Это также чкак преимущество, что после BCIP / НБТ окрашивание можно контролировать и вовремя остановился, прежде чем сигнал purpleblue становится слишком темно в отношении легких быстрых красителей. Таким образом, в стандартной двухцветной эксперимента, сначала, тем сильнее выражена мРНК обнаруживается Fast Red и второй более слабый по BCIP / НБТ. В качестве альтернативы быстрого красителей желтые комбинации INT подложки могут быть применены, которые, однако, производят осадков, которые становятся диффундируют через некоторое время. Поэтому BCIP / INT исключительно применяются в последнем туре окрашивания. Следовательно, в три цвета эксперимента в мы часто сначала использовать быстрый Red, второго BCIP / НБТ (или быстрый синий) и третий комбинацию подложки INT. Обратите внимание, что желательно, чтобы сфотографировать окрашенных эмбрионов как можно скорее при применении INT.
Флуоресцентные обнаружения азокрасителей
Это может быть иногда трудно распознать пересекающиеся паттерны экспрессии, когда темный цвет осадок слежка более легкое. Fили, например, сильно развита BCIP / НБТ осадок может маскировать легкие сигналы Быстрая краска. Один из способов обойти эту проблему, чтобы сразу захватить изображения после каждого окрашивания и удалить нанесенный цветной осадок до следующего раунда обнаружения. В этом случае спирте азокрасителя (Fast Red) и INT осадки удаляют этанол промывок после первого и второго раундов обнаружения, соответственно, и окрашивание BCIP / NBT применяется в качестве последнего AP-подложки 26. Другая возможность состоит в использовании флуоресцентных свойств азокрасителей. Быстрый Красный могут быть визуализированы с помощью родамина фильтр устанавливает 27, в то время быстрого Синий можно наблюдать далеко красных фильтров 28,29. Сравнение или наложение хромогенными и флуоресцентных изображений может выявить сайт совместного distribution.Using этот подход, развитие BCIP / НБТ сигнал должен быть остановлен во времени, так что это не станет слишком плотным и утолить флуоресцентный сигнал азокрасителя Продукт реакции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolor whole-mount in situ hybridization. Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
