Summary
Vi beskriver et multi-target kromogent hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) proceduren i intakte Drosophila embryoner tillader samtidig og specifik påvisning af tre forskellige mRNA fordelingsmønster ved kontrasterende farve bundfald.
Abstract
For at analysere genregulerende netværk, som arbejder under fosterudviklingen og organogenese er det vigtigt at præcist at definere, hvorledes de forskellige gener udtrykkes i fysisk forhold til hinanden in situ. Multi-target kromogent hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) i høj grad letter den foreliggende sammenligning af genekspressionsmønstre, da det giver mulighed karakteristiske visualisering af forskellige mRNA-arter i kontrastfarver i den samme prøve prøven. Dette giver mulighed for at relatere genekspression domæner topografisk til hinanden med stor nøjagtighed og definere unikke og overlappende ekspressionssteder. I den præsenterede protokol beskriver vi en MC-WISH fremgangsmåden ved sammenligning mRNA ekspressionsmønstre for forskellige gener i Drosophila embryoner. Op til tre RNA-prober, der er specifikke for et andet gen og mærket med en anden hapten, samtidigt hybridiseret til embryo prøver og efterfølgende detekteres med alkaline phosphatase-kolorimetrisk immunhistokemi. Den beskrevne procedure er detaljeret her for Drosophila, men fungerer lige så godt med zebrafisk embryoner.
Introduction
In situ hybridisering (ISH) er den standard metode til påvisning og lokalisering af RNA-transkripter i en morfologisk sammenhæng inden celler, væv og organismer 1. Signalerne produceret af ISH proceduren er almindeligt visualiseres ved radioaktive, fluorescerende og chromogene detektionssystemer. I de seneste år betydelige teknologiske fremskridt inden for fluorescerende ISH (FISH) 2 resulterede i dramatisk forbedret følsomhed og opløsning, så påvisning og kvantificering af RNA-ekspression ved single-celle og sub-cellulære niveauer og RNA visualisering op til enkelte molekyler 3,4 .Mens sofistikerede enkelt-molekyle FISH metoder anvendes til mere specialiserede anvendelser, kromogent ISH er udbredt som en rutinemæssig RNA in situ påvisningsmetoden i forskning og klinisk diagnostik. Til kromogene detektion bruges enzym udfældningsreaktioner, som genererer synlige produkter i kontrastfarver på de stederaf hybridisering 5. Dette har den fordel, at RNA visualisering kan kombineres med rutinemæssige histologiske pletter og morfologiske sammenhæng er umiddelbart indlysende ved standard brightfield mikroskopi. Desuden mange af de anvendte farver substrater producerer udfældninger, som er stabile i organiske og / eller vandige montering medier, så permanente præparater prøve kan opnås 5.
I Drosophila, anvendes indledende ISH protokoller radioisotop-mærkede prober til påvisning transkript på sektioneret materiale 6. Selv om det er vanskeligt at rekonstruere fra vævssnit komplette transkriptmønstre af hele embryoner eller organsystemer, anvendelsen af chromogene ISH procedurer med ikke-radioaktivt mærkede prober gør det muligt at detektere RNA globalt distributioner i hel-mounts 7. Selvom mange variationer af kromogent ISH findes, i typisk hel-mount in situ hybridisering (WISH) protokoller hybridized hapten-mærkede prober detekteres af antihaptenantistoffer konjugeret til et reporter-enzym og mRNA-transkripter er synlige ved en udfældende chromogen.
Paletten af forskelligt farvede bundfald fremstillet ved reporterenzymer alkalisk phosphatase (AP), peberrodsperoxidase (POD) og beta-galactosidase (GAL) giver mulighed for påvisning af karakteristiske flere mål i en og samme prøve 8-14. Men POD enzymatisk aktivitet varer kun i en begrænset tidsperiode og GAL kolorimetriske reaktion er noget mindre følsom, så uden yderligere (tyramid) signalforstærkning 15 påvisning af mindre rigelige transkripter kan være en udfordring med disse enzymer. I modsætning hertil vedvarende aktivitet af AP muliggør langvarig substrat omsætning og højt signal-støjforhold. Derfor har sekventiel påvisning ved AP reporter enzym med forskelligt farvede substrater vist sig gode til en effektiv ogkarakteristisk påvisning af op til tre forskellige udskrifter i enkelte embryoner 10-12,16.
Til dette multi-target kromogent WISH (MC-WISH) metoden (figur 1) 14, er mærket antisense RNA-prober genereret ved in vitro transkription og mærket med et af de tilgængelige hapten-etiketter. Embryoner er formaldehyd faste og permeabiliseret med methanol behandling og proteinase K-fordøjelse. Hybridisering af embryoer samtidig udføres med op til tre forskelligt mærkede antisense RNA-prober specifikke for hver et andet gen. Efter fjernelse af ubundet probe ved stringens vask hver hapten-label visualiseres i en separat runde af detektion. En enkelt detektering runde består af inkubation af fostre med en antihaptenantistof koblet til AP og RNA visualisering ved anvendelse af en AP-substrat, som frembringer en lokal stabil farve bundfald. Efter antistofdetektering og farvning, den anvendte antistof-AP conjugate fjernes ved en lav pH vask. I flerfarvet eksperimenter, hver runde af detektering anvender et antistof rettet mod et andet hapten-etiket, og hver transkriptmønster visualiseres ved en anden farve substrat (tabel 1). Embryoner er monteret i glycerol og afbildes under en høj opløsning sammensat mikroskop ved anvendelse af differentiel interferens kontrast (DIC) optik.
Protocol
1. Mærkning af RNA-prober ved in vitro-transkription
- Saml in vitro transcription reaktionen i et 1,5 ml mikrorør under RNase-fri betingelser: 10,5 pi DEPC-behandlet H2O, 4,0 pi 5x transcription buffer, 1,0 pi (1 ug) lineariseret, renset template-DNA i DEPC-behandlet H2O, 1.3 pi NTP mix, 0.7 pi hapten-mærket UTP, 0,5 pi RiboLock RNA inhibitor, 2,0 pi RNA-polymerase.
Bemærk: Det endelige reaktion volumen er 20 pi. - Afhængigt af skabelonens promotorsekvens anvendelse T7, T3 eller SP6 RNA-polymerase til in vitro transkription (se reference 17).
- Vælg digoxigenin-11-UTP, biotin-16-UTP, eller fluorescein-12-UTP, som etiketten for RNA-probe. For flere detaljer, se diskussion af hapten-etiketter og probe koncentrationer i diskussionen.
- Bland transkriptionsreaktion og spin ned inden længe.
- Lad transskriberei 3 timer ved 37 ° C.
- Tilsæt 1 pi RNase-fri DNase I til transkriptionsreaktion til fjernelse af template-DNA, bland godt, og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C.
- Juster med DEPC-behandlet H2O prøvevolumenen til 200 pi.
- Tilsættes 100 pi (0,5 vol) 7,5 M ammoniumacetat og 600 pi (3 vol) ethanol til udfældning mærket RNA-probe. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Brug ikke iskold ethanol, da dette kan føre til uønsket udfældning af personlige nukleotider.
- Spin ned det transkriberede RNA i et temperaturstyret centrifuge ved maksimal hastighed (20.800 x g) i 30 minutter ved 20 ° C. Aspirere forsigtigt supernatanten.
- Vask den resulterende pellet med 70% ethanol ved stuetemperatur og centrifugeres ved 20.800 xg i 10 minutter ved 20 ° C.
- Fjern supernatanten og være omhyggelig med ikke at uheld aspirere den løse pille. Lad pellet lufttørre i mikrorør med åbnet låg til et par minutter ved stuetemperatur.
- Disløse den opnåede pellet i 100 pi DEPC-behandlet H 2 O.
- Der tilsættes 300 pi præ-hybridiseringspuffer (50% vol / vol deioniseret formamid, 5 x SSC, 50 ug / ml heparin-natriumsalt, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA) og opbevares ved -20 ° C . Prober kan være langsigtet opbevaret ved -20 ° C.
Bemærk: Ved en første test af den nyligt transkriberede probe fortyndet 3 pi hapten-mærket RNA-probe i 100 pi hybridiseringspuffer at opnå den endelige koncentration til WISH eksperimentet.
2. Behandling af Embryo Prøver Brug Indsætter
Bemærk: Brug af mikrorør eller flere brønde til bearbejdning embryoner gennem de forskellige inkubationstrin bærer risikoen for at miste betydelige mængder af embryoner ved et uheld opsugning dem under udveksling af løsninger. For at undgå dette tab, kan det være nyttigt at anvende kurve (såsom netwell indsætter) til udførelse embryo prøver gennem proceduren. Disse er polystyren iindsætninger med en polyester mesh forneden (figur 2A), som embryonerne hvile under behandlingen.
- Til bearbejdning embryoer i WISH procedure, samle indsatserne i en 12-brønds plade (figur 2B), og der tilsættes 2 ml af den passende løsning til hver brønd.
- Pipettere embryonerne i indsatserne ved hjælp af en blå spids. Sørg for, at alle embryoner er nedsænket i væske.
- Når inkubationstiden er over sted embryonet-holdige inserter i en anden 12-brønds plade, som er fyldt med opløsningen til det næste trin.
- Brug bærere og håndtag (figur 2C) til at overføre op til 12 prøver ad gangen fra én løsning til en anden (figur 2D).
Bemærk: For at reducere de nødvendige mængder, bruge 2,0 ml mikrorør for præ-hybridisering / hybridisering trin (se trin 4.1) og 24-brønds plader til farvning reaktioner (trin 6.2). Hybridiserings- og farvning Reaktionerne udføres i volumener på 1001 l og 400 pi, henholdsvis.
- Brug bærere og håndtag (figur 2C) til at overføre op til 12 prøver ad gangen fra én løsning til en anden (figur 2D).
3. Fremstilling af embryoer til hybridisering
- Indsamle, dechorionate, fix, og devitellinize embryoner under anvendelse af standardprocedurer 14,18. De fremstillede embryoner rutinemæssigt opbevares i methanol ved -20 ° C.
- Overfør embryoner, der skal anvendes til in situ-hybridisering til stuetemperatur og fordeles i indsatserne i en plade med 12 brønde fyldes med 2 ml methanol per brønd.
- Rehydrere embryoner gennem en faldende methanol serie ved stuetemperatur. Inkuber embryoner hver gang i 3 minutter i: (i) 75% methanol i 1 x PBS (ii) 50% methanol i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% methanol i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% Tween-20.
- Pre-fix embryonerne i 4% paraformaldehyd i 1 x PBS i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern fiksativ af 4 gange i 3 minutter i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved stuetemperatur. I mellemtiden tø og forberede proteinase K og glycin arbejdsopløsninger.
- Reaktionen standses ved to 1 min skylninger i 2 mg / ml glycin i 1X PBS, 0,1% Tween-20 ved stuetemperatur.
- Post-fix embryonerne i 4% paraformaldehyd i 1 x PBS i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Efterfølgende fjernes paraformaldehyd fiksativ ved vask fire gange i 3 minutter i 1X PBS, 0,1% Tween-20 ved stuetemperatur.
- Overfør postfikseret embryoner til at pre-hybridiseringsbuffer. Store embryoner i præ-hybridiseringspuffer ved -20 ° C eller direkte videre med hybridisering af prober.
4. Hybridisering af prober
- Overfør embryoner opbevaret ved -20 ° C i præ-hybridiseringspuffer til stuetemperatur. Fordel embryoner i præ-hybridiseringsbuffer i 2,0 ml microtubes.
- I 30 minutter ved et minimum, pre-hybridisere embryo prøver ved 65 ° C i præ-hybridiseringspuffer.
Bemærk: Ved præ-hybridisering og hybridisering trin et vandbad bruges. Under præ-hybridisering der er tid til at forberede sonden mix ved at kombinere op til tre antisense RNA-prober, der er specifikke for et andet gen-transkript og mærket med en anden hapten. - For at opnå den probe mix tilsættes sammen passende mængder (normalt mellem 1 pi til 6 pi) for hver ønsket oprindelige hapten-mærket antisense RNA-probe i 100 pi hybridiseringspuffer (50% vol / vol deioniseret formamid, 5 x SSC, 50 ug / ml heparin-natriumsalt, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA, 5% vægt / vol dextransulfat).
Bemærk: Tilsætning af dextransulfat er valgfri. - Denaturere antisense-RNA-probe mix i en varmeblok ved 80 ° C i 5 minutter. Efterfølgende overføre denatureret probe mix direkte til 65 ° C.
- Fjerne det meste af præ-hybridiseringbuffer fra embryo prøver og tilsæt denatureret probe mix.
- Lad embryo prøver hybridiserer til probe mix O / N ved 65 ° C.
Note: temperaturer i området mellem 55 ° C og 65 ° C rutinemæssigt anvendt til hybridisering, præ-og post-hybridiseringsbetingelser trin. Hybridisering ved 65 ° C giver de strengeste betingelser og anbefales i tilfælde af baggrunden problemer, når du bruger lavere temperaturer. Hvis der ikke er nogen problemer baggrund, hybridisering ved 55 ° C anbefales, hvilket giver fordelen af forøget signalstyrke og forbedret embryo integritet. - Næste morgen, først overføre stringens vaskeopløsninger til 65 ° C, for at sikre, at de er opvarmet til den rette temperatur i tid.
- Transfer hybridiseringsprobe mix med embryoner fra 2,0 ml mikrorør i inserter af en 12-brønds plade indeholdende 2 ml foropvarmet hybridiserings- vaskebuffer (50% formamid i 2 x SSC, 0,1% Tween-20). Placer plade med 12 brønde indeholdende embryo prøver i en ovn og inkuberes i 20 minutter ved 65 ° C.
- Ægoplægningen prøver til 2 ml nye hybridisering vaskebuffer og inkuberes i 20 minutter ved 65 ° C. Gentag dette trin en gang mere.
- Fjern overskydende probe ved 20 minutters vaske ved 65 ° C, en gang i 2 x SSC, 0,1% Tween-20 og tre gange i 0,2 x SSC, 0,1% Tween-20.
- Overfør embryo prøver til 1x PBS, 0,1% Tween-20 ved stuetemperatur.
- Inkubér embryonerne i blokerende buffer (8% fåreserum i 1 x PBS, 0,1% Tween-20) i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
5. Antistof Påvisning af hapten-mærkede prober
Bemærk: I modsætning til den samtidige hybridisering af alle tre forskelligt mærkede prober, der hver probe påvises ene efter den anden i separate runder af antistof inkubering og farvning. Derfor i hver runde detektering kun én antistof anvendes (enten anti-digoxigenin-AP eller anti-fluorescein-AP eller anti-biotin-AP).
- Vælg mellem STEP5.1.1 til 5.1.3 og fortsætte med at forberede passende antistof fortynding ifølge hapten-label, der skal detekteres.
Bemærk: Til sekventiel påvisning af de forskelligt mærkede prober, er et andet anti-hapten-antistof anvendes i hvert detektionscyklus.- Til påvisning af en fluoresceinmærket probe fortyndet anti-fluorescein-AP konjugat 1: 4000 i blokerende buffer.
- Til påvisning af et digoxigenin-mærket probe fortyndet anti-digoxigenin-AP konjugat 1: 4000 i blokerende buffer.
- Til påvisning af et biotin-mærket probe udarbejde en anti-biotin-konjugat AP opløsning ved en 1: 4000 fortynding i blokeringspuffer.
- Inkubér embryoner i den valgte anti-hapten-AP-opløsning i 3 til 4 timer ved stuetemperatur. Alternativt inkuberes O / N ved 4 ° C. Må ikke anvendes alle tre antistoffer samtidigt.
- For at fjerne ubundet antistof vaskes embryonerne med 1x PBS, 0,1% Tween-20 for 4 gange 15 minutter ved stuetemperatur.
- For at ændre buffersystemer varh to gange 15 minutter ved stuetemperatur i TNT (0,1 M Tris-HCI pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20).
6. alkalisk phosphatase kromogent Farvning
- Efter antistofdetektering vælge mellem TRIN 6.1.1 til 6.1.4, og fortsæt med én af alkalisk phosphatase chromogene farvning reaktioner for at opnå den ønskede farve signal (se tabel 1). For hver runde af påvisning et andet chromogent substrat reaktionen anvendes til at fremhæve hvert transkript mønster i en anden farve.
- Fast rødfarvning
- Vask embryonerne to gange i 15 minutter i TT8.2 (0,1 M Tris-HCI pH 8,2, 0,1% Tween-20).
- Mens vaske embryoner, forberede Fast Red farvning løsning fra Fast Red TR / NAMP Alkaline phosphatasesubstrat Tabletter Set.
- En buffer tablet fra tabletten sat i 1 ml destilleret vand opløses og vortexes for at opnå 0,1 M Tris-HCI pH 8,2.
- Drop en Fast Red TR / NAMP tablet i den forberedte TRIS buffer og opløses ved hvirvelbehandling for at opnå den hurtige røde farvning løsning.
- Klart Fast Red farvningsopløsning fra ikke-opløste partikler gennem et 0,2 um sprøjtefilter.
- Fast Blue farvning
- Vask embryoner to gange i 15 minutter i frisk SB8.2 farvning buffer (0,1 M Tris-HCI pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- Mens vaske embryoner forberede Fast Blue farveopløsning fra 50 mg / ml Fast Blue BB (i DMF) og 50 mg / ml naphthol phosphat (i DMSO) stamopløsninger.
- Frisk udarbejde en Fast Blue BB opløsning ved 0,5 mg / ml i SB8.2.
- Frisk udarbejde en særskilt naphthol phosphatopløsning ved 0,5 mg / ml i SB8.2.
- Dråbevis tilsæt tilberedte naphthol-opløsning i Fast Blue BB opløsning under konstant blanding med en vortex. Den resulterende endelige arbejdskoncentration er 0,25 mg / ml for begge substrat komponenter.
Bemærk: Forskellige Fast Blue / naphthol phosphad kombinationer resulterer i forskellige farvenuancer (se tabel 1).
- BCIP / NBT Farvning
- Vask embryoner to gange i 15 minutter i frisk SB9.5 farvning buffer (0,1 M Tris-HCI pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- For en purpleblue kromogent signal, frisk forberede BCIP / NBT-farvning ved tilsætning af 1 pi levamisol, 3,5 pi BCIP og NBT 4,5 pi per ml SB9.5 farvning buffer og bland godt.
- INT Farvning
- Vask embryoner to gange i 15 min i frisk SB9.5 farvning buffer.
- For en yellowbrown kromogent signal, forberede frisk INT farveopløsning ved tilsætning af 1 pi levamisol, 5 pi Magenta-Phos og 5 pi INT pr ml SB9.5 farvning buffer og bland godt.
Bemærk: Alternativt kan 7,5 ul / ml BCIP / INT klar til brug farveopløsning.
- Fast rødfarvning
- Til farvning reaktion ægoplægning prøver detil en 24-brønds plade. Inkuber hver prøve i 400 pi den valgte farveopløsning i mørke.
- Overvåg lejlighedsvis signalere udvikling under et stereomikroskop. Farvningen af neglene, når den ønskede signalstyrke er opnået, og før der observeres en betydelig baggrundssignal.
- For at stoppe det chromogene reaktion, overføre farvede embryoner i inserter af en 12-brønds plade indeholdende 2 ml TNT per brønd. Skyl de farvede embryoner to gange i TNT.
- Vask embryonerne to gange i 10 minutter i 1 × PBS, 0,1% Tween-20 ved stuetemperatur fjerne resterende substrat.
7. Antistof Fjernelse / alkalisk phosphatase Inaktivering
- Fjern antistof og inaktivere alkalisk phosphatase ved inkubering i 2 ml lav pH stopopløsning (0,1 M glycin-HCI pH 2,2, 0,1% Tween-20) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl i 1 min med 2 ml 1 × PBS, 0,1% Tween-20 ved stuetemperatur.
- Vask 3 gange i 3 minutter i 1 × PBS, 0,1% Tween-20 ved stuetemperatur.
8. Anden Detection Round
- For at detektere fordelingen mønster af en anden transkript Fortsæt med antistof påvisning af hapten-mærkede prober (trin 5,1-5,4) ved hjælp af antistof-konjugater AP målrettet mod den anden hapten-label.
- Udfør alkalisk phosphatase kromogent farvning (STEP 6.1 til 6.5) påføring af et substrat kombination, der producerer en kontrastfarve til den, der anvendes i den første runde detektion (for tilgængelige farver se tabel 1).
- Fjern andet antistof-konjugat AP som beskrevet i trin fra 7,1 til 7,3.
9. Tredje Detection Round
- For at detektere fordelingen mønster af en tredje transkript Fortsæt med antistof påvisning af hapten-mærkede prober (trin 5.1 til 5.4) under anvendelse af antistof-konjugater AP specifik for den tredje hapten-label,.
- Udfør alkalisk phosphatase kromogent farvning (STEP 6,1-6,5) påføring af et substrat kombination, der ikke var aptvistet i de tidligere afsløring runder. Vælg en chromogen reaktion, der frembringer en farve udfældes let at skelne fra de de to foregående afsløring runder (for farvevalg se tabel 1).
10. Montering og Imaging
- Overfør korrekt farvede embryoner til 30% glycerol i PBS og inkuberes, indtil embryoner er fuldt gennemvædet i glycerolopløsning. De er godt ækvilibreret når de synker til bunds.
- Overfør embryoner til 70% glycerol i H2O og lad ligevægt ved RT. De farvede embryoner kan opbevares i 70% glycerol ved 4 ° C.
- Til montering, pipette farvede embryoner i en 70% glycerol dråbe på et objekt slide og uden at røre afstandsstykkerne limet til glas (figur 3). Anvend dækglasset.
- Vis monteret embryoner under et dissektionsmikroskop. Flyt anvendt dækglasset, således at embryonerne rotere til den ønskede orientering.
- Overhold korrektorienterede embryoner ved høj opløsning (20X, 40X mål) under en forbindelse mikroskop med Differential Interference Contrast optik.
- Tage billeder med et digitalt farvekamera og spar på digital lagringsenhed.
Representative Results
Den beskrevne protokol giver mulighed for samtidig visualisering af flere transkriptmønstre i forskellige farver. MC-WISH giver den fordel direkte at sammenligne de ekspressionsmønstre for forskellige gener i det samme embryo. Som et eksempel ekspressionsmønstre for tomme Spirakler (EMS) 19, fushi tarazu (FTZ) 20 og sjusket parret 1 (SLP1) 21 er direkte sammenlignet i Drosophila melanogaster blastodermstadiet embryoner og visualiseres i en række farvenuancer (figur 4) .
Forskellige AP substratkombinationer er tilgængelige for at opnå et panel af kontrasterende farve bundfald (tabel 1). Den røde farve bundfald produceret af Fast Red og den lilla bundfald produceret af BCIP / NBT let kan skelnes, og anvendes derfor mest almindeligely i tofarvede eksperimenter (figur 4A). Dog kan BCIP / NBT pletten hurtigt blive til en temmelig mørk farve, så Fast Rød farve er forklædt i tilfælde af delvis co-distribution af udskrifter. Derfor kan anvendelsen af Fast Blue være en fordel, som genererer blå, grøn og violet produkter i kombination med NAMP, NAGP og NABP (tabel 1). Kombinationen af Fast Blue med NAMP giver en lyseblå farve, der er let ses fra Fast Red produkt i tilstødende eller overlappende udtryk domæner som vist her for EMS og SLP1 ekspressionssteder visualiseret i rød og blå, henholdsvis (figur 4B). Den Fast Blue NAGP kombination giver en tilsvarende stærk kontrast til Fast røde plet, så den grønne EMS domæne er klart markant fra den røde SLP1 ekspression (figur 4C). Men hvis ems og SLP1 udtryk steder er debeskyttet af Fast Blue NABP og Fast Red, henholdsvis den resulterende violette og røde farve bundfald er mindre mærkbar (figur 4D). Som nævnt ovenfor, Fast Red og Fast Blue NAGP er lette at skelne som vist ved SLP1 og FTZ ekspression i rød og grøn, (figur 4D).
MagentaPhos i kombination med INT producerer et gult bundfald, som bruges til at afsløre segmental ekspression af FTZ (figur 4C, E). Det gule bundfald genererer god kontrast til de blåfarvede substrater som eksemplificeret ved påvisning af SLP1 og FTZ med Fast Blue NAMP og MAG / INT, (figur 4E). Men det gule bundfald er vanskeligere skelnes fra Fast Red produkt. Den gule farves udtryk domæne af EMS kan næppe forne nguished fra rostral udtryk for SLP1 vist i rødt (Figur 4F). Derfor er kombinationen af farve substrater skal vælges omhyggeligt for hvert forsøg.
Figur 1. Flowchart af MC-WISH. For flerfarvede visualisering af tre unikke transkriptmønstre, vælge mellem forskellige antistof-AP konjugater og farve substratkombinationer i hvert afsløring cyklus. Forkortelser: AP, alkalisk fosfatase; BIO, biotin; DIG, digoxigenin; FLUO, fluorescein. For andre forkortelser se legender til figur 4 og tabel 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
s / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg "/>
Figur 2. Indsætter som embryo luftfartsselskaber. (A) Indsætter monteret i bunden med polyester membraner af 15 mm i diameter og 74 um maskestørrelse anvendes som Drosophila embryo luftfartsselskaber. (B) Indsatserne er samlet i 12-brønds plader, der fungerer som reservoir bakker for de forskellige løsninger. (C) Ledige luftfartsselskaber og håndtag tillade behandling af (D) 12 indsatser / embryo prøver samtidigt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Montering af farvede embryoner. Embryoner er monteret i en dråbe 70% glycerol mellem to stakke af dækglas, der fungerer som afstandsstykker. Blid bevægelse af appløj stort dækglas med til at rotere de monterede embryoner i den ønskede orientering til observation og fotografering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Flerfarvet visualisering af mRNA-transkripter i Drosophila embryoner. Eksempler på MC-Wish eksperimenter i Drosophila embryoner vises fra laterale synspunkter. MRNA ekspressionsmønstre for tomme Spirakler (EMS), fushi tarazu (FTZ) og sjusket parret 1 (SLP1) visualiseres af forskellige AP farve substratkombinationer, der er angivet på hvert panel. Transkripter blev påvist ved (A) FTZ FLUO og EMS DIG, (
| Substratkombinationen | Tilføj til 1 ml AP-buffer | Concentration [ug / ml] | AP buffer | Farve | Signal følsomhed |
| BCIP NBT | 3,5 pi 4,5 pi | 175 337,5 | SB9.5 | lilla | +++ |
| MAG INT | 5 pi 5 pi | 250 250 | SB9.5 | gul | + |
| BCIP / INT stamopløsning | 7,5 pi | 250 250 | SB9.5 | gul | + |
| Fast Blue NAMP | 5 pi 5 pi | 250 250 | SB8.2 | blå | ++ |
| Fast Blue NABP | 20 pi 10 pi | 1.000 500 | SB8.2 | violet | ++ |
| Fast Blue NAGP | 10 pi 10 pi | 500 500 | TT8.2 | grøn | + |
| Fast Red NAMP | 1 tablet | 1.000 400 | TT8.2 | rød | ++ |
Tabel 1. substratkombinationer Forkortelser: +++, stærk;. ++, Medium; +, Svagt NBT, 4-nitro-blå-tetrazoliumchlorid; BCIP, 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat; INT, 2- (4-iodphenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-tetrazoliumchlorid; MAG, Magenta-Phos, 5-brom-6-chlor-3-indolyl-phosphat, NAMP, naphthol-AS-MX-phosphat; NABP, Naphthol-AS-BI-fosfat; NAGP, naphthol-AS-GR-phosphat; SB9.5, farvning puffer ved pH 9,5; SB8.2, farvning puffer ved pH 8,2; TT8.2, Tris-Tween-puffer ved pH 8,2.
Discussion
In situ-hybridisering (ISH) med radioaktivt mærkede nukleinsyreprober anvendes ofte til at detektere lokalisering af RNA på vævssnit. Det radioaktive ISH-metoden er dog tidskrævende, mindre følsomme, og tillader ikke opskrivning af komplette udskrift fordeling mønstre i hel-mounts. I modsætning hertil er beskrevet heri MC-WISH fremgangsmåde tillader direkte sammenligning af flere genekspression domæner i kontrastfarver inden intakte embryoer. MC-WISH har den fordel, histologiske sammenhæng er umiddelbart indlysende og visualiseret ved blot standard brightfield mikroskopi. Dette giver mulighed for at relatere genekspression domæner topografisk til hinanden med stor nøjagtighed og definere unikke og overlappende ekspressionssteder på en hurtig og pålidelig måde. På den anden side, multiplekset fluorescerende ISH (FISH) er mere kraftfuld med hensyn til følsomhed og opløsning, og anvendes fortrinsvis, hvis cellulære eller endda sub-cellulære reopløsning af mRNA detektion er påkrævet.
Det brede spektrum af transkripter, der er blevet kortlagt af MC-WISH tyder på, at stort set alle transkript kan analyseres ikke blot i embryonale, men også i larver og voksne væv og i andre end Drosophila arter. Faktisk den beskrevne fremgangsmåde detaljeret her for Drosophila, fungerer på samme måde effektiv med zebrafisk embryoner 11,16,22. Desuden kan MC-WISH fremgangsmåde tilpasses til en bred vifte af hvirvelløse og hvirveldyr embryoner og vævsprøve.
Hapten-etiketter og probekoncentrationer
Vi bruger rutinemæssigt fluorescein, digoxigenin, biotin og som haptenmarkører af RNA-prober. Desuden dinitrophenol-mærkede prober kan anvendes, som er blevet indført i zebrafisk WISH eksperimenter 23-25. Fluorescein-mærkede prober vise en mindre følsomhed i sammenligning med de andre hapten-etiketter, således at fluorescein er bedst brugt feller detektion af rigelige transkripter. Hver nyligt transskriberede probe først testet i et enkelt WISH eksperiment, hvor indtjeningen vurderes enten ved hjælp af BCIP / NBT eller Fast Red som substrat. En probekoncentration betragtes som optimal, når et stærkt signal uden udvikling baggrund opnås inden min til nogle få timer.
For at sikre at udtrykket domæner af interesse er blevet påvist i deres fulde omfang af MC-WISH, er det vigtigt at visualisere hver udskrift mønster ved en enkelt-label WISH eksperimenter ved hjælp af den mest følsomme underlag kombination, BCIP / NBT. Dette sikrer, at svage udtryk domæner ikke er overset i den multi-target eksperiment. For at kompensere for den mindre følsomhed af de andre substratkombinationer er det vigtigt at bruge fordoblet (til tredoblet) probekoncentrationer sammenlignet med standard BCIP / NBT-farvning.
Lav pH inaktivering
Den lave pH inaktiveringstrin kan føre tildelvis opløsning af antisense hapten-mærket RNA-probe / sense mRNA hybrider resulterer i reduceret detekteringssignal i det andet og tredje farvning runder. For at minimere tab af følsomhed, inaktivering trin er så korte som muligt. Vi oplevede, at en 10 minutters inkubation ved lav pH er tilstrækkelig til fjernelse af AP-aktivitet. De efterfølgende hurtige vaske i store mængder sikre hurtig fortynding af ubundet antistof-konjugater AP og forhindre re-binding til de haptenized prober. Alternative procedurer omfatter paraformaldehydfiksering og varmeinaktivering. Imidlertid er nogle af de farvede bundfald ikke varme stabil og paraformaldehydfiksering måske ikke tilstrækkelig til fuldstændig inaktivering af AP. Ufuldstændig inaktivering af den første påførte antistof-konjugat AP kan føre til fornyet visualisering af mRNA mønster i følgende detektion runde fører til falsk positive overlap i udtryk med den anden mRNA-art, der skal påvises. Derfor, i et kontrolforsøg the embryoner er opdelt i to fraktioner efter inaktivering af den første påførte antistof-AP-konjugat. Det andet antistof-AP-konjugat er udeladt fra fraktion kontrol og bør ikke frembringe et signal i den anden farvereaktion. Men hvis den anden farvereaktion genererer et signal fordelingsmønster svarende til den første, og derefter inaktiveringsproceduren ikke var effektiv. I dette tilfælde bør inkubationstiden i lav pH stopopløsning forlænges for det næste forsøg.
Ordrer af AP-substrat ansøgning
Da følsomheden falder med hver efterfølgende runde af afsløring, er det tilrådeligt at opdage mindre rigelige mRNA'er før mere rigelige udskrifter. Hertil kommer, at Fast Red og Fast Blue substratkombinationer er betydeligt mindre følsom end purpleblue BCIP / NBT plet, så Fast farvestoffer fortrinsvis anvendes i den første runde farvning til påvisning af stærkere udtrykt transkript. Dette også hden fordel, at en efterfølgende BCIP / NBT-farvning kan overvåges og stoppet i god tid inden purpleblue signalet bliver for mørkt i forhold til de lysere Hurtig farvestoffer. Således i en standard tofarvet eksperiment først stærkere udtrykt mRNA påvises ved Fast Red og for det andet svagere én efter BCIP / NBT. Som et alternativ til de hurtige farvestoffer de gule INT substratkombinationer kan anvendes, som dog producerer bundfald, der bliver diffundere efter nogen tid. Derfor BCIP / INT kan udelukkende anvendes i den sidste farvning rundt. Derfor i en tre-farve eksperiment bruger vi ofte først Fast Red, andet BCIP / NBT (eller Fast Blue) og tredje en INT substrat kombination. Bemærk, at det er tilrådeligt at fotografere farvede embryoner så hurtigt som muligt, når de anvender INT.
Fluorescerende detektion af azofarvestoffer
Det kan være nogle gange svært at genkende overlappende ekspressionsmønstre når en mørkere farve bundfald skygger en lighter en. Feller eksempel kan en kraftigt udviklet BCIP / NBT bundfald maske lysere Hurtig farvestof signaler. En måde at komme omkring dette problem er at tage billeder umiddelbart efter hver farvning og fjern den anvendte farve bundfald inden næste afsløring runde. I dette tilfælde er alkohol-opløselige azo farvestof (Fast Red) og INT bundfald fjernet ved ethanol vasker efter den første og anden afsløring runder henholdsvis og BCIP / NBT-farvning anvendes som den sidste AP-substrat 26. En anden mulighed er at drage fordel af de fluorescerende egenskaber af azofarvestoffer. Fast Red kan visualiseres ved hjælp rhodaminfilteret sætter 27, mens Fast Blue kan iagttages med langt røde filtre 28,29. Sammenligning eller overlejring af kromogene og fluorescerende billeder kan afsløre stedet for co-distribution.Using denne fremgangsmåde, BCIP / NBT signal udvikling skal stoppes i tide, således at det ikke bliver for tæt og slukke det fluorescerende signal af azofarvestof reaktionsprodukt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T.
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
