Summary
Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.
Abstract
Embriyonik gelişim ve hassas farklı genlerin yerinde birbirlerine mekansal ilişki ifade edilir nasıl tanımlamak için esastır organogenezis sırasında aktif gen düzenleyici ağları analiz etmek. Çoklu hedef kromojenik tüm montaj situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) aynı numune numune renkleri zıt farklı mRNA türlerinin ayırt edici görselleştirme izin verdiği ölçüde, gen ekspresyonu anında karşılaştırılmasını kolaylaştırır içinde. Bu olasılık yüksek hassasiyetle birbirine topografik gen ifadesi etki ilişkilendirmek ve benzersiz ve örtüşen ifade siteleri tanımlamak sağlar. Sunulan protokol, Drosophila embriyolar farklı genin mRNA ekspresyonu karşılaştırılması için bir MC-DİLERİZ prosedürü açıklar. Üç RNA probları, her bir gen için spesifik ve farklı bir hapten etiketli kadar, embriyo örnekleri aynı zamanda hibritlenmiş ve daha sonra alkali ile algılanırne kolorimetrik immunhistokimya fosfataz tabanlı. Açıklanan prosedür burada Drosophila için ayrıntılı ama Zebra balığı embriyolarının ile eşit derecede iyi çalışıyor.
Introduction
Situ hibridizasyon (ISH) hücreler, dokular ve organizma 1 içinde morfolojik bağlamda tespiti ve RNA transkript lokalizasyonu, standart bir yöntemdir. ISH prosedürü ile üretilen sinyaller genellikle radyoaktif floresan ve kromojenik algılama sistemleri tarafından görüntülenmiştir. Son yıllarda floresan ISH önemli teknolojik gelişmeler (FISH) 2 tek moleküllerin 3,4 görüntü albüm kadar tek hücre ve alt hücre düzeyine ve RNA görselleştirme de algılama ve RNA ifade kantitatif izin önemli ölçüde geliştirilmiş hassasiyet ve çözünürlük sonuçlandı Sofistike tek-molekül FISH yöntemleri daha özelleşmiş uygulamalar için kullanılır, kromojenik ISH araştırma ve klinik teşhis yerinde tespit yönteminde rutin RNA gibi yaygındır. Kromojenik olarak saptanması için, enzim çökeltme reaksiyonları sitelerinde zıt renklerin görünür ürünler üretmek kullanılır, ve bunlarmelezleme 5. Bu RNA görselleştirme rutin histolojik lekeleri ve morfolojik bağlamda ile kombine edilebilir avantaj standart aydınlık mikroskobu ile hemen belirgindir vardır. Ayrıca, uygulanan renk alt-tabakaların çok sayıda kalıcı numune preparatlar 5 elde edilebilir, böylece bir organik ve / veya sulu bir ortam içinde, montaj kararlı olan çökelti, üretir.
Drosophila, ilk ISH protokolleri kesitli malzeme 6 transkript tespiti için radyoizotop işaretli problar uyguladı. Bu doku kesitlerinde, tüm embriyolar veya organ sistemlerinin tam transkript kalıpları yeniden zor olsa da, sigara radyoaktif olarak etiketlenmiş problar ile kromojenik ISH prosedürlerinin uygulanması sayesinde tam bağlar 7 RNA dağılımlarını tespit global olarak kolaylaştırır. Kromojenik ISH birçok varyasyonu bulunmasına rağmen, tipik olarak in situ hibridizasyon (DİLERİZ) protokollerini hyb bütün montajridized hapten-etiketli problar anti-hapten antikor bir raportör enzime konjüge edilmiş ve mRNA transkriptlerinin bir çökeltici kromojen tarafından görüntülenmiştir ile tespit edilir.
Raportör tarafından üretilen farklı renkli çökelti paleti alkalin fosfataz (AP), yaban turpu peroksidazı (POD) ve beta-galaktosidaz (GAL) birinde birden fazla hedefin ayırt edici tespiti ve aynı örnek 8-14 sağlar enzimleri. Ancak, POD enzim aktivitesi sadece sınırlı bir süre sürer ve ek (tiramid) sinyal amplifikasyon 15 daha az bol transkript tespiti, bu enzimler ile zor olabilir olmadan, böylece GAL kolorimetrik reaksiyon, biraz daha az duyarlıdır. Bunun aksine, AP aktivitesi kalıcı, uzun ömürlü alt-tabaka dönme ve yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar. Bu nedenle, farklı renkli yüzeylerde AP muhabiri enzimi kullanılarak sıralı algılama etkili başarılı olduğu kanıtlanmıştır veTek embriyoların 10-12,16 kadar üç farklı transkript ayırt edici algılama.
Bu çoklu hedef kromojenik VVISH (MC-DİLERİZ) metodu (Şekil 1) 14, işaretlenmiş antisens RNA probları in vitro transkripsiyonu ile üretildi ve uygun hapten-etiket biri ile işaretlenir. Embriyolar formaldehid sabit ve metanol tedavisi ve proteinaz K sindirimi ile geçirgenleştirildi bulunmaktadır. Embriyoların Hibridizasyon aynı anda üç farklı etiketli antisens RNA probları farklı bir genden her özel ile gerçekleştirilir. Titizlikte yıkama yapılmıştır bir bağlanmamış sondanın ayrılmasından sonra, her hapten-etiket, tarayıcı ayrı tur görüntülenmiştir. Tek bir belirleme turu lokalize sabit renk çökelti üreten bir AP-alt-tabakanın uygulanmasıyla AP ve RNA görselleştirme bağlanmış bir anti-hapten antikoruyla embriyoların inkübasyondan oluşur. Antikor tespiti ve boyanması, uygulanan antikor-AP konjugat sonraKapı, bir düşük pH yıkama ile çıkarılır. Renkli deneylerde, algılama her turda farklı hapten-etiketine karşı hedeflenen bir antikoru kullanan ve her transkript desen farklı bir renk alt-tabaka (Tablo 1) ile görüntülenir. Embriyolar gliserol monte ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) optikler kullanılarak yüksek çözünürlüklü bileşik mikroskop altında görüntülenmiş.
Protocol
In vitro transkripsiyon RNA probların 1. Etiketleme
- RNaz içermeyen koşullar altında 1.5 ml'lik bir mikrotüp in vitro transkripsiyon reaksiyonu birleştirin: 10,5 ul DEPC ile muamele edilmiş, H 2, O, 4,0 ul 5x transkripsiyon tamponu, 1.0 ul DEPC işlenmiş, H2O içinde (1 ug) linearize saflaştırılmış kalıp DNA, 1,3 ul NTP karışımı, 0.7 ul hapten ile etiketlenmiş UTP, 0.5 ul RiboLock RNA inhibitörü, 2,0 ul RNA polimeraz.
Not: Nihai reaksiyon hacmi 20 ul olduğunu. - Şablonun promotör sekansı kullanımı T7 bağlı olarak, in vitro transkripsiyon için T3 veya SP6 RNA polimeraz (17 referans bakınız).
- RNA probu için etiket olarak digoxigenin-11-UTP biyotin-16-UTP veya floresan 12-UTP seçin. Daha fazla ayrıntı için, Tartışma Hapten-etiket ve prob konsantrasyonları tartışma bakın.
- Transkripsiyon reaksiyonu karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün.
- Uyarlamak edelim37 ° C de 3 saat karıştırıldı.
- Şablon DNA uzaklaştırılması için transkripsiyon reaksiyonu 1 ul Rnaz içermeyen Dnaz I ekleyin, iyice karıştırılmakta ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
- DEPC arıtılmış H2O 200 ul örnek hacmi ile ayarlayın.
- Etiketli RNA prob çökeltilmesi için 100 ul (0.5 hacim) 7.5 M amonyum asetat ve 600 ul (3 hacim) etanol ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- Bu adi nükleotidlerin istenmeyen yağış neden olabilir, buz gibi soğuk etanol kullanmayın.
- 20 ° C'de 30 dakika maksimum hızda (20,800 xg) bir sıcaklığı kontrol edilen santrifüj transkribe RNA dönerler. Dikkatle süpernatant aspire.
- 20 ° C'de 10 dakika boyunca 20.800 x g'de 70%, oda sıcaklığında etanol ve santrifüj ile elde edilen pelet yıkayın.
- Süpernatantı ve yanlışlıkla gevşek pelet aspire için dikkatli olun. RT'de bir kaç dakika için açılan kapaklı mikrotüp pelet hava kurumasını bekleyin.
- DisDEPC ile muamele edilmiş H2O 100 ul 'de elde edilen pelet çözme
- -20 ° C'de 300 ul ön hibridizasyon tamponu ekleyin (% 50 hacim / hacim deiyonize formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin sodyum tuzu,% 0.1 hac / hac Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA) ve mağaza . Problar -20 ° C'de saklandı uzun süreli olabilir.
Not: 100 ul hibridizasyon tamponu içinde yeni transkribe prob seyreltik 3 ul hapten-işaretli RNA probu bir birinci test için DİLERİZ deney için nihai konsantrasyon elde edildi.
Uçlar kullanılması Embriyo Örneklerinin 2. işlenmesi
Not: farklı inkübasyon adımları embriyolar işlenmesi için mikrotüpler veya çok oyuklu plakaları kullanılarak yanlışlıkla çözeltilerin değişimi sırasında onları aspire embriyoların önemli miktarlarda kaybetme riskini taşımaktadır. Bu kaybı önlemek için, prosedür yoluyla embriyo örnekleri taşıyan (örneğin Netwell ekler gibi) sepet kullanmak yararlı olabilir. Bu polistiren olanEmbriyolar işlem sırasında dinlenme hangi alt (Şekil 2A) bir polyester mesh ile SERT.
- DİLERİZ prosedürü embriyolar işlem, bir 12 oyuklu plaka (Şekil 2B) uçlar bir araya getirmek ve her bir oyuğa, uygun 2 ml solüsyon ilave edin.
- Mavi ucunu kullanarak ekler içine embriyolar pipetle. Tüm embriyolar sıvı batık emin olun.
- Kuluçka süresi yerde bir sonraki aşama için çözeltisi ile doldurulmuş bir başka 12-çukurlu plaka içinde embriyo ihtiva eden ekler olduğunda.
- (Şekil 2C) birbirinden (Şekil 2D), bir solüsyonuna bir kerede 12 numuneye kadar transfer taşıyıcıları ve tutamaçları kullanın.
Not: gerekli hacmini azaltmak boyama reaksiyonları (Basamak 6.2) ön-hibridizasyon / hibridizasyon adımları (Basamak 4.1) ve 24-kuyucuklu levhalar için 2,0 mi mikrotüpler kullanın. Melezleme ve boyama reaksiyonları 100 hacimlerinde yapılır1, l, sırasıyla 400 ul.
- (Şekil 2C) birbirinden (Şekil 2D), bir solüsyonuna bir kerede 12 numuneye kadar transfer taşıyıcıları ve tutamaçları kullanın.
Hibridizasyon için Embriyolar 3. hazırlanması
- , Dechorionate, toplayın düzeltmek ve standart prosedürler 14,18 ile embriyolar devitellinize. Hazırlanan embriyolar rutin -20 ° C'de metanol içinde depolanır.
- Embriyolar transfer oda sıcaklığına in situ melezleme için kullanılmaktadır ve oyuk başına 2 ml metanol ile dolu bir 12-yuvalı plakanın ekler halinde dağıtmak için.
- RT'de azalan metanol dizi embriyolar rehidrate. (I) 1 x PBS içinde 1 x PBS, (ii)% 50 metanol içinde% 75 metanol, Tween-20, (iii) 1 x PBS içinde% 25 metanol,% 0.1 Tween-20 (iv% 0.1: 3 dakika içinde için embriyolar her inkübe ) 1x PBS,% 0.1 Tween-20 (v) PBS 1x,% 0.1 Tween-20.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 x PBS'de% 4 paraformaldehid içinde embriyolar ön sabitleyin.
- Oda sıcaklığında 1 x PBS'de 3 dakika,% 0.1 Tween-20 için 4 kez yıkanmasından Fiksatif çıkarın. Bu arada Çözülme ve proteinaz K ve glisin çalışma çözümler hazırlar.
- % 0.1 Tween-20, oda sıcaklığında 2 mg / 1 x PBS içinde mi, glisin, iki 1 dakika durulama ederek reaksiyonu durdurun.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 x PBS'de% 4 paraformaldehid içinde embriyolar sonrası sabitleyin.
- Daha sonra, oda sıcaklığında 1 X PBS içinde 3 dakika,% 0.1 Tween-20 için yıkama dört kez paraformaldehit fiksatif çıkarın.
- Aktarım sonrası sabit embriyolar ön hibridizasyon tampon. Ön-hibritleme hibritleme tamponu içinde mağazası embriyolar -20 ° C'de ya da doğrudan amacı ile sondaların hibritleşmesi devam edin.
Sondalar 4. Melezleme
- Embriyolar transfer oda sıcaklığına ön hibridizasyon tamponu içinde -20 ° C'de saklandı. 2,0 ml microtub içine önceden hibridizasyon tamponu içinde embriyolar dağıtınes.
- En az 30 dakika için ön-hibritleme hibritleme tamponu içinde 65 ° C 'de embriyo örnekleri önceden hibridize.
Not: Ön melezleştirme ve melezleştirme için, bir su banyosu kullanılmıştır adımları tekrarlayın. Ön melezleme sırasında üç antisens RNA probları, her biri farklı bir gen transkriptinin için özel ve farklı bir haptenle işaretlenmiş kombine etmek üzere prob karışımı hazırlamak için zaman vardır. - Prob bir karışım elde etmek için, 100 ul hibridizasyon tamponu (% 50 hacim / hacim deiyonize formamid, 5x SSC, 50 ug / ml her biri istenen, özgün hapten-etiketli antisens RNA probu (genellikle 1 ul ul 6 arasındaki) ile birlikte uygun miktarlarda ilave heparin, sodyum tuzu,% 0.1 hac / hac Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA,% 5 ağırlık / hacim, dekstran sülfat).
Not: dekstran sülfat ilavesi tercihe bağlıdır. - 5 dakika boyunca 80 ° C'de bir ısı blokunda antisens RNA probu karışımı denatüre. Daha sonra 65 ° C'ye kadar, doğrudan denatüre prob karışımı aktarın.
- Ön-hibritleme en kaldırEmbriyo örneklerinden tampon ve denatüre prob karışımı ekleyin.
- Embriyo örnekleri 65 ° C 'de karışım O / N prob hibridize olsun.
Not: 55 ° C ve 65 ° C arasında değişen sıcaklıklar rutin melezleştirme öncesi ve sonrası hibridizasyon adımları için kullanılır. 65 ° C'de hibridizasyon, en sıkı koşullar sağlar ve daha düşük sıcaklıklar kullanılarak, arka plan sorunlar durumunda önerilir. Herhangi bir arka plan sorunları geliştirilmiş sinyal kuvveti ve iyileştirilmiş embriyo bütünlüğü avantajını sağlar, 55 ° C'de melezleştirme tavsiye edilir, varsa. - Sonraki sabah ilk emin zaman içinde doğru sıcaklığa ısıtılır olduğundan emin olmak için, 65 ° C'ye kadar bir sertlik yıkamayı çözüm aktarın.
- 2 ml önceden ısıtılmış hibridizasyon yıkama tamponu ihtiva eden bir 12-yuvalı plakanın uçlar halinde 2,0 ml mikrotüpler embriyolarında aktarma melezleştirme prob karışımı (2 x SSC içinde% 50 formamid,% 0.1 Tween-20). Onları içeren 12-plaka koyunbir fırın içinde bryo örnekler ve 65 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
- 2 mi, yeni hibridizasyon yıkama tamponu transfer embriyo örnekler ve 65 ° C'de 20 dakika inkübe edilir. Bir kez daha bu adımı yineleyin.
- 2 x SSC içinde, bir kez 65 ° C'de 20 dakika yıkama yapılmıştır aşırı prob çıkarın,% 0.1 Tween-20 ve 0.2 x SSC içinde üç kez,% 0.1 Tween-20.
- PBS, Tween-20 oda sıcaklığında% 0.1 1x embriyo örnekleri aktarın.
- Oda sıcaklığında en az 30 dakika blokaj tamponunda (1x PBS,% 0.1 Tween-20 içinde% 8 serumu) embriyolar inkübe edin.
Hapten etiketli Sondalar 5. Antikor tespiti
Not: Tüm üç farklı işaretli prob eşzamanlı hibridizasyon aksine, her bir prob bir antikor inkübasyon ve lekeleme ayrı mermi birbiri ardına tespit edilir. Bu nedenle, her bir algılama tur tek antikoru kullanıldığında (anti-digoksijenin-AP ya da anti-floresin-AP ya da anti-biyotin-AP) oluşur.
- STEP arasında seçim5.1.1 5.1.3 ve tespit edilecek olan hapten-etiketi göre uygun bir antikor seyreltme hazırlanması ile devam etmek.
Not: farklı etiketli problar sıralı saptanması için, bir anti-hapten antikor her bir algılama döngüsü uygulanır.- Bloke edici tampon içinde 4000:, floresein-işaretli prob algılama seyreltik için anti-floresan AP 1 konjugatlar.
- Bloke edici tampon içinde 4000: a digoksigenin-etiketli prob tespiti seyreltik için, anti-digoksijenin-AP 1 konjugatlar.
- Bloke edici tampon içinde 4000 seyreltme: bir biyotin-etiketli prob saptanması için, bir 1 de bir anti-biyotin-AP konjugat solüsyon hazırlanır.
- Oda sıcaklığında 3 saat 4 için, seçilmiş anti-hapten-AP çözeltisi embriyolar inkübe edin. Seçenek olarak ise, O / N 4 ° C'de inkübe edin. Aynı anda üç antikorları sürmeyin.
- Bağlanmamış antikorların çıkarılması için 1 x PBS, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 kat 4, 15 dakika ile embriyolar yıkayın.
- Tampon sistemlerini değiştirmek olduTNT oda sıcaklığında H iki kez 15 dakika (8,0 0.1 M Tris-HCI pH 0.1 M NaCl,% 0.1 Tween-20).
6. Alkalin Fosfataz Kromojenik Boyama
- Antikor bulgulama takiben (bakınız Tablo 1) 6.1.4 STEP 6.1.1 arasında seçim ve istenilen renk sinyali elde etmek için alkalin fosfataz kromojenik boyama reaksiyonlar bir ile devam eder. Tespit, her tur için farklı bir kromojenik alt tabaka reaksiyon, başka bir renk, her transkript örneğini vurgulamak için uygulanır.
- Hızlı Kırmızı Boyama
- TT8.2 15 dakika boyunca (0.1 M Tris-HCI pH 8.2,% 0.1 Tween-20) için embriyolar, iki kez yıkayın.
- Embriyoların yıkarken, Fast Red TR / NAMP Alkalen Fosfataz Yüzey Tablet Set Hızlı Kırmızı boyama solüsyon hazırlanır.
- Damıtılmış su, 1 ml ayarlanır tabletin bir tampon tableti çözülür ve 0.1 M Tris-HCl, pH 8,2 elde edilir vorteks karıştırın.
- Hazırlanan T içine Fast Red TR / NAMP tablet Bırakris tampon ve Hızlı Kırmızı boyama çözüm elde etmek için vorteks çözülür.
- 0.2 um'lik bir şırınga filtreden geçirilmiştir olmayan çözülmüş parçacıklarından açık Hızlı Kırmızı boyama çözeltisi.
- Hızlı Mavi Boyama
- Taze SB8.2 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCI pH 8.2, 0.1 M NaCI, 0.05 M MgCI2,% 0.1 Tween-20).
- Embriyoların yıkarken 50 mg / DMF () mi Fast Blue BB ve (DMSO içinde) 50 mg / ml naftol fosfat stok çözeltilerinden hızlı mavi ile boyanmamış solüsyon hazırlanır.
- Taze SB8.2 içinde 0.5 mg / ml'lik bir Fast Blue BB solüsyon hazırlanır.
- Taze SB8.2 içinde 0.5 mg / ml'de ayrı naftol fosfat solüsyon hazırlanır.
- Bir girdap ile sabit karıştırma altında Fast Blue BB çözeltisi içine hazırlanmış naftol fosfat çözeltisi ilave ilave edildi. Ortaya çıkan son çalışma konsantrasyonu, hem alt tabaka bileşenleri için ml 0.25 mg / olduğunu.
Not: Farklı Hızlı Mavi / naftol fosfonathate kombinasyonları, değişik renk tonları (Tablo 1 e bakınız) ile sonuçlanır.
- BCIP / NBT Boyama
- Taze SB9.5 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCI pH 9.5, 0.1 M NaCI, 0.05 M MgCI2,% 0.1 Tween-20).
- Bir purpleblue kromojenik sinyal için, taze 1 ul levamizol, 3,5 ul BCIP ve SB9.5 lekeleme tampon maddesi ml'si başına 4.5 ul NBT ekleyerek BCIP / NBT boyama solüsyonu hazırlamak ve iyice karıştırın.
- INT Boyama
- Taze SB9.5 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın.
- Bir yellowbrown kromojenik sinyal için, taze 1 ul levamizol, 5 ul Kırmızı-Fos ve SB9.5 lekeleme tampon maddesi ml'si başına 5 ul INT ekleyerek INT boyama solüsyonu hazırlamak ve iyice karıştırın.
Not: Alternatif olarak 7,5 ul / ml BCIP / INT hazır kullanım boyama çözeltisi kullanılır.
- Hızlı Kırmızı Boyama
- Boyama reaksiyon transferi embriyo örnekleri içinBir 24-yuvalı plaka. Karanlıkta seçilen boyama çözeltisi 400 ul her bir örnek inkübe edin.
- Bir stereomikroskop altında gelişimini sinyal bazen izleyin. Istenen sinyal gücü elde edilmiş ve önemli bir arka plan sinyali gözlenir önce zaman boyama reaksiyonu durdurun.
- Kromojenik reaksiyonu durdurmak oyuk başına 2 ml'lik TNT ihtiva eden bir 12-çukurlu plaka içinde uçlar lekeli embriyolar aktarın. TNT lekeli embriyolar iki kez durulayın.
- 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca iki kez yıkanır embriyolar, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 bakiye substratı temizlemek için.
7. Antikor Temizleme / Alkalen Fosfataz İnaktivasyonu
- Antikorunu çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika için düşük pH, durdurma çözeltisi (0.1 M glisin-HCI pH 2.2,% 0.1 Tween-20) 2 ml kuluçkalama ile alkalin fosfataz etkisiz hale getirirler.
- Oda sıcaklığında 1 x 2 ml PBS,% 0.1 Tween-20 ile 1 dakika için durulayın.
- 1 x PBS içinde 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın,% 0.1 Tween-20 ilave edilir.
8. İkinci Algılama Yuvarlak
- İkinci kopyanın dağılımını saptamak için ikinci hapten-etiket karşı hedeflenen antikor AP eşleniklerini kullanarak hapten-etiketli problar (STEP 5.4 5.1) antikor tespiti ile devam edin.
- Alkalin fosfataz kromojenik boyama (STEP 6.5 6.1) (mevcut renkler Tablo 1'e bakınız için) ilk saptama turunda kullanılan birine zıt renk üreten bir alt tabaka kombinasyonu uygulayarak gerçekleştirin.
- 7.3 ADIM 7,1 de tarif edildiği gibi ikinci antikor-AP konjugatı çıkarın.
9. Üçüncü Algılama Yuvarlak
- Üçüncü bir transkriptin dağılımını tespit etmek için, antikor-AP 3 hapten-etiket için belirli bir konjugatlar kullanılarak hapten-işaretli prob antikor tespiti (Basamak 5.4 5.1) devam edin.
- Alkalin fosfataz kromojenik boyama (STEP 6.5 6.1) ap olmayan bir alt tabaka kombinasyonu uygulayarak gerçekleştirinBir önceki algılama turlarında uğraşıyorlardı. Bir renk önceki iki algılama mermi olanlardan ayırt etmek kolay çöktürmek üreten kromojenik reaksiyonu seçiniz (renk seçimi için bakınız Tablo 1).
10. Montaj ve Görüntüleme
- PBS içinde% 30 gliserol düzgün lekeli embriyoların transferi ve embriyoların tam gliserol çözeltisi batırılmış kadar kuluçkaya yatmaktadır. Onlar dibe batar Onlar iyi dengelenir.
- H 2 O% 70 gliserol embriyo transferi ve oda sıcaklığında dengeye izin. Lekeli embriyolar 4 ° C'de% 70 gliserol içinde saklanabilir.
- Montaj için pipet bir nesne slayt üzerine ve slayt (Şekil 3) yapıştırılmış aralayıcıları dokunmadan% 70 gliserol damlacık embriyolar boyandı. Kapak kayma uygulayın.
- Görünüm bir mikroskop altında embriyolar monte edilmiş. Embriyolar istenilen açıda döndürmek, böylece uygulanan kapak kayma taşıyın.
- Düzgün gözlemleyinDiferansiyel Girişim Kontrast optik ile bileşik mikroskop altında yüksek çözünürlüklü (20X, 40X hedefleri) yönlendirilmiş embriyolar.
- Bir dijital renkli kamera ile görüntüler yakalayın ve dijital depolama aygıtında kaydedin.
Representative Results
Açıklanan protokol, farklı renklerde desen çok sayıda transkript eşzamanlı olarak gösterebilir. MC-DİLERİZ doğrudan aynı embriyo farklı genlerin ekspresyonu karşılaştırmak için avantaj sağlar. Bir örnek olarak, boş spiracles ekspresyon modelleri (EMS) 19, Fushi tarazu (STB) 20 ve özensiz eşleştirilmiş 1 (slp1) 21 ile doğrudan Drosophila melanogaster blastoderm aşamasında embriyoların karşılaştırıldı ve renk tonları çeşitli görselleştirildiği (Şekil 4) .
Farklı AP alt-tabaka kombinasyonları renkli çökelti (Tablo 1) zıt bir panel elde etmek için kullanılabilir. Hızlı Kırmızı ve BCIP / NBT tarafından üretilen mor çökelti tarafından üretilen kırmızı renk çökelti kolaylıkla ayırt edilebilir ve bu nedenle en yaygın kullanılanİki renkli deneylerinde ly (Şekil 4A). Hızlı Kırmızı renk transkript kısmi eş dağılımı durumunda gizlenmiş böylece Ancak, BCIP / NBT leke hızla oldukça koyu bir renk dönüşebilir. Bu nedenle, hızlı mavi uygulama NAMP, NAGP ve NABP olmuştur (Tablo 1) ile kombinasyon halinde mavi, yeşil ve mor ürünleri ortaya avantajı olabilir. NAMP Hızlı Mavi kombinasyonu ems sırasıyla kırmızı ve mavi görüntülenmiştir slp1 ifade siteleri (Şekil 4B) için burada gösterildiği gibi komşu veya üst üste ifade alanlarında Hızlı Kırmızı üründen kolayca ayırt edilir bir açık mavi renk verir. Yeşil ems etki açıkça kırmızı slp1 ifade sitesi (Şekil 4C) den farklıdır, böylece Hızlı Mavi NAGP kombinasyonu, Hızlı Kırmızı leke benzer güçlü bir kontrast sağlar. Ancak, ems ve slp1 ifade siteleri de eğerFast Blue NABP ve de Hızlı Kırmızı ile korunan, sırasıyla elde edilen mor ve kırmızı renk tortular (Şekil 4D) daha az fark bulunmaktadır. Yukarıda belirtildiği gibi, kırmızı ve yeşil, sırasıyla, (Şekil 4D) 'de slp1 ve FTZ ifadesi ile gösterildiği gibi, hızlı kırmızı ve Fast Blue NAGP ayırt etmek kolaydır.
INT ile kombinasyon halinde MagentaPhos FTZ segmental ekspresyonu (Şekil 4C, D) ortaya çıkarmak için kullanılan, sarı renkte bir çökelti oluşturur. Sarı renkli çökelti Hızlı Mavi NAMP sırasıyla (Şekil 4E) MAG / INT ile slp1 ve FTZ tespiti ile örneklendiği gibi mavi renkli yüzeylerde iyi bir kontrast oluşturur. Ancak, sarı çökelti Hızlı Kırmızı üründen daha kolay fark edilebilir. Ems sarı lekeli ifade alanı pek distribütörün olabilir kırmızı (Şekil 4F) 'de gösterilen slp1 rostral ifadesinden nguished. Bu yüzden, renk alt-tabakaların kombine dikkatle her bir deney için seçilmelidir.
Şekil MC-Wish 1. Akış Şeması. Üç benzersiz transkript kalıplarının çok renkli görselleştirme için, her algılama döngüsünde farklı antikor-AP konjugatlarında ve renk kombinasyonları substrat arasında seçim. Kısaltmalar: AP, alkalin fosfataz; BIO, biyotin; DIG, digoxigenin; FLUO, floresein. Diğer kısaltmalar efsaneleri 4 ve Tablo 1 Şekil bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
s / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg "/>
Embriyo taşıyıcıları olarak Şekil 2. ekler. (A) 15 mm çapında ve 74 um ağ gözü büyüklüğü poliester membranları ile altına takılı Uçlar Drosophila embriyo taşıyıcı olarak kullanılır. (B) ekler çeşitli çözeltiler için rezervuar tepsiler olarak işlev 12-yuvalı plakalar içinde bir araya getirilir. (C) Mevcut taşıyıcılar ve kolları 12 ekler / embriyo örnekleri aynı anda. (D) işleme izin bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lekeli embriyoların Şekil 3. montajı. Embriyolar ayırıcılar olarak işlev lamelleri, iki yığınlarının arasında% 70 gliserol bir damla monte edilmiştir. Uygulamanın Nazik hareketliyalan, büyük lamel gözlem ve fotoğraf için istenen yönelim içine monte edilmiş embriyolar döndürmek için yardımcı olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Drosophila embriyolar mRNA transkript renkli görselleştirme. Drosophila embriyolar MC-DİLERİZ deneyleri örnekleri yanal görüşlerinden gösterilmiştir. Boş spiracles mRNA ifadesi kalıpları (ems), Fushi tarazu (FTZ) ve özensiz eşleştirilmiş 1 (slp1) her panelde belirtilmiştir farklı AP renk kombinasyonları substrat, tarafından görüntülenmiştir. Tutanaklar (A) FTZ Fluo ve ems DIG (saptandı
| Yüzey kombinasyonu | 1 ml AP tamponu ekle | Concentration [ug / ml] | AP tamponu | Renk | Sinyal hassasiyeti |
| BCIP NBT | 3.5 ul 4.5 ul | 175 337,5 | SB9.5 | mor | +++ |
| MAG INT | 5 ul 5 ul | 250 250 | SB9.5 | sarı | + |
| BCIP / INT stok solüsyonu | 7,5 ul | 250 250 | SB9.5 | sarı | + |
| Fast Blue NAMP | 5 ul 5 ul | 250 250 | SB8.2 | mavi | ++ |
| Fast Blue NABP | 20 ul 10 ul | 1000 500 | SB8.2 | menekşe | ++ |
| Fast Blue NAGP | 10 ul 10 ul | 500 500 | TT8.2 | yeşil | + |
| Hızlı Kırmızı NAMP | 1 Tablet | 1000 400 | TT8.2 | kırmızı | ++ |
Tablo 1. Yüzey kombinasyonları Kısaltmalar: +++, kuvvetli;. ++, Ortam; + Zayıf NBT, 4-nitro-blue-tetrazolyum klorür; BCIP 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat; INT, 2- (4-iyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-tetrazolyum klorür; MAG, Macenta-Fos, 5-bromo-6-kloro-3-indolil-fosfat, NAMP, naftol-AS-MX-fosfat; NABP, Naphthol-AS-BI-fosfat; NAGP, Naftol AS--GR-fosfat; SB9.5, pH 9.5'te boyama tamponu; SB8.2, pH 8.2 de boyama tamponu; TT8.2, pH 8.2 Tris-Tween tampon.
Discussion
Radyoaktif olarak etiketlenmiş nükleik asit probları ile in situ hibridizasyon (ISH) sık sık doku kesitlerinde RNA lokalizasyonu tespit etmek için kullanılır. Radyoaktif ISH yöntemi, ancak daha az duyarlı zaman tüketen, ve tam bağlar tam transkript dağıtım desen takdir izin vermez. Bunun aksine, bu tarifnamede anlatılan MC-DİLERİZ yöntemi sağlam embriyolar içindeki renk kontrast çoklu gen sentezleme etki doğrudan bir karşılaştırmaya izin. MC-DİLERİZ histolojik bağlam hemen belli ve standart aydınlık mikroskobu ile kolayca görüntülendi avantaja sahiptir. Bu olasılık yüksek hassasiyetle birbirine topografik gen ifadesi etki ilgilidir ve hızlı ve güvenilir bir şekilde benzersiz ve üst üste ifade siteleri tanımlamak sağlar. Öte yandan, çok katlı flüoresan ISH (FISH) hassasiyet ve çözünürlük ile ilgili olarak daha güçlü ve tercihen ise selüler ya da alt-hücresel yeniden kullanılır,mRNA tespiti çözümü gereklidir.
MC-WISH haritalanmıştır transkript geniş spektrumlu hemen hemen herhangi bir transkript embriyonik değil, aynı zamanda larva ve yetişkin dokularda ve Drosophila başka türlerde de sadece analiz edilebilir olduğunu göstermektedir. Nitekim, Drosophila için burada ayrıntılı açıklanan prosedür, Zebra balığı embriyolarının 11,16,22 ile benzer verimli çalışır. Ayrıca, MC-DİLERİZ yöntemi serisinden, omurgasız ve omurgalı embriyoları ve doku numunesinin çeşitli adapte edilebilir.
Hapten-etiket ve prob konsantrasyonları
Rutin olarak RNA probların hapten etiket olarak floresein, digoksigenin ve biyotin kullanın. Ayrıca, dinitrofenol işaretli problar tatbik edilebilir, zebra balığı DİLERİZ deneylerde 23-25'te ortaya konan. Fluoresein iyi f kullanılır, böylece, floresein-işaretli problar ve diğer hapten-etiket ile karşılaştırıldığında daha düşük bir hassasiyet gösterdikleri içinbol transkriptlerin ya da tespiti. Her yeni transkripsiyon prob birinci performans alt-tabaka olarak BCIP / NBT ya da Hızlı Kırmızı kullanılarak değerlendirilmişlerdir tek bir DİLERİZ deneyde, test edilir. Arka plan geliştirme olmadan güçlü bir sinyal birkaç saat için dakika içinde elde edildiğinde bir prob konsantrasyonu optimum olarak kabul edilir.
Ilgi alanları ifade MC-WISH tam ölçüde tespit edilmiştir emin olmak için, en hassas alt tabaka kombinasyonu, BCIP / NBT kullanarak tek etiketli DİLERİZ deneyleri ile her transkript desen görselleştirmek için esastır. Bu zayıf ifade alanları çoklu hedef deneyinde ardı edilmemesini sağlar. Diğer alt tabaka kombinasyonlarının az hassasiyet telafi etmek için standart BCIP / NBT boyanması ile karşılaştırıldığında prob konsantrasyonları (üçe kadar) iki katına kullanmak esastır.
Düşük pH inaktivasyonu
Düşük pH inaktivasyon adımı yol açabilirİkinci ve üçüncü boyama turlarında azalmış sinyal tespiti ile sonuçlanan antisens hapten etiketli RNA prob / sense mRNA melezleri kısmi dağılması. Hassasiyet kaybı en aza indirmek için, etkisiz hale getirilmesi adımları mümkün olduğu kadar kısadır. Bu düşük pH değerinde 10 dakika kuluçkalama süresi AP aktivitesi ortadan kaldırılması için yeterli olduğu yaşadı. Geniş hacimli sonraki hızlı yıkar bağlanmamış antikor-AP konjügatların hızlı seyreltme sağlamak ve haptenized problar yeniden bağlayıcı engeller. Alternatif prosedürler paraformaldehit fiksasyon ve ısı inaktivasyonu yer almaktadır. Buna rağmen, renk çökeltilerinin bir ısıya kararlı değildir ve paraformaldehit sabitleme AP tam deaktivasyonu için yeterli olmayabilir. İlk uygulanan antikor AP çiftinden Eksik inaktivasyonu aşağıdaki algılama yuvarlak tespit edilecek olan ikinci bir mRNA türleri ile ifade yanlış pozitif örtüşme yol mRNA Desenin-görselleştirme yeniden yol açabilir. Bu nedenle, bir kontrol deneyinde the embriyolar uygulanan antikor AP çiftinden biri inaktive sonra iki bölüme ayrılır. Ikinci antikor-AP konjugat kontrol fraksiyondan ihmal edilir ve ikinci renk reaksiyonunda bir sinyal üretmek gerekir. İkinci renk reaksiyon, ilk önce bir tekabül eden bir sinyal dağıtım deseni oluşturur, ancak, o zaman etkisizleştirme prosedürü etkili oldu. Bu durumda, düşük pH durdurma çözeltisi içinde inkübasyon süresi bir sonraki deney için devam edilmelidir.
AP alt-tabaka uygulamanın siparişleri
Duyarlılığı tespit sonraki her yuvarlak damla yana, önceden daha bol transkriptlerin az bol mRNA'ların tespit etmek için tavsiye edilir. Hızlı boyalar tercihen güçlü bir ifade transkript tespiti için ilk boyama tur uygulanır ve böylece ek olarak, hızlı kırmızı ve Fast Blue substrat kombinasyonu, anlamlı purpleblue BCIP / NBT leke daha az duyarlıdır. Bu aynı zamanda, hsonraki BCIP / NBT boyama izlenir ve purpleblue sinyali hafif Hızlı boyalara göre çok kararmadan zamanında durdurulabilir avantaj olarak. Böylece standart iki renk deneyde, ilk güçlü ifade mRNA Hızlı Kırmızı tarafından tespit edilir ve ikinci zayıf BCIP / NBT tarafından. Bununla birlikte bir süre sonra yaygın hale çökelekler üretebilecek san INT substrat kombinasyonu tatbik edilebilir hızlı boyalar alternatif olarak. Bu nedenle, BCIP / INT sadece son boyama turunda uygulanır. Dolayısıyla üç renkli deneyde biz genellikle ilk Fast Red, ikinci BCIP / NBT (veya Hızlı Mavi) ve üçüncü bir INT substrat kombinasyonunu kullanabilirsiniz. O INT uygularken mümkün olan en kısa sürede lekeli embriyolar fotoğraflamak için tavsiye olduğunu unutmayın.
Azo boyalarının Floresan algılama
Bu koyu renk çökelti hafif bir gölge zaman örtüşen ifade şekilleri tanımak bazen zor olabilir. Fveya örneğin, bir güçlü bir şekilde gelişmiş BCIP / NBT çökelti hafif Hızlı boya sinyallerini maskeleyebilir. Bu sorunu aşmanın bir yolu, her boyamadan hemen sonra görüntülerini yakalamak ve sonraki algılama turdan önce uygulanan renk çökelti kaldırmaktır. Bu durumda, alkol çözülebilir bir azo boya (Fast Red) ve INT çökeltiler, sırasıyla birinci ve ikinci algılama turundan sonra etanol yıkaması ile çıkarılır ve BCIP / NBT boyama geçen AP-alt-tabaka 26 uygulanır. Diğer bir olasılık, azo boyalarının, floresan özelliklerinin avantajlarından almaktır. Fast Blue uzak-kırmızı filtre ile 28,29 gözlemlenebilirken Fast Red, 27 setleri rodamin filtresi kullanılarak görüntülenebilir. Çok yoğun olmak ve azo boya floresan sinyal gidermek kalmaması Karşılaştırılması veya kromogenik ve floresan görüntülerin bindirme, zamanında durdurulması için olan co-distribution.Using bu yaklaşımı, BCIP / NBT sinyal geliştirme siteyi ortaya çıkarabilir Reaksiyon ürünü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T.
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
