Summary
אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.
Abstract
כדי לנתח רשתות רגולציה גן פעילה בפיתוח וorganogenesis זה הכרחי להגדיר במדויק כיצד גנים השונים באים לידי ביטוי ביחס המרחבי לזה באתר עוברי. רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-ירצה) מאוד מקל ההשוואה מיידית של דפוסי ביטוי גנים, שכן היא מאפשרת הדמיה ייחודית של מיני mRNA שונים בצבעים מנוגדים באותו דגימת המדגם. זה מספק את האפשרות להתייחס תחומים ביטוי גנים טופוגרפיים זה לזה ברמת דיוק גבוהה ולהגדיר אתרי ביטוי ייחודיים וחופפים. בפרוטוקול שהוצג, אנו מתארים הליך MC-מאחלים להשוואת דפוסי ביטוי mRNA של גנים שונים בעוברי תסיסנית. עד שלוש בדיקות RNA, כל ספציפיות לגן אחר ושכותרתו על ידי hapten שונה, בו זמנית הם הכלאת דגימות העובר וזוהה לאחר מכן על ידי אלקליאימונוהיסטוכימיה colorimetric ne phosphatase מבוסס. ההליך המתואר מפורט כאן לדרוזופילה, אבל עובד באותה המידה גם עם עוברי דג הזברה.
Introduction
הכלאה באתר (איש) היא השיטה סטנדרטית לגילוי ולוקליזציה של תעתיקי רנ"א בהקשר מורפולוגיים, בתוך תאים, רקמות ואורגניזמים 1. האותות המיוצרים על ידי הליך ISH הם דמיינו בדרך כלל על ידי מערכות גילוי רדיואקטיבי, ניאון וchromogenic. בשנים האחרונות התקדמות טכנולוגית משמעותית בISH הניאון (דגים) 2 הביאו רגישות ורזולוציה השתפרה באופן דרמטי, המאפשרות איתור וכימות של ביטוי RNA בתא בודד ורמות תת-תאיות והדמיה RNA עד מולקולות בודדות 3,4 .While שיטות FISH מולקולה בודדת מתוחכמות המשמשות ליישומים מיוחדים נוסף, איש chromogenic נפוץ כRNA שגרתי בשיטת זיהוי אתר במחקר ואבחון קליני. לגילוי chromogenic תגובות ממטרים אנזים משמשות, אשר יוצרות מוצרים גלויים בצבעים מנוגדים באתריםשל הכלאה 5. זה היתרון שהדמית RNA יכולה להיות משולבת עם כתמים היסטולוגית שיגרתי והקשר מורפולוגיים ניכר מייד על ידי מיקרוסקופ brightfield הסטנדרטי. יתר על כן, רב של מצעי הצבע מיושמים לייצר משקעים, שהם יציבים בתקשורת הרכבה אורגנית ו / או מימית, כך שניתן להשיג הכנות מדגם קבועות 5.
בדרוזופילה, פרוטוקולי ISH ראשוניים להחיל בדיקות שכותרתו רדיו-איזוטופי לגילוי תמליל על חומר מחולק 6. למרות שזה קשה לשחזר מסעיפי רקמות דפוסי תמליל מלאים של עוברים שלמים או מערכות איברים, יישום נהלי ISH chromogenic עם בדיקות שכותרת אינה רדיואקטיבית מאפשר לזהות באופן גלובלי הפצות RNA בכל-mounts 7. למרות וריאציות רבות של איש chromogenic קיימות, באופייני כל הר הכלאה באתר היב פרוטוקולים (רוצה)בדיקות שכותרת hapten ridized מזוהות על ידי נוגדנים נגד hapten מצומדת לאנזים כתב ותעתיקי mRNA הם דמיינו ידי אַב צֶבַע מזרז.
לוח של משקעים בצבעים שונים המיוצרים על ידי כתב אנזימי phosphatase אלקליין (AP), peroxidase חזרת (POD), ובטא-galactosidase (GAL) מאפשר זיהוי הייחודי של מטרות מרובות ובעונה אחת המדגם 8-14. עם זאת, פעילות האנזימטית POD נמשכת רק לתקופת זמן מוגבלת ותגובת colorimetric הגל היא קצת פחות רגישה, כך שללא הגברה אות (tyramide) נוספת 15 הגילוי של תמלילים פחות בשפע יכולה להיות מאתגרת עם אנזימים אלה. לעומת זאת, הפעילות המתמשכת של AP מאפשרת למחזור מצע לטווח ארוך ויחס אות לרעש גבוה. ולכן, זיהוי רציף באמצעות אנזים כתב AP עם מצעים בצבע שונה הוכיח את יעילותו בתוקףזיהוי ייחודי של עד שלושה תעתיקים שונים בעוברים בודדים 10-12,16.
למשאלה זו רב-יעד chromogenic (MC-תרצה) שיטה (איור 1) 14, בדיקות RNA antisense שכותרתו מופקות על ידי שעתוק במבחנה ומסומנת באחד מhapten-התוויות הזמינות. הם עוברים פורמלדהיד קבוע וpermeabilized על ידי טיפול מתנול ועיכול K proteinase. הכלאה של עוברים מתבצעת בו זמנית עם עד שלוש בדיקות RNA antisense שכותרתו שונה בכל ספציפית לגן אחר. לאחר הסרת הבדיקה מאוגד על ידי שטיפות החמרה כל hapten-תווית דמיין בסיבוב של גילוי נפרד. סיבוב זיהוי יחיד מורכב מדגירה של עוברים עם נוגדן אנטי hapten מצמידים את AP והדמיה RNA על ידי יישום של AP-מצע שמייצר משקע צבע יציב מקומי. לאחר זיהוי נוגדנים וצביעה, conju נוגדן-AP מיושםהשער הוסר על ידי שטיפת pH נמוכה. בניסויים ססגוניות, כל סיבוב של זיהוי מעסיק נוגדנים ממוקדים נגד hapten תווית שונה וכל דפוס תמליל היא דמיינה על ידי מצע שונה צבע (טבלת 1). עוברים הם רכובים בגליצרול וצלמו תחת מיקרוסקופ מתחם ברזולוציה גבוהה באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה.
Protocol
1. תיוג של בדיקות RNA על ידי שעתוק במבחנה
- להרכיב בתגובת שעתוק במבחנה בmicrotube 1.5 מיליליטר בתנאי RNase ללא: 10.5 μl DEPC שטופל H 2 O, 4.0 μl 5x חיץ שעתוק, 1.0 מיקרוליטר (1 מיקרוגרם) לינארית DNA, מטוהר התבנית בDEPC שטופל H 2 O, 1.3 μl לערבב NTP, UTP שכותרת hapten 0.7 μl, מעכב רנ"א RiboLock 0.5 μl, 2.0 RNA פולימראז μl.
הערה: התגובה האחרונה הנפח הוא 20 μl. - בהתאם T7 שימוש רצף אמרגן של התבנית, RNA פולימראז T3 או SP6 לשעתוק במבחנה (ראה התייחסות 17).
- בחר digoxigenin-11-UTP, ביוטין-16-UTP, או העמסה-12-UTP כתווית לבדיקת RNA. לפרטים נוספים, ראה דיון בhapten-תוויות וריכוזי בדיקה בדיון.
- מערבבים תגובת שעתוק וספין למטה זמן קצר.
- בואו לתמללבמשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף DNase RNase ללא μl 1 אני לתגובת השעתוק להסרת תבנית ה- DNA, ומערבב היטב, ודגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- התאם עם H DEPC שטופל 2 O נפח הדגימה 200 μl.
- הוספת 100 μl (0.5 כרך) אצטט 7.5 M אמוניום ו -600 μl אתנול (3 כרך) כדי לזרז בדיקה RNA שכותרת. דגירה של 30 דקות ב RT.
- אין להשתמש באתנול קר כקרח, שכן הדבר עלול להוביל למשקעים לא רצויים של נוקלאוטידים מאוגדים.
- ספין למטה RNA עיבד בצנטריפוגה טמפרטורה מבוקרת במהירות המרבית (20,800 XG) במשך 30 דקות ב +20 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant.
- שטוף את הכדור וכתוצאה מכך עם אתנול 70% ב RT וצנטריפוגות ב20,800 XG במשך 10 דקות ב +20 מעלות צלזיוס.
- הסר supernatant ולהיזהר שלא לשאוב את הכדור החופשי בטעות. בואו אוויר יבש גלולה בmicrotube עם מכסה נפתח לכמה דקות ב RT.
- דיסלפתור את גלולה שהתקבלה בשל H DEPC שטופל 2 O. 100 μl
- להוסיף 300 μl חיץ הכלאה מראש (50% כרך / פוראמיד deionized כרך, 5x SSC, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין סודיום מלח, 0.1% Tween-20, מ"ג הכרך / כרך 5 / מיליליטר torula RNA) ולאחסן ב -20 ° C . בדיקות יכולות להיות לטווח ארוך המאוחסן ב -20 ° C.
הערה: מבחן ראשון של חללית RNA שכותרת hapten עיבד חדש לדלל בדיקה 3 μl 100 חיץ הכלאה μl להשיג הריכוז הסופי לניסוי ירצה.
2. עיבוד של דוגמאות העובר באמצעות הוספת
הערה: השימוש בmicrotubes או צלחות רב גם לעיבוד עוברים בשלבי הדגירה השונים נושא את הסיכון של אובדן כמויות משמעותיות של עוברים על ידי aspirating אותם בטעות במהלך חילופי פתרונות. כדי להימנע מההפסד הזה, זה יכול להיות מועיל להשתמש סלים (כגון מוסיף NetWell) לביצוע דגימות עובר בהליך. אלה הם קלקר בserts עם רשת פוליאסטר בתחתית (איור 2 א), שבו עובר לנוח במהלך עיבוד.
- לעיבוד עוברים בהליך ירצה, להרכיב מוסיף בצלחת 12-היטב (איור 2) ולהוסיף 2 מיליליטר של הפתרון המתאים לכל אחד.
- פיפטה את העוברים למוסיף באמצעות קצה כחול. ודא שכל העוברים שקועים בנוזל.
- כאשר זמן דגירה הוא מעל המקום מוסיף המכיל עובר בצלחת אחרת 12 גם, שמלא בפתרון לשלב הבא.
- השתמש בנישאים וידיות (איור 2 ג) להעביר עד 12 דגימות בכל פעם מפתרון אחד למשנהו (איור 2 ד).
הערה: כדי להפחית את הכמויות הנדרשות, להשתמש 2.0 microtubes מיליליטר לצעדי הכלאה מראש / הכלאה (ראה שלב 4.1) וצלחות 24 גם לתגובות מכתימה (שלב 6.2). תגובות ההכלאה וצביעה מבוצעות בהיקפים של 1001; l ו- 400 μl, בהתאמה.
- השתמש בנישאים וידיות (איור 2 ג) להעביר עד 12 דגימות בכל פעם מפתרון אחד למשנהו (איור 2 ד).
3. הכנת עוברים לכלאה
- לאסוף, dechorionate, לתקן, וdevitellinize עובר באמצעות נהלים סטנדרטיים 14,18. העוברים מוכנים מאוחסנים באופן שיגרתי במתנול ב -20 ° C.
- העברה עובר לשמש לכלאה באתר לRT ולהפיץ למוסיף של 12 גם צלחת מלאה עם 2 מיליליטר מתנול בכל טוב.
- רעננות עוברים דרך סדרת מתנול יורדת ב RT. דגירה עובר בכל פעם במשך 3 דקות ב: מתנול 75% בPBS (ii) מתנול 50% 1x ב1x PBS (i), 0.1% Tween-20 (iii) מתנול 25% ב1x PBS, 0.1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0.1% Tween-20 (V) 1X PBS, Tween-20 0.1%.
- טרום לתקן את העוברים paraformaldehyde 4% ב 1x PBS במשך 20 דקות ב RT.
- הסר את מקבע על ידי 4 שטיפות במשך 3 דקות ב1x PBS, 0.1% Tween-20 ב RT. בינתיים להפשיר ולהכין K proteinase ופתרונות גליצין עובד.
- לעצור את התגובה על ידי שתי 1 שטיפות דקות ב 2 מ"ג / מיליליטר גליצין ב 1x PBS, 0.1% Tween-20 ב RT.
- פוסט לתקן את העוברים paraformaldehyde 4% ב 1x PBS במשך 20 דקות ב RT.
- בהמשך לכך, להסיר מקבעת paraformaldehyde ידי שטיפה ארבע פעמים במשך 3 דקות ב1X PBS, 0.1% Tween-20 ב RT.
- עוברים קבוע לאחר העברה מראש הכלאת חיץ. עוברי חנות במאגר הכלאה מראש ב -20 ° C או ישירות להמשיך בהכלאה של בדיקות.
4. הכלאה של בדיקות
- העברת עוברים מאוחסנים ב -20 ° C במאגר הכלאה מראש לRT. להפיץ עוברים במאגר הכלאה מראש ל2.0 מיליליטר microtubes.
- למשך 30 דקות לפחות, לפני להכליא דגימות עובר על 65 מעלות צלזיוס במאגר הכלאה מראש.
הערה: הכלאה מראש וכלת צעדים waterbath משמש. במהלך הכלאה מראש יש זמן להכין את תערובת הבדיקה על ידי שילוב של עד שלוש בדיקות RNA antisense, כל ספציפית לתעתיק גן שונה ושכותרתו עם hapten שונה. - כדי להשיג את תערובת הבדיקה, להוסיף כמויות ביחד מתאימות (בדרך כלל בין 1 עד 6 μl μl) של כל בדיקה רצויה מקורית שכותרת hapten antisense RNA במאגר הכלאת 100 μl (50% כרך / פוראמיד deionized כרך, 5x SSC, 50 מיקרוגרם / מיליליטר מלח נתרן הפרין, Tween-20 0.1% כרך / כרך, 5 מ"ג / מיליליטר torula RNA, 5% סולפט dextran WT / כרך).
הערה: התוספת של סולפט dextran היא אופציונלית. - לפגל תמהיל הבדיקה RNA antisense בגוש חום על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בהמשך לכך להעביר את תערובת הבדיקה מפוגל ישירות ל -65 מעלות צלזיוס.
- להסיר את רוב ההכלאה מראשחיץ מדגימות העובר ולהוסיף את תערובת הבדיקה מפוגל.
- בואו דגימות עובר להכליא לחקור O התערובת / N על 65 מעלות צלזיוס.
הערה: טמפרטורות הנעות בין 55 מעלות צלזיוס ו 65 מעלות צלזיוס משמשות באופן שיגרתי לצעדי הכלאה, לפני ואחרי כלאה. הכלאה על 65 מעלות צלזיוס מספקת תנאים המחמירים ביותר ומומלצת במקרה של בעיות רקע בעת שימוש בטמפרטורות נמוכות יותר. אם אין בעיות רקע, הכלאה על 55 מעלות צלזיוס מומלצת, המספקת את היתרון של עוצמת אות משופרת ושלמות עובר משופרת. - למחרת בבוקר, להעביר ראשון פתרונות לשטוף החמרה עד 65 מעלות צלזיוס, כדי לוודא שהם מחוממים לטמפרטורה הנכונה בזמן.
- תמהיל העברת הכלאת בדיקה עם עוברים מ2.0 מיליליטר microtubes למוסיף של צלחת 12-היטב המכילה 2 מיליליטר חיץ מראש חימם הכלאה לשטוף (פוראמיד 50% ב 2 × SSC, 0.1% Tween-20). מניחים את צלחת 12-המכילה גם אותםדגימות bryo בתנור ודגירה במשך 20 דקות על 65 מעלות צלזיוס.
- דגימות עובר העברה לחיץ לשטוף הכלאה חדש 2 מיליליטר ו דגירה במשך 20 דקות על 65 מעלות צלזיוס. חזור על פעולה זו פעם נוספת.
- הסר בדיקה עודף של 20 שטיפות דקות ב 65 מעלות צלזיוס, פעם ב 2 × SSC, 0.1% Tween-20 ושלוש פעמים ב0.2 × SSC, Tween-20 0.1%.
- העברת דגימות העובר ל1X PBS, 0.1% Tween-20 ב RT.
- דגירה עובר בחיץ חסימה (8% בסרום כבשים ב1x PBS, 0.1% Tween-20) לפחות 30 דקות ב RT.
5. נוגדן איתור של בדיקות שכותרת hapten
הערה: בניגוד להכלאה בו זמנית של כל שלוש הבדיקות שכותרתו שונה, כל בדיקה מזוהה בזה אחר זה בסבבים נפרדים של דגירה נוגדן וצביעה. לכן, בכל סיבוב זיהוי משמש רק אחד נוגדן (או אנטי digoxigenin-AP או אנטי-והעמסת-AP או אנטי-ביוטין-AP).
- לבחור בין שלב5.1.1 ל5.1.3 ולהמשיך בהכנת דילול הנוגדן המתאים בהתאם לhapten-התווית שהיא כדי להתגלות.
הערה: זיהוי רציף של הבדיקות שכותרתו שונה, אחר אנטי-hapten-נוגדן מיושם בכל מחזור זיהוי.- לגילוי של בדיקה שכותרתו והעמסת לדלל אנטי-והעמסת-AP conjugates 1: 4000 בחסימת מאגר.
- לגילוי של בדיקה שכותרת digoxigenin לדלל אנטי digoxigenin-AP conjugates 1: 4000 בחסימת מאגר.
- לגילוי של בדיקה שכותרתו ביוטין להכין פתרון המצומד נגד יוטין-AP בדילול 1: 4000 בחסימת מאגר.
- דגירה עובר בפתרון האנטי-hapten-AP נבחר במשך 3 עד 4 שעות ב RT. לחלופין, דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס. אין ליישם את כל שלושת הנוגדנים בו זמנית.
- על מנת להסיר נוגדן מאוגד לשטוף את העוברים עם 1X PBS, 0.1% דקות Tween-20 עבור 4 פעמים 15 ב RT.
- כדי לשנות מערכות חיץ היהh שתי פעמים 15 דקות ב RT בTNT (0.1 מ 'טריס-HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0.1% Tween-20).
6. אלקליין phosphatase Chromogenic מכתים
- לאחר זיהוי נוגדן לבחור בין שלב 6.1.1 ל6.1.4 ולהמשיך עם אחת מהתגובות מכתימה chromogenic phosphatase אלקליין לקבל את אות הצבע הרצויה (ראה טבלה 1). לכל סיבוב של זיהוי תגובת מצע chromogenic שונה מיושמת כדי להדגיש כל דפוס תמליל בצבע אחר.
- מהיר אדום מכתים
- לשטוף את העוברים שתי פעמים במשך 15 דקות בTT8.2 (Tween-20 0.1 8.2, 0.1% M טריס- HCl pH).
- בזמן שטיפת עוברים, להכין את הפתרון מכתים האדום המהיר מהאדום TR / NAMP אלקליין phosphatase מצע לוחות הסט המהיר.
- ממיסים לוח חיץ מהלוח שנקבע ב 1 מיליליטר מים מזוקקים ומערבבים על ידי vortexing להשיג 0.1 M טריס-HCl pH 8.2.
- זרוק לוח האדום TR / NAMP מהיר לT מוכןRIS חיץ ולפזר על ידי vortexing להשיג הפתרון מכתים האדום המהיר.
- פתרון ברור מהיר אדום מכתים מחלקיקים מומסים שאינם דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
- מהיר הכחול מכתים
- לשטוף עובר שתי פעמים במשך 15 דקות במאגר מכתים SB8.2 טרי (0.1 מ 'טריס-HCl pH 8.2, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl 2, Tween-20 0.1%).
- בזמן שטיפת עוברים, להכין את הפתרון מכתים הכחול המהיר מ 50 מ"ג / מיליליטר הכחול המהיר BB (בDMF) ו -50 מ"ג / מיליליטר פוספט naphthol (בDMSO) פתרונות מניות.
- טרי להכין פתרון BB הכחול מהיר ברמה של 0.5 מ"ג / מיליליטר בSB8.2.
- טרי להכין פתרון פוספט naphthol נפרד ברמה של 0.5 מ"ג / מיליליטר בSB8.2.
- Dropwise להוסיף את פתרון פוספט naphthol מוכן לפתרון BB הכחול המהיר תחת ערבוב מתמיד עם מערבולת. ריכוז העבודה סופי וכתוצאה מכך הוא 0.25 מ"ג / מיליליטר לשני מרכיבי המצע.
הערה: phosp שונה מהיר הכחול / naphtholשילובי שנאה לגרום לגווני צבע שונים (ראה טבלה 1).
- BCIP / NBT מכתים
- לשטוף עובר שתי פעמים במשך 15 דקות במאגר מכתים SB9.5 טרי (0.1 מ 'טריס-HCl pH 9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl 2, Tween-20 0.1%).
- לאות chromogenic purpleblue, טרי להכין פתרון מכתים BCIP / NBT ידי הוספת levamisole μl 1, BCIP 3.5 μl 4.5 NBT μl לכל מיליליטר של חיץ מכתים SB9.5 ומערבבים היטב.
- INT מכתים
- לשטוף את העוברים שתי פעמים במשך 15 דקות במאגר מכתים SB9.5 טרי.
- לאות chromogenic החומים-צהובים, טרי להכין פתרון מכתים INT ידי הוספת levamisole 1 μl, 5 μl מגנטה-Phos ו -5 INT μl לכל מיליליטר של חיץ מכתים SB9.5 ומערבבים היטב.
הערה: לחלופין להשתמש 7.5 μl / מיליליטר BCIP / INT פתרון מכתים מוכן לשימוש.
- מהיר אדום מכתים
- לדגימות עובר העברת תגובה מכתימהלצלחת 24 גם. דגירה כל דגימה ב400 μl של הפתרון מכתים בחר בחושך.
- צג מדי פעם לאותת פיתוח תחת סטראו. לעצור את התגובה מכתימה כאשר עוצמת האות הרצויה מתקבלת ולפני אות רקע משמעותית הוא ציינה.
- כדי לעצור את תגובת chromogenic, להעביר עוברים צבעוניים למוסיף של צלחת 12-היטב המכילה 2 מיליליטר TNT בכל טוב. יש לשטוף את העוברים המוכתמים שתי פעמים בTNT.
- לשטוף את העוברים שתי פעמים במשך 10 דקות ב 1 × PBS, 0.1% Tween-20 ב RT להסיר מצע שייר.
הסרת נוגדן 7. / אלקליין phosphatase איון
- הסר נוגדן ולהשבית phosphatase אלקליין על ידי דגירה ב 2 מיליליטר של תמיסה נמוכה תחנת pH (0.1 מ 'Tween-20 2.2, 0.1% גליצין-HCl pH) במשך 10 דקות ב RT.
- יש לשטוף דקות 1 עם 2 מיליליטר של 1 × PBS, 0.1% Tween-20 ב RT.
- לשטוף 3 פעמים במשך 3 דקות ב1 × PBS, 0.1% Tween-20 ב RT.
8. שנית איתור עגול
- כדי לזהות את הדפוס וההפצה של תמליל שני להמשיך באיתור נוגדנים של בדיקות שכותרת hapten (שלב 5.1-5.4) באמצעות conjugates הנוגדן-AP הממוקד נגד hapten התווית השנייה.
- לבצע צביעת אלקליין phosphatase chromogenic (שלב 6.1-6.5) החלת שילוב מצע שמייצר צבע מנוגד לזה המשמש בסיבוב הראשון זיהוי (לצבעים זמינים ראו טבלה 1).
- הסר המצומד הנוגדן-AP השני כמתואר בשלב 7.1-7.3.
9. שלישי איתור עגול
- כדי לזהות את הדפוס וההפצה של תמליל שלישי, להמשיך באיתור נוגדנים של בדיקות שכותרת hapten (שלב 5.1-5.4) באמצעות נוגדן-AP conjugates ספציפי לhapten התווית השלישית.
- לבצע צביעת אלקליין phosphatase chromogenic (שלב 6.1-6.5) החלת שילוב מצע שלא היה APהעמיס בסיבובים הקודמים זיהוי. בחר תגובת chromogenic שמייצרת צבע לזרז קל להבחין מאלה של סיבובי שני זיהוי הקודם (לבחירת צבע ראה טבלה 1).
10. הרכבה והדמיה
- העבר את העוברים מוכתמים כראוי לגליצרול 30% ב- PBS ודגירה עד עוברים הם ספוגים באופן מלא בפתרון גליצרול. הם גם equilibrated כשהם שוקעים לתחתית.
- העברה עובר לגליצרול 70% בH 2 O ולתת לאזן ב RT. ניתן לאחסן את העוברים המוכתמים בגליצרול 70% על 4 מעלות צלזיוס.
- להרכבה, פיפטה מוכתמת עוברים בטיפת גליצרול 70% על שקופית אובייקט ובלי לגעת במפרידים הדבוקים לשקופית (איור 3). החל להחליק את המכסה.
- צפה ברכוב עוברים תחת מיקרוסקופ לנתח. הזז את תלוש לכסות מיושם, כך שהעוברים לסובב לכיוון הרצוי.
- שים לב כראויעוברי אוריינטציה ברזולוציה גבוהה (20X, 40X יעדים) תחת מיקרוסקופ מתחם עם אופטיקה התערבות הפרש לעומת זאת.
- צלם תמונות במצלמה דיגיטלית בצבע ולשמור על התקן אחסון דיגיטלי.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר מאפשר ההדמיה בו זמנית של דפוסי תמליל מרובים בצבעים שונים. MC-מאחלים מספק יתרון להשוות ישירות את דפוסי הביטוי של גנים שונים באותה העובר. כדוגמא, את דפוסי הביטוי של spiracles הריק (EMS) 19, Fushi tarazu (FTZ) 20 ומרושלים לזווג 1 (slp1) 21 בהשוואה ישירות בעוברים בblastoderm תסיסנית melanogaster ומדמיינים במגוון רחב של גווני צבע (איור 4) .
שילובי מצע AP שונים זמינים כדי לקבל פנל של מנוגד משקעים צבע (טבלה 1). משקע הצבע האדום המיוצר על ידי אדום מהיר והמשקע הסגול המיוצר על ידי BCIP / NBT ניתן להבחין בקלות ולכן משמשים נפוץ ביותרly בניסויים בשני צבעים (איור 4 א). עם זאת, את כתם BCIP / NBT יכול להפוך במהירות לצבע ולא כהה, כך שהצבע האדום המהיר מוסווה במקרה של שיתוף הפצה החלקית של תמלילים. לכן, היישום של כחול מהיר יכול להיות יתרון, אשר מייצר מוצרים כחולים, ירוקים וסגולים בשילוב עם NAMP, NAGP וNABP, בהתאמה (לוח 1). השילוב של כחול מהיר עם NAMP נותן צבע תכלת שהוא בקלות להבחין מהמוצר האדום המהיר בתחומים ביטוי סמוכים או חופפים, כפי שמוצגים כאן לEMS ואתרי slp1 ביטוי דמיינו באדום וכחול, בהתאמה (איור 4). שילוב NAGP הכחול המהיר מספק ניגוד חזק דומה לכתם האדום המהיר, כך שתחום EMS הירוק הוא בבירור ייחודי מאתר הביטוי slp1 האדום (איור 4C). עם זאת, אם EMS ואתרי ביטוי slp1 הם דהtected ידי כחול NABP המהיר ואדום מהיר, בהתאמה, וכתוצאה מכך סגול ומשקעי צבע אדומים פחות ניכרים (איור 4D). כפי שצוין לעיל, אדום מהיר ומהיר הכחול NAGP קלים להבחין, כפי שמוצג על ידי slp1 וביטוי FTZ באדום וירוק, בהתאמה (איור 4D).
MagentaPhos בשילוב עם INT מייצר משקע צהוב, המשמש כדי לחשוף את הביטוי המגזרי של FTZ (איור 4C, E). המשקע בצבע הצהוב יוצר ניגוד טוב למצעים בצבע הכחולים כפי שהודגם על ידי זיהוי של slp1 וFTZ עם כחול NAMP המהיר והפרקליט הצבאי הראשי / INT, בהתאמה (איור 4E). עם זאת, המשקע הצהוב ניכר פחות קל מהמוצר האדום המהיר. תחום הביטוי צבעוני הצהוב של EMS יכול להיות כמעט Disti nguished מהביטוי מקורי של slp1 מוצג באדום (איור 4F). לכן, שילוב של מצעי צבע צריך להיות שנבחר בקפידה עבור כל ניסוי.
איור 1. תרשים זרימה של MC-תרצה. להדמיה צבעונית של שלושה דפוסי תמליל ייחודיים, לבחור בין conjugates שונה נוגדן-AP ושילובי מצע צבע בכל מחזור זיהוי. קיצורים: AP, phosphatase אלקליין; יו, ביוטין; DIG, digoxigenin; Fluo, והעמסת. לקיצורים אחרים לראות אגדות איור 4 וטבלה 1. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s / ftp_upload / 53,830 / 53830fig2.jpg "/>
איור 2. הוספת כנישאי עובר. (א) הוספת מצוידת בתחתית עם ממברנות פוליאסטר של 15 מ"מ קוטר ו -74 מיקרומטר גודל רשת משמשות כנישאי עובר דרוזופילה. (ב) מוסיף הם התאספו בלוחות 12-גם, שמתפקדים כמאגר למגשי הפתרונות השונים. (ג) ספקים וידיות זמינים מאפשרים עיבוד של (D) 12 מוסיף / דגימות עובר בו-זמנית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הרכבה איור 3. עוברים מוכתמים. עוברים הם רכובים בירידה של גליצרול 70% בין שתי ערימות של coverslips, אשר מתפקד כמפרידים. מרגש עדין של האפליקציהcoverslip הגדול שיקר עוזר לסובב את העוברים הרכובים לכיוון הרצוי לתצפית וצילום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הדמיה ססגוניות של תעתיקי mRNA בעוברי תסיסנית. דוגמאות לניסויי MC-מאחלים בעוברות תסיסנית מוצגות מנופים לרוחב. דפוסי ביטוי mRNA של spiracles הריק (EMS), Fushi tarazu (FTZ) ומרושל לזווג 1 (slp1) הם דמיינו ידי שילובים שונים AP צבע מצע, אשר הצביעו על כל לוח. תמלילים אותרו על ידי () Fluo FTZ וEMS DIG, (
| שילוב מצע | הוסף לחיץ 1 מיליליטר AP | Concentration [מיקרוגרם / מיליליטר] | מאגר AP | צֶבַע | רגישות אות |
| BCIP NBT | 3.5 μl 4.5 μl | 175 337.5 | SB9.5 | סָגוֹל | +++ |
| INT MAG | 5 μl 5 μl | 250 250 | SB9.5 | צָהוֹב | + |
| פתרון מניות BCIP / INT | 7.5 μl | 250 250 | SB9.5 | צָהוֹב | + |
| מהיר הכחול NAMP | 5 μl 5 μl | 250 250 | SB8.2 | כָּחוֹל | ++ |
| מהיר הכחול NABP | 20 μl 10 μl | 1,000 500 | SB8.2 | סָגוֹל | ++ |
| מהיר הכחול NAGP | 10 μl 10 μl | 500 500 | TT8.2 | יָרוֹק | + |
| מהיר האדום NAMP | לוח 1 | 1,000 400 | TT8.2 | אָדוֹם | ++ |
1. שילובי שולחן מצע קיצורים: +++, חזק;. ++, בינוני; +, NBT החלש, כלוריד הכחול-4 ניטרו-tetrazolium; BCIP, 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט; INT, 2 (4 iodophenyl-) -3- (4-nitrophenyl) -5-פניל-tetrazolium כלוריד; MAG, מגנטה-Phos, 5-bromo-6-כלורו-3-indolyl-פוספט, NAMP, Naphthol-AS-MX-פוספט; NABP, Naphthol-AS-BI-פוספט; NAGP, Naphthol-AS-GR-פוספט; SB9.5, חיץ מכתים ב- pH 9.5; SB8.2, חיץ מכתים ב- pH 8.2; TT8.2, חיץ טריס-Tween ב- pH 8.2.
Discussion
הכלאה באתר (איש) עם בדיקות חומצות גרעין שכותרתו רדיואקטיבית משמש לעתים קרובות כדי לזהות את הלוקליזציה של RNA על סעיפי רקמות. שיטת ISH רדיואקטיבי, לעומת זאת, היא לצרוך זמן, פחות רגיש, ואינה מאפשרת הערכה של דפוסי הפצת תמליל מלאים בכל-mounts. לעומת זאת, בשיטת MC-מאחלים המתוארים במסמך זה מאפשרת השוואה הישירה של תחומים ביטוי גנים רבים בצבעים מנוגדים בתוך עוברים ללא פגע. יש MC-מאחל ליתרון שההקשר היסטולוגית ניכר מייד ומדמיין פשוט על ידי מיקרוסקופ brightfield הסטנדרטי. זה מספק את האפשרות להתייחס תחומים ביטוי גנים טופוגרפיים זה לזה ברמת דיוק גבוהה ולהגדיר אתרי ביטוי ייחודיים וחופפים באופן מהיר ואמין. מצד השני, איש מרובב ניאון (דגים) הוא חזק יותר ביחס לרגישות ורזולוציה ומשמש רצוי, אם סלולארי או אפילו מחדש משנה הסלולרפתרון של גילוי mRNA נדרש.
הספקטרום הרחב של תמלילים שמופה על ידי MC-מאחלים מצביע על כך שכמעט כל תמליל ניתן לנתח לא רק בעוברי, אלא גם ברקמות זחל ומבוגרים ובמינים אחרים מאשר דרוזופילה. ואכן, ההליך המתואר המפורט כאן לדרוזופילה, פועל באופן דומה יעיל עם עוברי דג הזברה 11,16,22. יתר על כן, שיטת MC-מאחלים ניתן להתאים למגוון רחב של עוברים חסרי חוליות ובעלי חוליות ודגימת רקמה.
Hapten-תוויות וריכוזי בדיקה
אנו משתמשים באופן שיגרתי והעמסת, digoxigenin, וביוטין כתוויות hapten של בדיקות RNA. יתר על כן, בדיקות שכותרת dinitrophenol ניתן להחיל, שכבר הציג בניסויי מאחלים דג הזברה 23-25. בדיקות שכותרת העמסה להציג רגישות פחותה בהשוואה לhapten-תוויות האחרות, כך ההעמסה המשמשת הטובה ביותר ואו זיהוי של תמלילי שפע. כל בדיקה עיבד חדש נבדקה ראשונה בניסוי משאלה אחת, שבו ביצועיה מוערכים או באמצעות BCIP / NBT או אדום מהיר כמצע. ריכוז בדיקה נחשב כאופטימלי כאשר איתות חזקה ללא פיתוח רקע מושגת בתוך דקות לכמה שעות.
כדי לוודא שתחומי הביטוי של עניין זוהו על ידי MC-מאחלים מלוא היקפם, זה חיוני כדי לחזות כל דפוס תמליל על ידי ניסויי משאלה אחת-תווית באמצעות שילוב המצע רגיש ביותר, BCIP / NBT. הדבר מבטיח כי תחומים ביטוי חלשים לא התעלמו בניסוי רב-היעד. כדי לפצות על הרגישות פחותה של שילובי מצע האחרים זה חיוני להשתמש הוכפל (לשולש) ריכוזי בדיקה בהשוואה לBCIP הכתמה / NBT סטנדרטי.
איון pH נמוך
צעד איון pH הנמוך יכול להוביל להתפוררות חלקית של הכלאיים mRNA בדיקה / תחושת RNA antisense כותרת hapten וכתוצאה מכך גילוי אותות מופחתים בסיבובי הצביעה השניה והשלישי. כדי להקטין את איבוד ברגישות, צעדי איון הם קצרים ככל האפשר. אנחנו חווינו את זה זמן דגירה 10 דקות ב pH הנמוך מספיק עבור חיסול של AP-פעילות. שוטף מהיר לאחר מכן בכמויות גדולות להבטיח דילול מהיר של conjugates הנוגדן-AP מאוגד ולמנוע מחדש מחייב בדיקות haptenized. הליכים חלופיים כוללים קיבוע paraformaldehyde ואיון חום. עם זאת, חלק ממשקעי הצבע לא לחמם יציב וקיבעון paraformaldehyde עלול שלא להספיק לאיון של AP מלא. איון שלם של המצומד הנוגדן-AP הראשון שימושי יכול להוביל מחדש הדמיה של תבנית ה- mRNA בגילוי הבא סיבוב מוביל לחפיפה חיובית כוזבת בביטוי עם מיני mRNA השני כדי להתגלות. לכן, בניסוי שליטת העוברי דואר מחולקים לשני שברים לאחר איון של המצומד הנוגדן-AP הראשון השימושית. המצומד הנוגדן-AP השני מושמט מחלק השליטה ולא צריך לייצר אות בתגובת הצבע השנייה. עם זאת, אם תגובת הצבע השנייה יוצרת דפוס הפצת אות המתאים הראשון, ולאחר מכן את הליך איון לא היה יעיל. במקרה זה, זמן הדגירה בפתרון תחנת pH נמוך צריך להיות ממושך לניסוי הבא.
הזמנות של יישום מצע AP
מאז רגישות טיפות עם כל סיבוב של גילוי שלאחר מכן, רצוי לזהות mRNAs פחות בשפע לפני תמלילים שופעים יותר. בנוסף, האדום המהיר ושילובי מצע כחולים מהיר באופן משמעותי פחות רגישים מאשר BCIP purpleblue / כתם NBT, כך שצבעים מהיר מיושמים רצוי בסיבוב הראשון צביעה לגילוי של התמליל הביע החזק. גם שעות זהכיתרון שBCIP הכתמה / NBT שלאחר מכן יכולה להיות במעקב ועצרה בזמן לפני אות purpleblue מקבלת כהה מדי ביחס לצבעים הבהירים יותר המהיר. כך בניסוי שני צבעים סטנדרטיים, ראשון mRNA הביע החזק הוא זוהה על ידי אדום מהיר והשני החלש יותר אחד על ידי BCIP / NBT. כחלופה לצבעים המהיר שילובי מצע INT הצהובים עשויים להיות מיושמים, אשר עם זאת לייצר משקעים שהופכים לפזר אחרי כמה זמן. לכן BCIP / INT מיושם באופן בלעדי בסיבוב הצביעה האחרון. כתוצאה מכך בניסוי שלושה צבעים לעתים קרובות אנו משתמשים אדום הראשונים מהיר, BCIP השני / NBT (או כחול מהיר) ושלישית שילוב מצע INT. שים לב שרצוי לצלם עוברים מוכתמים בהקדם האפשרי בעת החלת INT.
זיהוי ניאון של צבעי אזו
זה יכול להיות קשה לפעמים לזהות דפוסי ביטוי חופפים כאשר משקע צבע כהה הוא הצללה אחד בהיר יותר. Fאו דוגמא, משקע BCIP / NBT מאוד מפותח יכול להסוות אותות צבע מהיר יותר. אחת דרכים לעקוף בעיה זו היא ללכוד תמונות באופן מיידי לאחר כל צביעה ולהסיר את משקע הצבע שימושי לפני הסיבוב הבא לאיתור. במקרה זה, צבע אזו אלכוהול מסיס במשקעים (אדום מהיר) וINT יוסרו על ידי שטיפות אתנול אחרי סיבובי הגילוי הראשונים והשני, בהתאמה, ומכתים BCIP / NBT מיושם כAP-המצע האחרון 26. אפשרות נוספת היא לנצל את תכונות ניאון של אזו צבעים. אדום מהיר ניתן דמיין באמצעות מסנן rhodamine קובע 27, בעוד כחול מהיר ניתן לצפות במסננים מרחיק אדומים 28,29. השוואה או כיסוי של תמונות chromogenic וניאון יכולה לחשוף את האתר של, פיתוח אות גישה זו distribution.Using-שיתוף BCIP / NBT יש ללהיפסק בזמן, כך שזה לא יהפוך לצפוף מדי ולהרוות את אות הניאון של צבע אזו מוצר תגובה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T.
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
