Summary
نحن تصف مولد اللون كله جبل في الموقع التهجين (MC-WISH) إجراء متعدد الاهداف في أجنة ذبابة الفاكهة سليمة مما يتيح كشف في وقت واحد ومحدد من ثلاثة أنماط توزيع مرنا مختلفة المتناقضة رواسب اللون.
Abstract
لتحليل الشبكات التنظيمية الجينات النشطة أثناء التطور الجنيني وتوالد فمن الضروري أن تحدد على وجه الدقة كيف يتم التعبير عن جينات مختلفة في العلاقة المكانية لبعضها البعض في الموقع. متعددة الهدف مولدات اللون كله يشن الموقع التهجين (MC-WISH) يسهل كثيرا من المقارنة الفورية من أنماط التعبير الجيني، كما أنه يسمح التصور مميزة من الأنواع مرنا مختلفة في الألوان المتناقضة في نفس العينة العينة في. وهذا يوفر إمكانية لربط مجالات التعبير الجيني الطوبوغرافي لبعضها البعض بدقة عالية وتحديد المواقع التعبير فريدة ومتداخلة. في بروتوكول المعروضة، وصفنا إجراء MC-WISH لمقارنة مرنا أنماط التعبير عن الجينات المختلفة في الأجنة ذبابة الفاكهة. ما يصل الى ثلاثة تحقيقات RNA، كل محددة لجين آخر وصفت من قبل ناشبة مختلفة، هي تهجين في الوقت نفسه إلى عينات الجنين والكشف في وقت لاحق من قبل القلويشمال شرق الفوسفاتيز المستندة المناعية اللونية. وترد تفاصيل الإجراء الموضح هنا لذبابة الفاكهة، ولكن يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع الأجنة الزرد.
Introduction
في الموقع التهجين (ISH) هو الأسلوب القياسي للكشف وتوطين النصوص RNA في سياق الصرفي، داخل الخلايا والأنسجة والكائنات الحية 1. الإشارات التي تنتجها الإجراء ISH وتصور عادة من قبل أنظمة الكشف المشعة، فلوري واللونية. في السنوات الأخيرة التقدم التكنولوجي الكبير في ISH الفلورسنت (FISH) 2 أدى إلى تحسن كبير الحساسية والدقة، والسماح للكشف وتحديد الكميات التعبير الحمض النووي الريبي في الخلايا واحدة ومستويات شبه الخلوية والتصور RNA تصل إلى جزيئات واحدة. بينما 3،4 وتستخدم أساليب FISH احد جزيء المتطورة لتطبيقات أكثر تخصصا، ISH مولد اللون على نطاق واسع باعتباره RNA روتيني في طريقة الكشف الموقعي في مجال البحث والتشخيص السريري. للكشف عن مولد اللون تستخدم تفاعلات إنزيم هطول الأمطار، والتي تولد منتجات مرئية في الألوان المتناقضة في المواقعالتهجين 5. وهذا له ميزة أن التصور RNA يمكن دمجها مع البقع النسيجية الروتينية والسياق الصرفي واضحة على الفور من قبل معيار brightfield المجهري. وعلاوة على ذلك، العديد من ركائز اللون تطبق إنتاج الرواسب، التي هي مستقرة في وسائل الإعلام تصاعد العضوية و / أو مائي، بحيث الاستعدادات عينة دائمة ويمكن الحصول على 5.
في ذبابة الفاكهة والبروتوكولات ISH الأولية طبقت تحقيقات المسمى النظائر المشعة للكشف عن نسخة على مواد مقطوع 6. في حين أنه من الصعب إعادة بناء من أقسام الأنسجة أنماط نسخة كاملة من الأجنة بأكملها أو أجهزة الجسم، وتطبيق إجراءات ISH اللونية مع تحقيقات المسمى غير بالإشعاع يجعل من الممكن عالميا لكشف توزيعات RNA في يتصاعد كلها 7. على الرغم من أن العديد من الاختلافات ISH مولد اللون موجودة، في نموذجية كله يشن الموقع التهجين (WISH) بروتوكولات HYB فيتم الكشف عن تحقيقات المسمى ناشبة ridized بواسطة أضداد ناشبة مترافق إلى إنزيم مراسل وتصور النصوص مرنا من قبل مولد اللون عجل.
لوحة من رواسب ألوان مختلفة التي تنتجها مراسل إنزيمات الفوسفاتيز القلوية (AP)، الفجل البيروكسيداز (POD)، وبيتا غالاكتوزيداز (غال) يسمح للكشف المميزة لأهداف متعددة في واحدة ونفس العينة 8-14. ومع ذلك، يستمر POD النشاط الأنزيمي فقط لفترة زمنية محدودة ورد فعل اللونية غال نوعا ما أقل حساسية، بحيث دون إضافية (tyramide) إشارة التضخيم 15 الكشف عن محاضر أقل وفيرة يمكن أن يكون تحديا مع هذه الإنزيمات. في المقابل، فإن النشاط الدائم من AP يسمح طويلة الأمد دوران الركيزة وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ولذلك، كشف متتابعة باستخدام AP مراسل الانزيم مع ركائز ألوان مختلفة وقد أثبتت نجاحا في فعالية وكشف المميز لمدة تصل إلى ثلاثة نصوص مختلفة في الأجنة واحدة 10-12،16.
لهذا متعدد الاهداف WISH اللونية (MC-WISH) طريقة (الشكل 1) 14، يتم إنشاء المسمى تحقيقات RNA العقاقير عن طريق النسخ في المختبر ووضع علامة مع واحدة من العلامات المتاحة ناشبة. الأجنة الفورمالديهايد الثابتة وpermeabilized عن طريق العلاج الميثانول وبروتين K الهضم. يتم تهجين الأجنة في وقت واحد خارج مع ما يصل الى ثلاثة وصفت مختلف تحقيقات RNA العقاقير كل محددة لجينة مختلفة. بعد إزالة التحقيق غير منضم من يغسل التشدد هو تصور كل التسمية ناشبة في جولة منفصلة من الكشف. وتتكون الجولة الكشف عن واحدة من الحضانة الأجنة مع الأجسام المضادة لمكافحة الناشبة بالإضافة إلى AP والتصور RNA من خلال تطبيق وAP-الركيزة التي تنتج اللون مستقرة راسب المترجمة. بعد الكشف عن الأجسام المضادة وتلطيخ، وتطبيق الضد-AP conjuتتم إزالة البوابة غسل انخفاض الرقم الهيدروجيني. في تجارب متعددة الألوان، كل جولة من كشف توظف الأجسام المضادة التي تستهدف مختلفة ناشبة التسمية وتصور كل نمط النص من قبل الركيزة لون مختلفة (الجدول 1). هي التي شنت الأجنة في الجلسرين وتصوير تحت المجهر المركب عالية الدقة باستخدام تدخل الفرق النقيض (DIC) البصريات.
Protocol
1. التعريف تحقيقات RNA عن طريق النسخ في المختبر
- تجميع في المختبر رد فعل النسخ في 1.5 مل microtube تحت ريبونوكلياز خالية من الشروط: 10.5 ميكرولتر المعالجة DEPC H 2 O، 4.0 ميكرولتر 5X العازلة النسخ، 1.0 ميكرولتر (1 ميكروغرام) خطي، المنقى قالب الحمض النووي في DEPC المعاملة H 2 O، 1.3 ميكرولتر NTP المزيج، 0.7 ميكرولتر المسمى ناشبة UTP، 0.5 ميكرولتر RiboLock RNA المانع، 2.0 ميكرولتر بوليميريز RNA.
ملاحظة: حجم رد الفعل النهائي هو 20 ميكرولتر. - اعتمادا على القالب تسلسل المروج استخدام T7، T3 أو SP6 بوليميريز RNA لالنسخ في المختبر (أنظر المرجع 17).
- حدد digoxigenin-11-UTP، البيوتين 16-UTP، أو فلوريسئين-12-UTP كتسمية للتحقيق RNA. لمزيد من التفاصيل، انظر مناقشة ناشبة العلامات وتركيزات التحقيق في مناقشة.
- مزيج رد فعل النسخ وتدور باستمرار قريبا.
- السماح نسخلمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية الدناز الأول لهذا رد فعل النسخ لإزالة قالب الحمض النووي، وتخلط جيدا، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C.
- ضبط مع المعالجة DEPC H 2 O حجم العينة 200 ميكرولتر.
- إضافة 100 ميكرولتر (0.5 المجلد) خلات 7.5 M الأمونيوم و 600 ميكرولتر (3 المجلد) الإيثانول لترسيب المسمى التحقيق RNA. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- لا تستخدم الإيثانول المثلج، لأن هذا قد يؤدي إلى هطول الأمطار غير المرغوب فيها من النيوكليوتيدات الفردية.
- تدور باستمرار الحمض النووي الريبي كتب في أجهزة الطرد المركزي التي تسيطر عليها درجة الحرارة في أقصى سرعة (20800 x ج) لمدة 30 دقيقة في +20 درجة مئوية. نضح بعناية طاف.
- غسل الناتجة بيليه مع 70٪ من الإيثانول في RT وأجهزة الطرد المركزي في 20800 x ج لمدة 10 دقيقة في +20 درجة مئوية.
- إزالة طاف ويجب الحرص على عدم نضح عن طريق الخطأ بيليه فضفاضة. السماح بيليه الهواء الجاف في microtube مع غطاء فتح لبضعة دقائق في RT.
- ديسحل بيليه الحصول عليها في 100 ميكرولتر من المعالجة DEPC H 2 O.
- إضافة 300 ميكرولتر قبل التهجين العازلة (50٪ المجلد / المجلد الفورماميد منزوع الأيونات، 5X SSC، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين الصوديوم والملح، 0.1٪ المجلد / المجلد توين-20، 5 ملغ / مل بالمستخفيات RNA) وتخزينها في -20 ° C . يمكن تحقيقات تكون طويلة الأجل المخزنة في -20 ° C.
ملاحظة: للحصول على أول اختبار للكتب حديثا التحقيق تمييع 3 ميكرولتر المسمى ناشبة RNA التحقيق في 100 ميكرولتر العازلة التهجين للحصول على التركيز النهائي للتجربة WISH.
2. تجهيز عينات الأجنة عن طريق إدراجات
ملاحظة: استخدام microtubes أو لوحات متعددة جيدا لمعالجة الأجنة من خلال الخطوات حضانة مختلفة تحمل خطر فقدان كميات كبيرة من الأجنة عن طريق الشفط قصد منهم خلال تبادل الحلول. لتجنب هذه الخسارة، فإنه قد يكون من المفيد استخدام سلال (مثل إدراج Netwell) لنقل العينات الجنين من خلال هذا الإجراء. هذه هي البوليسترين فيserts مع شبكة البوليستر في الجزء السفلي (الشكل 2A)، الذي الأجنة الراحة أثناء معالجة.
- لمعالجة الأجنة في إجراء WISH، تجميع تدرج في لوحة 12-جيدا (الشكل 2B) وإضافة 2 مل من حل مناسب لكل بئر.
- ماصة الأجنة في إدراج باستخدام طرف الأزرق. تأكد من أن جميع الأجنة وغرقت في السائل.
- عندما فترة حضانة هو أكثر مكان إدراج المحتوية على الجنين في لوحة أخرى 12-جيدا، وهي مليئة الحل للخطوة التالية.
- استخدام ناقلات ومقابض (الشكل 2C) لنقل ما يصل الى 12 عينة في كل مرة من حل واحد لآخر (الشكل 2D).
ملاحظة: لتقليل كميات المطلوبة، استخدم 2.0 مل microtubes للخطوات ما قبل التهجين / التهجين (انظر الخطوة 4.1) و24 لوحات جيدة لردود الفعل تلطيخ (STEP 6.2). يتم تنفيذ ردود فعل التهجين وتلطيخ في مجلدات من 1001؛ ل و 400 ميكرولتر، على التوالي.
- استخدام ناقلات ومقابض (الشكل 2C) لنقل ما يصل الى 12 عينة في كل مرة من حل واحد لآخر (الشكل 2D).
3. إعداد الأجنة لتهجين
- جمع وdechorionate، إصلاح، وdevitellinize أجنة باستخدام إجراءات موحدة 14،18. يتم تخزين الأجنة مستعدة بشكل روتيني في الميثانول في -20 ° C.
- نقل الأجنة لاستخدامها في التهجين في الموقع لRT وتوزيع في إدراج لوحة 12-جيدا مليئة 2 مل الميثانول لكل بئر.
- ترطيب الأجنة من خلال سلسلة الميثانول تناقص في RT. احتضان الأجنة في كل مرة لمدة 3 دقائق في: (أ) 75٪ الميثانول في برنامج تلفزيوني 1X (ب) 50٪ الميثانول في برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20 (ج) 25٪ الميثانول في برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20 (الرابع ) برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20 (V) برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20.
- قبل إصلاح الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 20 دقيقة في RT.
- إزالة تثبيتي بنسبة 4 يغسل لمدة 3 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20 في RT. وفي الوقت نفسه ذوبان الجليد وإعداد K بروتين والحلول الجلايسين العمل.
- وقف رد فعل من قبل اثنين من 1 دقيقة يشطف في 2 ملغ / مل الجلايسين في برنامج تلفزيوني 1X، توين-20 بنسبة 0.1٪ في RT.
- بعد إصلاح الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 20 دقيقة في RT.
- وفي وقت لاحق، وإزالة امتصاص العرق تثبيتي عن طريق غسل أربع مرات لمدة 3 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20 في RT.
- نقل الثابتة آخر الأجنة إلى ما قبل التهجين العازلة. متجر الأجنة في المخزن قبل التهجين في -20 ° C أو مباشرة المضي قدما مع التهجين من تحقيقات.
4. التهجين من المسابر
- ونقل الأجنة تخزينها في -20 ° C في مرحلة ما قبل التهجين عازلة لRT. توزيع الأجنة في المخزن قبل التهجين إلى 2.0 مل microtubوفاق.
- لمدة 30 دقيقة على الأقل، قبل هجن عينات الأجنة عند 65 درجة مئوية في المخزن قبل التهجين.
ملاحظة: للحصول على ما قبل التهجين والتهجين الخطوات التي تستخدم بالحمام المائي. خلال مرحلة ما قبل التهجين هناك متسع من الوقت لتحضير مزيج التحقيق عن طريق الجمع بين ما يصل إلى ثلاثة تحقيقات RNA العقاقير، كل محددة للنص الجينات المختلفة، والمسمى مع ناشبة مختلفة. - للحصول على مزيج التحقيق، إضافة الكميات المناسبة معا (عادة ما بين 1 ميكرولتر إلى 6 ميكرولتر) كل المطلوب المسمى ناشبة الأصلي العقاقير مسبار الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر العازلة التهجين (50٪ المجلد / المجلد الفورماميد منزوع الأيونات، 5X SSC، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين ملح الصوديوم، 0.1٪ المجلد / المجلد توين-20، 5 ملغ / مل بالمستخفيات RNA، 5٪ بالوزن / المجلد ديكستران كبريتات).
ملاحظة: إضافة كبريتات ديكستران اختيارية. - تفسد مزيج التحقيق العقاقير RNA في كتلة الحرارة على 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وفي وقت لاحق نقل مزيج التحقيق التشويه والتحريف مباشرة إلى 65 درجة مئوية.
- إزالة معظم ما قبل التهجينالعازلة من العينات الجنين وإضافة مزيج التحقيق التشويه والتحريف.
- السماح عينات الجنين هجن للتحقيق مزيج O / N عند 65 درجة مئوية.
وتستخدم درجات حرارة تتراوح بين 55 درجة مئوية و 65 درجة مئوية بشكل روتيني للتهجين، قبل وبعد التهجين الخطوات التالية: ملاحظة. التهجين عند 65 ° C يوفر الشروط الأكثر صرامة وينصح في حالة حدوث مشاكل الخلفية عند استخدام درجات حرارة منخفضة. إذا كان هناك أي مشاكل الخلفية، التهجين عند 55 ° C ينصح، التي تنص على الاستفادة من تعزيز قوة الإشارة وتحسين سلامة الجنين. - صباح اليوم التالي، ونقل أول الحلول غسل التقشف إلى 65 درجة مئوية، للتأكد من أنها يتم تسخينها إلى درجة حرارة الصحيح في الوقت المناسب.
- نقل التهجين مزيج التحقيق مع الأجنة من microtubes 2.0 مل إلى إدراج لوحة 12-جيدا تحتوي على 2 مل قبل تحسنت التهجين غسل العازلة (50٪ الفورماميد في 2 × SSC، 0.1٪ توين-20). وضع لوحة 12-جيدا تحتوي على معينات bryo في الفرن واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
- جنين بنقل العينات إلى 2 مل الجديد غسل العازلة التهجين واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- إزالة تحقيق فائض بنسبة 20 دقيقة يغسل عند 65 درجة مئوية، مرة واحدة في 2 × SSC، 0.1٪ توين-20 وثلاث مرات في 0.2 × SSC، 0.1٪ توين-20.
- نقل العينات الجنين لبرنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20 في RT.
- احتضان الأجنة في عرقلة العازلة (8٪ مصل الأغنام في برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين 20) لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT.
5. كشف الأجسام المضادة للتحقيقات ناشبة المسمى
ملاحظة: على النقيض من التهجين في وقت واحد من كل ثلاثة تحقيقات وصفت بشكل مختلف، يتم الكشف عن كل مسبار واحدا تلو الآخر في جولات منفصلة من الحضانة الضد وتلطيخ. لذلك، في كل جولة الكشف يستخدم الأجسام المضادة واحد فقط (إما لمكافحة digoxigenin-AP أو المضادة للفلوريسئين-AP أو المعادية للالبيوتين-AP).
- الاختيار بين STEP5.1.1 إلى 5.1.3 والمضي قدما في إعداد تخفيف الجسم المضاد المناسب وفقا لناشبة التسمية التي سيتم الكشف عنها.
ملاحظة: للكشف عن تسلسلي للتحقيقات وصفت بشكل مختلف، يتم تطبيق آخر لمكافحة ناشبة الأجسام المضادة في كل دورة الكشف.- للكشف عن التحقيق المسمى فلوريسئين تمييع لمكافحة فلوريسئين-AP تقارن 1: 4000 في عرقلة العازلة.
- للكشف عن التحقيق المسمى digoxigenin تمييع لمكافحة digoxigenin-AP تقارن 1: 4000 في عرقلة العازلة.
- للكشف عن التحقيق المسمى البيوتين إعداد حل المترافقة المعادية للالبيوتين-AP في 1: 4000 تخفيف في عرقلة العازلة.
- احتضان الأجنة في حل معاداة ناشبة-AP لمدة 3 إلى 4 ساعات المختارة في RT. بدلا من ذلك، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. لا تنطبق فقط الأجسام المضادة الثلاثة في وقت واحد.
- من أجل إزالة الأجسام المضادة غير منضم غسل الأجنة مع برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ توين-20 لمدة 4 مرات 15 دقيقة في RT.
- لتغيير الأنظمة العازلة كانح مرتين مدة 15 دقيقة في RT في TNT (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 0.1 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين-20).
6. الفوسفاتيز القلوية اللونية تلطيخ
- وبعد الكشف عن الأجسام المضادة الاختيار بين STEP 6.1.1 إلى 6.1.4 والمضي قدما واحدة من الفوسفاتيز القلوية ردود الفعل تلطيخ اللونية للحصول على إشارة اللون المطلوب (انظر الجدول 1). كل جولة من الكشف يتم تطبيق مختلف ردود الفعل الركيزة مولد اللون لتسليط الضوء على كل نمط النص في لون آخر.
- سريع الأحمر تلطيخ
- غسل الأجنة مرتين لمدة 15 دقيقة في TT8.2 (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2، 0.1٪ توين-20).
- في حين غسل الأجنة، وإعداد الوجبات حل تلطيخ الأحمر من الصيام الأحمر TR / NAMP الفوسفاتيز القلوية الركيزة أقراص تعيين.
- حل قرص عازلة من قرص المنصوص عليها في 1 مل من الماء المقطر ومزيج من قبل vortexing للحصول على 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2.
- إسقاط سريع الأحمر TR / NAMP قرص في استعداد Tالريس العازلة وحل من قبل vortexing للحصول على حل تلطيخ الأحمر السريع.
- واضح سريع حل تلطيخ الأحمر من الجسيمات غير حله من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون.
- سريع الأزرق تلطيخ
- غسل الأجنة مرتين لمدة 15 دقيقة في جديدة عازلة SB8.2 تلطيخ (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2، 0.1 M كلوريد الصوديوم، 0.05 M MgCl 2، 0.1٪ توين-20).
- في حين غسل الأجنة، وإعداد الوجبات حل تلطيخ الأزرق من 50 ملغ / مل الأزرق السريع BB (في DMF) و 50 ملغ / مل الفوسفات النفثول (في DMSO) حلول الأوراق المالية.
- طازجة إعداد سريع الأزرق BB الحل عند 0.5 ملغ / مل في SB8.2.
- طازجة إعداد محلول النفثول الفوسفات منفصلة عند 0.5 ملغ / مل في SB8.2.
- قطرة قطرة إضافة محلول النفثول الفوسفات مستعد في الزرقاء BB سريعة الحل تحت خلط مستمر مع دوامة. مما أدى إلى تركيز العمل النهائي هو 0.25 ملغ / مل لكل مكونات الركيزة.
ملاحظة: مختلف السريع الأزرق / النفثول phospمجموعات الكراهية تؤدي إلى ظلال الألوان المختلفة (انظر الجدول 1).
- BCIP / NBT تلطيخ
- غسل الأجنة مرتين لمدة 15 دقيقة في جديدة عازلة SB9.5 تلطيخ (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 9.5، 0.1 M كلوريد الصوديوم، 0.05 M MgCl 2، 0.1٪ توين-20).
- للإشارة اللونية purpleblue، وإعداد طازجة BCIP / NBT حل تلطيخ بإضافة الليفاميزول 1 ميكرولتر 3.5 ميكرولتر BCIP و 4.5 ميكرولتر NBT لكل مل من SB9.5 عازلة تلطيخ وتخلط جيدا.
- INT تلطيخ
- غسل الأجنة مرتين لمدة 15 دقيقة في جديدة عازلة SB9.5 تلطيخ.
- للإشارة اللونية yellowbrown، وإعداد طازجة INT حل تلطيخ بإضافة 1 ميكرولتر الليفاميزول، 5 ميكرولتر أرجواني-فوس و 5 ميكرولتر INT لكل مل من SB9.5 عازلة تلطيخ وتخلط جيدا.
ملاحظة: بدلا من استخدام 7.5 ميكرولتر / مل BCIP / INT جاهزة للاستخدام الحل تلطيخ.
- سريع الأحمر تلطيخ
- لعينات الجنين تلطيخ نقل رد فعللوحة 24-جيدا. احتضان كل عينة في 400 ميكرولتر من الحل تلطيخ المختار في الظلام.
- مراقبة أحيانا إشارة تنمية تحت stereomicroscope. وقف رد فعل تلطيخ عندما يتم الحصول على قوة الإشارة المطلوبة وقبل احظ إشارة خلفية كبيرة.
- لوقف رد فعل مولد اللون، ونقل الأجنة الملون إلى إدراج لوحة 12-جيدا تحتوي على 2 مل TNT لكل بئر. شطف الأجنة الملون مرتين في TNT.
- غسل الأجنة مرتين لمدة 10 دقيقة في 1 × PBS، 0.1٪ توين-20 في RT لإزالة الركيزة المتبقية.
7. جسم إزالة / الفوسفاتيز القلوية التعطيل
- إزالة الأجسام المضادة وتعطيل الفوسفاتيز القلوية التي كتبها حضانة في 2 مل من محلول منخفض توقف الرقم الهيدروجيني (0.1 M جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.2، 0.1٪ توين 20) لمدة 10 دقيقة في RT.
- شطف لمدة 1 دقيقة مع 2 مل من 1 × PBS، 0.1٪ توين-20 في RT.
- يغسل 3 مرات لمدة 3 دقائق في 1 × PBS، 0.1٪ توين-20 في RT.
8. الكشف الجولة الثانية
- للكشف عن نمط توزيع النص الثاني المضي قدما في الكشف عن الأجسام المضادة للتحقيقات المسمى ناشبة (STEP 5،1-5،4) باستخدام تقارن الضد-AP موجهة ضد ناشبة التسمية الثانية.
- أداء الفوسفاتيز القلوية تلطيخ مولد اللون (STEP 6،1-6،5) تطبيق مزيج الركيزة التي تنتج لون مغاير لتلك المستخدمة في الجولة الأولى كشف (للألوان المتاحة انظر الجدول 1).
- إزالة الثاني المترافقة الضد-AP كما هو موضح في الخطوة 7،1-7،3.
9. الثالث الكشف جولة
- من أجل الكشف عن نمط توزيع النص الثالث، والمضي قدما مع الكشف عن الأجسام المضادة للتحقيقات المسمى ناشبة (STEP 5،1-5،4) باستخدام الأجسام المضادة-AP تقارن محدد لثالث ناشبة التسمية.
- أداء الفوسفاتيز القلوية تلطيخ مولد اللون (STEP 6،1-6،5) تطبيق مزيج الركيزة التي لم تكن ا ف بإجتهد في الجولات كشف السابقة. اختيار رد الفعل مولد اللون الذي ينتج اللون يعجل من السهل تمييزها عن تلك السابقة جولتين الكشف (لاختيار اللون انظر الجدول 1).
10. تركيب والتصوير
- نقل الأجنة الملون بشكل صحيح إلى 30٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني واحتضان حتى تنقع أجنة كاملة في حل الجلسرين. يتم معايرتها بشكل جيد عندما تنزل الى القاع.
- ونقل الأجنة إلى 70٪ الجلسرين في H 2 O والسماح تتوازن في RT. ويمكن تخزين الأجنة الملون في 70٪ الجلسرين في 4 درجات مئوية.
- لتركيب، ماصة ملطخة الأجنة في 70٪ الجلسرين قطرة على شريحة كائن ودون لمس الفواصل لصقها على الشريحة (الشكل 3). تطبيق انزلاق الغطاء.
- عرض شنت الأجنة تحت المجهر تشريح. نقل زلة تغطية التطبيقية، بحيث الأجنة تدور في الاتجاه المطلوب.
- مراقبة بشكل صحيحالأجنة الموجهة بدقة عالية (20X، 40X الأهداف) تحت المجهر المركب مع التفاضلية البصريات التدخل التباين.
- التقاط الصور مع كاميرا رقمية ملونة وانقاذ على جهاز التخزين الرقمي.
Representative Results
بروتوكول صفها يسمح التصور في وقت واحد من أنماط نص متعددة في ألوان مختلفة. يوفر MC-WISH ميزة للمقارنة بشكل مباشر على أنماط التعبير عن جينات مختلفة في نفس الجنين. وكمثال على ذلك، وأنماط التعبير من الفتحات التنفسية فارغة (EMS) 19، فوشى tarazu (المنطقة الحرة برأس) 20 وقذرة تقرن 1 (slp1) 21 تتم مقارنة مباشرة في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأريمة الأجنة مرحلة وتصور في مجموعة متنوعة من ظلال اللون (الشكل 4) .
تتوفر للحصول على لوحة المتناقضة رواسب اللون (الجدول 1) مختلفة توليفات الركيزة AP. يعجل اللون الأحمر التي تنتجها سريع الأحمر ويعجل الأرجواني التي تنتجها BCIP / NBT يمكن تمييزها بسهولة وبالتالي يتم استخدام الأكثر شيوعالاي في التجارب اللونين (الشكل 4A). ومع ذلك، يمكن وصمة عار BCIP / NBT سرعان ما تتحول إلى اللون الداكن بدلا من ذلك، بحيث تكون مستترة اللون الأحمر السريع في حالة جزئي شارك في توزيع النصوص. ولذلك، فإن تطبيق الأزرق السريع يمكن أن يكون ميزة، الذي يولد الزرقاء، والمنتجات الخضراء والبنفسجي في تركيبة مع NAMP، NAGP وNABP، على التوالي (الجدول 1). مزيج من الأزرق سريع مع NAMP يعطي اللون الأزرق الفاتح الذي هو مميز بسهولة من المنتج الأحمر السريع في مجالات التعبير المجاورة أو المتداخلة كما هو موضح هنا لنظم الإدارة البيئية والمواقع التعبير slp1 تصور باللون الأحمر والأزرق، على التوالي (الشكل 4B). يوفر الأزرق NAGP سريع مزيج تباين قوي مماثل لوصمة عار الحمراء سريع، بحيث هو واضح في مجال نظم الإدارة البيئية الخضراء مميزة من موقع التعبير slp1 الأحمر (الشكل 4C). ومع ذلك، إذا نظم الإدارة البيئية والمواقع التعبير slp1 يتم التوقفtected التي كتبها سريع الأزرق NABP وسريع الأحمر، على التوالي، مما أدى البنفسجي ورواسب اللون الأحمر أقل ملحوظ (الشكل 4D). كما ذكر أعلاه، الوجبات الأحمر والأزرق سريع NAGP من السهل التمييز كما هو موضح من قبل slp1 والتعبير في المنطقة الحرة برأس الأحمر والأخضر، على التوالي (الشكل 4D).
MagentaPhos في تركيبة مع INT ينتج راسب أصفر، والذي يستخدم للكشف عن التعبير القطعي من المنطقة الحرة برأس (الشكل 4C، E). راسب أصفر اللون يولد النقيض جيدة لركائز باللون الأزرق كما يتضح من الكشف عن slp1 والمنطقة الحرة برأس مع سريع الأزرق NAMP وMAG / INT، على التوالي (الشكل 4E). ومع ذلك، فإن راسب أصفر هو ملحوظ أقل سهولة من المنتج أحمر سريع. الأصفر مجال التعبير الملون من EMS يمكن أن تكون بالكاد disti nguished من التعبير منقاري من slp1 هو مبين في الحمراء (الشكل 4F). ولذلك، فإن الجمع بين ركائز لون له أن يتم اختياره بعناية لكل تجربة.
الشكل 1. مخطط انسيابي لMC-WISH على سبيل التصور متعددة الالوان من ثلاثة أنماط نسخة فريدة من نوعها، اختيار بين مختلف تقارن الضد-AP وتركيبات الألوان الركيزة في كل دورة الكشف. الاختصارات: AP، الفوسفاتيز القلوية. BIO، البيوتين. DIG، digoxigenin. FLUO، فلوريسئين. لالاختصارات الأخرى ترى الأساطير إلى الشكل 4 والجدول 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ق / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg "/>
تستخدم الرقم 2. إدراج الناقلين الجنين. (A) إدراجات تركيبها في الجزء السفلي مع أغشية البوليستر 15 مم و 74 ميكرون حجم شبكة الناقلين الجنين ذبابة الفاكهة. يتم تجميعها (B) يدرج في لوحات 12-جيدا، والتي تعمل بوصفها صواني خزان للحلول المختلفة. (C) ناقلات المتاحة ومقابض تسمح تجهيز (D) 12 إدراج / عينات الجنين في وقت واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تصاعد الأجنة الملون. الأجنة هي التي شنت في قطرة من 70٪ الجلسرين بين أكوام من coverslips، التي تعمل والفواصل. تتحرك لطيف من التطبيقكذب ساترة كبيرة تساعد على تدوير الأجنة التي شنت في الاتجاه المطلوب للمراقبة والتصوير الفوتوغرافي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. وتظهر التصور متعدد الألوان من النصوص مرنا في أجنة ذبابة الفاكهة أمثلة من تجارب MC-WISH في أجنة ذبابة الفاكهة من وجهات النظر الجانبية. وتصور أنماط التعبير مرنا من الفتحات التنفسية فارغة (EMS)، فوشى tarazu (المنطقة الحرة برأس) وقذرة الموثوقة 1 (slp1) من قبل مختلف AP لون مجموعات الركيزة، التي أشارت في كل لوحة. تم الكشف عن النصوص التي كتبها (A) المنطقة الحرة برأس FLUO ونظم الإدارة البيئية DIG، (
| مزيج الركيزة | أضف إلى 1 مل AP العازلة | Concentraنشوئها [ميكروغرام / مل] | عازلة AP | اللون | حساسية إشارة |
| BCIP NBT | 3.5 ميكرولتر 4.5 ميكرولتر | 175 337،5 | SB9.5 | بنفسجي | +++ |
| MAG INT | 5 ميكرولتر 5 ميكرولتر | 250 250 | SB9.5 | أصفر | + |
| BCIP / INT حل الأوراق المالية | 7.5 ميكرولتر | 250 250 | SB9.5 | أصفر | + |
| سريع الأزرق NAMP | 5 ميكرولتر 5 ميكرولتر | 250 250 | SB8.2 | أزرق | ++ |
| سريع الأزرق NABP | 20 ميكرولتر 10 ميكرولتر | 1000 500 | SB8.2 | البنفسجي | ++ |
| سريع الأزرق NAGP | 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر | 500 500 | TT8.2 | أخضر | + |
| سريع الأحمر NAMP | 1 قرص | 1000 400 | TT8.2 | أحمر | ++ |
الجدول 1. مجموعات الركيزة المختصرات: +++ وقوية؛ ++ والمتوسطة. +، وضعف NBT، كلوريد 4-نيترو-الأزرق-نتروبلو. BCIP، 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات. INT، 2- (4-iodophenyl) -3- (4 nitrophenyl) -5-فينيل كلوريد نتروبلو. MAG، أرجواني-فوس، 5-برومو-6-كلورو-3-indolyl فوسفات، NAMP، نفثول-AS-MX-الفوسفات. NABP، نفثول-AS-BI-الفوسفات. NAGP، نفثول-AS-GR-الفوسفات. SB9.5، عازلة تلطيخ في درجة الحموضة 9.5. SB8.2، عازلة تلطيخ في درجة الحموضة 8.2. TT8.2، عازلة تريس، توين في درجة الحموضة 8.2.
Discussion
في الموقع التهجين (ISH) مع المسمى بالإشعاع تحقيقات الحمض النووي غالبا ما يستخدم للكشف عن توطين RNA على أقسام الأنسجة. طريقة ISH المشع، ومع ذلك، هو مضيعة للوقت، أقل حساسية، ولا يسمح التقدير كاملة أنماط توزيع نص في يتصاعد كلها. في المقابل، يسمح الموصوفة هنا طريقة MC-WISH المقارنة المباشرة لعدة مجالات التعبير الجيني في الألوان المتناقضة داخل أجنة سليمة. MC-WISH لديه ميزة هذا السياق النسيجي واضح على الفور وتصور ببساطة عن طريق معيار brightfield المجهري. وهذا يوفر إمكانية لربط مجالات التعبير الجيني الطوبوغرافي لبعضها البعض بدقة عالية وتحديد المواقع التعبير فريدة ومتداخلة بطريقة سريعة وموثوق بها. من ناحية أخرى، ISH الفلورسنت المضاعفة (FISH) هو أقوى فيما يتعلق الحساسية والدقة، ويفضل أن تستخدم، إذا الخلوية أو حتى إعادة الفرعية الخلويةمطلوب حل من الكشف مرنا.
طيف واسع من النصوص التي تم تعيينها من قبل MC-WISH تشير إلى أن تقريبا أي نص يمكن تحليل ليس فقط في الجنينية ولكن أيضا في الأنسجة اليرقات والكبار والأنواع الأخرى من ذبابة الفاكهة. وبالفعل، فإن الإجراء الموضح تفاصيلها هنا لذبابة الفاكهة، ويعمل بكفاءة بالمثل مع الأجنة الزرد 11،16،22. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف طريقة MC-WISH إلى مجموعة واسعة من اللافقاريات والفقاريات الأجنة وعينة الأنسجة.
التسميات ناشبة وتركيزات التحقيق
نحن نستخدم بشكل روتيني فلوريسئين، digoxigenin، والبيوتين كعناوين ناشبة تحقيقات RNA. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق تحقيقات المسمى نيتروفينول التي أدخلت في التجارب WISH الزرد 23-25. عرض تحقيقات المسمى فلوريسئين حساسية أقل بالمقارنة مع غيرها من العلامات ناشبة، لذلك يتم استخدام أفضل أن فلوريسئين وأو الكشف عن محاضر وفيرة. يتم اختبار كل مسبار كتب حديثا لأول مرة في تجربة WISH واحدة، حيث يتم تقييم أدائها إما باستخدام BCIP / NBT أو سريع الأحمر، والركيزة. ويعتبر تركيز التحقيق على النحو الأمثل عندما يتم التوصل إلى إشارة قوية بدون التنمية الخلفية داخل دقيقة لعدد قليل من ساعة.
للتأكد من أن مجالات التعبير عن الاهتمام وقد تم الكشف في الكامل مدى كتبها MC-WISH، فمن الضروري أن تصور كل نمط النص التي كتبها وحيد تسمية التجارب WISH باستخدام مزيج الركيزة الأكثر حساسية، BCIP / NBT. هذا يضمن أن مجالات التعبير ضعيفة لا يغفل في التجربة متعدد الاهداف. للتعويض عن حساسية أقل من تركيبات الركيزة الأخرى لا بد من استخدام الضعف (لثلاث مرات) تركيزات التحقيق بالمقارنة مع معيار BCIP / NBT تلطيخ.
انخفاض الرقم الهيدروجيني تعطيل
الخطوة تعطيل انخفاض الرقم الهيدروجيني يمكن أن يؤدي إلىالتفكك الجزئي من العقاقير المسمى ناشبة الهجينة RNA التحقيق / الشعور مرنا مما أدى إلى انخفاض الكشف عن إشارة في جولات تلطيخ الثانية والثالثة. لتقليل الخسائر في الحساسية، والخطوات تعطيل قصيرة قدر الإمكان. مررنا بها أن فترة حضانة 10 دقيقة في انخفاض الرقم الهيدروجيني يكفي للقضاء على AP-النشاط. يغسل سريعة لاحقة في كميات كبيرة تضمن التخفيف السريع من غير منضم تقارن الضد-AP وتمنع إعادة ملزم للتحقيقات haptenized. وتشمل الإجراءات البديلة تثبيت امتصاص العرق وتعطيل الحرارة. ومع ذلك، فإن بعض رواسب اللون لا حرارة مستقرة وامتصاص العرق التثبيت قد لا تكون كافية لتعطيل كامل للAP. تعطيل ناقصة من الأول التطبيقية الضد-AP المترافقة يمكن أن يؤدي إلى إعادة تصور نمط مرنا في الكشف التالية تؤدي الجولة إلى التداخل ايجابية كاذبة في التعبير مع الأنواع مرنا الثانية التي يتم الكشف عنها. لذلك، في تجربة السيطرة عشريتم تقسيم الأجنة ه إلى تيارين بعد تعطيل أول التطبيقية الضد-AP المترافقة. تم حذف الثاني المترافقة الضد-AP من الكسر السيطرة، وينبغي ألا تنتج إشارة في رد فعل اللون الثاني. ومع ذلك، إذا كان رد فعل اللون الثاني يولد نمط توزيع إشارة المقابلة لأول واحد، ثم كان الإجراء تعطيل يست فعالة. في هذه الحالة، يجب أن تطول فترة حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني الحل محطة للتجربة القادمة.
أوامر AP تطبيق الركيزة
منذ قطرات حساسية مع كل جولة لاحقة من الكشف، فإنه من المستحسن للكشف عن من mRNAs أقل وفرة قبل النصوص أكثر وفرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأحمر السريع والسريع تركيبات الركيزة الزرقاء هي أقل بكثير حساسية من purpleblue BCIP / NBT وصمة عار، بحيث يتم تطبيق الأصباغ سريع ويفضل في الجولة الأولى تلطيخ للكشف عن نسخة أعرب أقوى. هذا أيضا حكما ميزة أن BCIP لاحق / NBT تلطيخ يمكن رصدها، وتوقفت في الوقت المناسب قبل يحصل على إشارة purpleblue مظلمة للغاية فيما يتعلق أخف الأصباغ سريعة. وهكذا في تجربة اثنين من الألوان القياسية، لأول مرة يتم الكشف عن أعربت مرنا أقوى من قبل سريع الأحمر والثانية الأضعف واحدا تلو BCIP / NBT. كبديل لالأصباغ سريعة يمكن تطبيق الصفراء تركيبات INT الركيزة، ولكن الذي ينتج رواسب أن تصبح نشر بعد مرور بعض الوقت. لذلك يتم تطبيق BCIP / INT حصرا في تلطيخ الجولة الأخيرة. ونتيجة لذلك في تجربة ثلاثة ألوان نحن غالبا ما تستخدم سريع أولا الأحمر، BCIP الثاني / NBT (أو الأزرق السريع) والثالث مزيجا الركيزة INT. لاحظ أنه من المستحسن لتصوير الأجنة الملون في أقرب وقت ممكن عند تطبيق INT.
كشف الفلورسنت الأصباغ AZO
قد يكون من الصعب في بعض الأحيان إلى التعرف على الأنماط التعبير المتداخلة عندما قتامة لون راسب والتظليل واحدة أخف وزنا. Fأو سبيل المثال، وضعت بقوة BCIP / NBT راسب يمكن أن تخفي أخف إشارات صبغ سريع. طريقة واحدة للحصول على حل هذه المشكلة لالتقاط الصور على الفور بعد كل تلطيخ وإزالة اللون راسب التطبيقية قبل الجولة كشف المقبلة. في هذه الحالة، يتم إزالتها من الكحول للذوبان الأصباغ صبغ (سريع الأحمر) وINT رواسب من يغسل الايثانول بعد جولات الكشف الأولى والثانية على التوالي، ويطبق BCIP / NBT تلطيخ باعتبارها مشاركة AP-الركيزة 26. والاحتمال الآخر هو للاستفادة من خصائص الفلورية أصباغ الأزو. سريع الأحمر يمكن تصور استخدام فلتر رودامين يحدد 27، في حين الأزرق سريع يمكن ملاحظتها مع مرشحات الحمراء حتى 28،29. المقارنة أو تراكب الصور اللونية والفلورسنت يمكن أن تكشف عن موقع هذا النهج distribution.Using التعاون والتنمية إشارة BCIP / NBT لابد من توقف في الوقت المناسب، بحيث لا تصبح كثيفة جدا وتطفئ إشارة الفلورسنت من صبغ AZO ناتج التفاعل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolor whole-mount in situ hybridization. Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
