Summary
Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.
Abstract
Zu analysieren Genregulationsnetzwerken während der embryonalen Entwicklung und der Organogenese ist es wichtig, genau zu bestimmen, wie die verschiedenen Gene werden in räumlicher Beziehung zueinander in situ exprimiert aktiv. Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) erleichtert die sofortige Vergleich der Genexpressionsmuster, da es markante Darstellung der verschiedenen mRNA-Spezies in kontrastierenden Farben in der gleichen Probe Probe. Dies bietet die Möglichkeit, die Genexpression Domänen topographisch zueinander mit hoher Genauigkeit zu beziehen und um einzigartige und überlappenden Expressionsstellen definieren. In der vorgestellten Protokoll beschreiben wir eine MC-WISH Verfahren zum Vergleich der mRNA-Expressionsmuster verschiedener Gene in Drosophila-Embryos. Bis zu drei RNA-Sonden, die jeweils spezifisch für ein anderes Gen von einem anderen Hapten markiert ist, gleichzeitig hybridisierten, um den Embryo Proben und anschließend durch alkalische detektiertenne Phosphatase-basierten colorimetrischen Immunhistochemie. Die beschriebene Vorgehensweise ist hier für Drosophila beschrieben, funktioniert aber genauso gut mit Zebrafischembryonen.
Introduction
In situ-Hybridisierung (ISH) ist das Standardverfahren zur Detektion und Lokalisierung von RNA-Transkripten in morphologischer Zusammenhang innerhalb von Zellen, Geweben und Organismen. 1 Die von der ISH Verfahren erzeugten Signale werden häufig von radioaktiven, fluoreszierenden und chromogenen Detektionssysteme visualisiert. In den letzten Jahren erhebliche technologische Fortschritte in Fluoreszenz ISH (FISH) 2 führte dramatisch verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung, was den Nachweis und die Quantifizierung von RNA-Expression auf Einzelzell und subzellulären Ebenen und RNA Visualisierung bis zu einzelnen Molekülen 3,4 .While anspruchsvolle Einzelmolekül FISH Methoden für mehr spezialisierte Anwendungen verwendet werden, ist chromogenen ISH verbreitet als eine Routine-RNA in situ Nachweisverfahren in der Forschung und der klinischen Diagnostik. Für chromogenen Nachweisenzym Fällungsreaktionen verwendet werden, die sichtbare Produkte in kontrastierenden Farben an den Standorten zu generierenHybridisierungs 5. Dies hat den Vorteil, dass RNA Visualisierung kann mit Routine histologischen Färbungen und morphologischer Zusammenhang kombinierbar ist durch Standardhellfeldmikroskopie unmittelbar ersichtlich. Darüber hinaus sind zahlreiche der aufgetragenen Farbsubstraten Ausscheidungen, die in der organischen und / oder wässrigen Medien stabil sind Montage, so dass eine permanente Probenzubereitungen erhalten werden 5.
Bei Drosophila angewendet Anfangs ISH Protokolle Radioisotop markierten Sonden für Transkript Erkennung auf geschnittene Material 6. Während es schwierig ist, aus Gewebeschnitten rekonstruieren vollständige Transkript Muster der gesamten Embryos oder Organsysteme, das die Anwendung von chromogenen ISH Verfahren mit nicht-radioaktiv markierte Sonden ermöglicht es, global zu erfassen RNA Verteilungen in Voll Halterungen 7. Obwohl viele Variationen von chromogenen ISH vorhanden sind, in typischer ganze-mount in situ Hybridisierung (WISH) Protokolle hybridized haptenmarkierte Sonden durch Anti-Hapten-Antikörper mit einem Reporterenzym konjugiert ist und der mRNA-Transkripte werden durch ein Fällungs Chromogen visualisiert detektiert.
Die Palette von unterschiedlich gefärbten Niederschläge durch das Reportergen produzierten Enzyme alkalische Phosphatase (AP), Meerrettich-Peroxidase (POD) und beta-Galactosidase (GAL) ermöglicht die Unterscheidungs Nachweis mehrerer Ziele in ein und derselben Probe 8-14. Dauert jedoch POD enzymatische Aktivität nur für eine begrenzte Zeitdauer und die GAL kolorimetrischen Reaktion ist etwas weniger empfindlich ist, so dass ohne zusätzliche (Tyramid) Signalverstärkung 15 die Detektion von weniger häufigen Transkripte kann schwierig mit diesen Enzymen können. Im Gegensatz dazu die dauerhafte Aktivität von AP ermöglicht dauerhafte Substratumsatz und hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Daher Sequenzerkennung mit AP Reporter-Enzym mit unterschiedlich gefärbten Substrate in der effektiven bewährt undunverwechselbare Detektion von bis zu drei verschiedene Transkripte in einzelnen Embryonen 10-12,16.
Aus diesem Multi-Target-chromogenen WISH (MC-WISH) Methode (Abbildung 1) 14, werden markierte Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription erzeugt und mit einer der verfügbaren Hapten-Etiketten gekennzeichnet. Embryos sind Formaldehyd fixiert und durch Methanolbehandlung und Proteinase K Verdau permeabilisiert. Hybridisierung von Embryonen wird gleichzeitig mit bis zu drei unterschiedlich markierten Antisense-RNA-Sonden jeweils spezifisch für ein unterschiedliches Gen durchgeführt. Nach dem Entfernen der ungebundenen Sonde durch Stringenz Wäschen jeweils Hapten-Etikett wird in einem separaten Runde der Detektion visualisiert. Eine einzelne Erfassungs Runde besteht aus der Inkubation von Embryonen mit einem Anti-Hapten-Antikörpers an AP und RNA Visualisierung durch Anlegen eines AP-Substrat, das eine lokalisierte stabile Farb Präzipitat produziert gekoppelt. Nach der Antikörpererkennung und Färbung, die aufgetragene Antikörper-AP conjuGate wird durch einen niedrigen pH-Wäsche entfernt. Beim Mehrfarben Experimenten verwendet jede Runde der Detektion eines Antikörpers gegen ein anderes Hapten-Etikett gezielt und jedes Transkript Muster durch eine unterschiedliche Farbe Substrat (Tabelle 1) visualisiert. Die Embryonen werden in Glycerin montiert und unter einem hochauflösenden Mikroskop Verbindung mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik abgebildet.
Protocol
1. Markierung von RNA-Sonden durch in vitro Transkription
- Zusammenbau in vitro-Transkriptionsreaktion in einem 1,5 ml Mikroröhrchen unter RNase-freien Bedingungen: 10,5 & mgr; l DEPC-behandeltem H 2 O, 4,0 & mgr; l 5x Transkriptionspuffer, 1,0 ul (1 ug) linearisiert, gereinigtes DNA-Matrize in DEPC-behandeltem H 2 O, 1,3 ul NTP-Mix, 0,7 & mgr; Hapten-markiertes UTP, 0,5 ul RiboLock RNA-Inhibitor, 2,0 ul RNA-Polymerase.
Hinweis: Das endgültige Reaktionsvolumen beträgt 20 ul. - Je Promotorsequenz T7 Verwendung der Schablone, T3 oder SP6-RNA-Polymerase für die in vitro-Transkription (siehe Referenz 17).
- Wählen Digoxigenin-11-UTP, Biotin-16-UTP oder Fluorescein-12-UTP als Label für die RNA-Sonde. Für weitere Einzelheiten siehe die Diskussion der Hapten-Etiketten und Sondenkonzentrationen in der Diskussion.
- Mischen Sie Transkriptionsreaktion und Spin-down kurz.
- Lassen Sie transkribieren3 h bei 37 ° C.
- 1 & mgr; l RNase-freier DNase I auf die Transkriptionsreaktion zur Entfernung der Template-DNA, gut mischen, und Inkubation für 15 min bei 37 ° C.
- Passen Sie mit DEPC-behandeltem H 2 O das Probenvolumen zu 200 ul.
- 100 l (0,5 Vol) 7,5 M Ammoniumacetat und 600 & mgr; l (3 vol) Ethanol, um markierte RNA-Sonde auszufällen. Inkubation für 30 min bei RT.
- Verwenden Sie keine eiskaltem Ethanol, da dies zu unerwünschten Ausfällung von unincorporated Nukleotide führen.
- Zentrifugieren Sie das transkribierte RNA in einer temperaturgeregelten Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (20,800 · g) für 30 min bei +20 ° C. Sorgfältig absaugen Überstand.
- Waschen des resultierenden Pellets mit 70% Ethanol bei RT und Zentrifuge bei 20.800 × g für 10 min bei +20 ° C.
- Überstand entfernen und darauf achten, nicht versehentlich saugen Sie den losen Pellets. Lassen Pellet an der Luft trocknen in der Mikroröhrchen mit geöffneten Deckel für ein paar Minuten bei Raumtemperatur.
- Dislöse das erhaltene Pellet in 100 ul DEPC-behandeltem H 2 O.
- Fügen Sie 300 ul vorgeHybridisierungsPuffer (50% Vol / Vol deionisiertem Formamid, 5 × SSC, 50 ug / ml Heparin-Natriumsalz, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA) und bei -20 ° C . Sonden können langfristig bei -20 ° C gelagert werden.
Hinweis: Für einen ersten Test der neu transkribiert Sonde verdünnter 3 ul Hapten-markierten RNA-Sonde in 100 ul Hybridisierungspuffer, um die Endkonzentration für den WISH Experiment erhalten.
2. Verarbeitung der Embryo Proben unter Verwendung von Inserts
Hinweis: Mit Mikroröhrchen oder Multi-Well-Platten für die Verarbeitung von Embryonen durch die verschiedenen Inkubationsschritte trägt das Risiko des Verlustes signifikante Mengen von Embryonen, die durch während der Austausch von Lösungen versehentlich Absaugen von ihnen. Um diesen Verlust zu vermeiden, kann es hilfreich sein, Körbe (wie Netwell Einsätze) zur Durchführung Embryo Proben durch das Verfahren zu verwenden. Dies sind Polystyrol inInserts mit einem Polyestergitter am Boden (2A), an dem die Embryonen während der Bearbeitung ruhen.
- Für die Verarbeitung von Embryonen in der WISH Verfahren, montieren Sie die Einsätze in einer 12-Well-Platte (2B) und 2 ml der entsprechenden Lösung in jede Vertiefung.
- Pipettieren Sie die Embryonen in die Einsätze mit einer blauen Spitze. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen werden in Flüssigkeit eingetaucht.
- Wenn Inkubationszeit Bereich sich der Embryo-Inserts enthalten, die in einem anderen 12-Well-Platte, die mit der Lösung für die nächste Stufe gefüllt ist.
- Verwenden Sie Carrier und Griffe (2C), um von einer Lösung zu übertragen bis zu 12 Proben in einer Zeit, in eine andere (2D).
Hinweis: Um die erforderlichen Mengen zu reduzieren, verwenden Sie 2,0 ml Mikroröhrchen für die Vor-Hybridisierung / Hybridisierungsschritte (siehe Schritt 4.1) und 24-Well-Platten für die Färbung Reaktionen (STEP 6.2). Die Hybridisierung und Färbung Reaktionen werden in Mengen von 100 durchgeführt1; l und 400 & mgr; l auf.
- Verwenden Sie Carrier und Griffe (2C), um von einer Lösung zu übertragen bis zu 12 Proben in einer Zeit, in eine andere (2D).
3. Herstellung von Embryonen für die Hybridisierung
- Sammeln, dechorionate, zu beheben, und devitellinize Embryonen Verwendung von Standardverfahren 14,18. Die hergestellten Embryonen werden routinemäßig in Methanol bei -20 ° C gelagert.
- Transfer-Embryonen für die in situ Hybridisierung an RT verwendet werden, und in die Einsätze aus einem 12-Well-Platte mit 2 ml Methanol pro Vertiefung gefüllt zu verteilen.
- Rehydrieren Embryonen durch eine abnehmende Methanol-Serie bei RT. Inkubieren Embryonen jeweils für 3 min in: (i) 75% Methanol in 1x PBS (ii) 50% Methanol in 1 × PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% Methanol in 1 × PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% Tween-20.
- Pre-fix die Embryonen in 4% Paraformaldehyd in PBS 1x 20 min bei RT.
- Entfernen Sie die Fixiermittel von 4 Waschungen für 3 min in 1x PBS, 0,1% Tween-20 bei RT. Unterdessen tauen und bereiten Proteinase K und Glycin Arbeitslösungen.
- Die Reaktion durch zwei 1 min Spülungen in 2 mg / ml Glycin in 1x PBS, 0,1% Tween-20 bei RT.
- Post-fix die Embryonen in 4% Paraformaldehyd in PBS 1x 20 min bei RT.
- Anschließend entfernen Para Fixiermittel durch viermaliges Waschen für 3 Minuten in 1X PBS, 0,1% Tween-20 bei Raumtemperatur.
- Transfer nachfixiert Embryonen vor, eine Hybridisierungspuffer. Shop Embryonen in Pre-Hybridisierungspuffer bei -20 ° C oder direkt weiter mit Hybridisierung von Sonden.
4. Hybridisierung von Sonden
- Transfer-Embryonen bei -20 ° C in der Vor-Hybridisierungspuffer auf RT gelagert. Verteilen Embryonen in Pre-Hybridisierungspuffer in 2,0 ml microtubes.
- Für 30 min bei einem Minimum, pre-hybridisiert Embryo Proben bei 65 ° C in vorgeHybridisierungsPuffer.
Hinweis: Für die Vorhybridisierung und Hybridisierung Schritte a Wasserbad verwendet. Während Vorhybridisierung es Zeit ist, die Sondenmischung aus bis zu drei Antisense-RNA-Sonden, die jeweils spezifisch für ein unterschiedliches Gen-Transkript und mit einem anderen Hapten markierte vorzubereiten. - Um die Sondenmischung vollständig zu schneiden, zusammenpassenden Mengen (gewöhnlich zwischen 1 & mgr; l 6 & mgr; l) von jeder gewünschten Original Hapten-markierte Antisense-RNA-Sonde in 100 ul Hybridisierungspuffer (50% vol / vol entionisiertes Formamid, 5x SSC, 50 ug / ml Heparin-Natrium-Salz, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA, 5% Gewicht / Volumen Dextransulfat).
Anmerkung: Die Zugabe von Dextransulfat ist optional. - Denaturierung der Antisense-RNA Sonden-Mix in einem Heizblock bei 80 ° C für 5 min. Des denaturierten Sondengemisch anschließend direkt übertragen auf 65 ° C.
- Die meisten der Vorhybridisierung entfernenPuffer aus dem Embryo Proben und fügen Sie die denaturierte Sonde Mix.
- Lassen Embryo Proben hybridisieren Mix O / N-Sonde bei 65 ° C.
Anmerkung: Temperaturen zwischen 55 ° C und 65 ° C werden routinemäßig für die Hybridisierung, Pre- und Post-Hybridisierungsschritte verwendet. Hybridisierung bei 65 ° C liefert die meisten stringenten Bedingungen und wird im Fall von Hintergrundprobleme empfohlen, wenn niedrigere Temperaturen. Wenn es keine Hintergrundprobleme, die Hybridisierung bei 55 ° C empfohlen wird, was den Vorteil einer verbesserten Signalstärke und verbesserte Embryointegrität. - Am nächsten Morgen, zuerst die Stringenz Waschlösungen zu übertragen bis 65 ° C, um sicherzustellen, dass sie auf die richtige Temperatur in der Zeit erwärmt werden.
- Transfer Hybridisierungssonde Mix mit Embryonen von den 2,0 ml Mikroröhrchen in die Einsätze aus einem 12-Well-Platte mit 2 ml vorgewärmten Hybridisierungswaschpuffer (50% Formamid in 2 × SSC, 0,1% Tween-20). Legen Sie die 12-Well-Platte mit dem embryo Proben in einem Ofen und Inkubation für 20 min bei 65 ° C.
- Transfer-Embryo Proben 2 ml neuen Hybridisierungswaschpuffer und Inkubation für 20 min bei 65 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Entfernen der überschüssigen Sonde durch 20 minütiges Waschen bei 65 ° C, einmal in 2 × SSC, 0,1% Tween-20 und dreimal in 0,2 × SSC, 0,1% Tween-20.
- Übertragen Sie die Embryo Proben auf PBS, 0,1% Tween-20 bei RT 1x.
- Inkubieren der Embryonen in Blocking-Puffer (8% Schafserum in 1x PBS, 0,1% Tween-20) für mindestens 30 min bei RT.
5. Antikörper-Nachweis von Hapten-markierten Sonden
Anmerkung: Im Gegensatz zu der gleichzeitigen Hybridisierung aller drei unterschiedlich markierten Sonden wird jede Sonde detektiert nacheinander in separaten Runden der Antikörper-Inkubation und Färbung. Daher wird in jedem Erfassungsrunde nur ein Antikörper verwendet wird (entweder anti-Digoxigenin-AP oder Anti-Fluorescein-AP oder Anti-Biotin-AP).
- Wählen Sie zwischen STEP5.1.1 bis 5.1.3 und fahren Sie mit der Vorbereitung der entsprechenden Antikörperverdünnung nach dem Hapten-Label, das nachgewiesen werden soll.
Anmerkung: Für sequentielle Detektion der verschieden markierten Sonden wird eine weitere Anti-Hapten-Antikörper, der in jedem Erfassungszyklus aufgetragen.- Zur Erfassung eines Fluorescein-markierten Sonde verdünnter Anti-Fluorescein-AP-Konjugate 1: 4000 in Blockierungspuffer.
- Zum Nachweis einer mit Digoxigenin markierten Sonde verdünnter Anti-Digoxigenin-AP-Konjugate 1: 4000 in Blockierungspuffer.
- Zum Nachweis von Biotin-markierten Sonde herzustellen einen Anti-Biotin-AP-Konjugat-Lösung bei einer 1: 4000 Verdünnung in Blockierungspuffer.
- Inkubieren Embryonen in der gewählten anti-Hapten-AP-Lösung für 3 bis 4 h bei RT. Alternativ inkubieren O / N bei 4 ° C. Nicht alle drei Antikörper gleichzeitig anzuwenden.
- Um ungebundene Antikörper zu entfernen Waschen der Embryos mit 1x PBS, 0,1% Tween-20 für 4-mal 15 min bei RT.
- Um Puffersysteme zu ändern war,h zweimal 15 min bei RT in TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20).
6. Alkalische Phosphatase Chromogenic Färbung
- Im Anschluss an den Antikörpernachweis wählen zwischen STEP 6.1.1 bis 6.1.4 und fahren Sie mit einer der alkalische Phosphatase chromogene Färbung Reaktionen auf die gewünschte Farbsignal zu erhalten (siehe Tabelle 1). Für jede Runde des Detektions eine andere chromogene Substrat-Reaktion angewandt wird, um jedes Transkript-Muster in einer anderen Farbe zu markieren.
- Fast Red-Färbung
- Zweimal für 15 min in TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% Tween-20), waschen Embryonen.
- Beim Waschen Embryonen, bereiten Sie die Fast Red Färbelösung von der Fast Red TR / NAMP Alkaline Phosphatase Substrattabletten Set.
- Löse eine Puffertablette aus der Tablette in 1 ml destilliertem Wasser eingestellt und vortexen bis 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 erhalten.
- Werfen Sie einen Fast Red TR / NAMP Tablette in die vorbereitete Tris Puffer und lösen sich durch Vortexen, um die Fast Red-Färbung Lösung zu erhalten.
- Klare Fast Red Färbelösung von nichtgelösten Partikeln durch einen 0,2 & mgr; m Spritzenfilter filtriert.
- Schnell-Blau-Färbung
- Waschen Embryos zweimal für 15 Minuten in frischem SB8.2 Färbepuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, 0,1% Tween-20).
- Beim Waschen Embryonen, bereiten Sie die Fast Blue Färbelösung von 50 mg / ml Fast Blue BB (in DMF) und 50 mg / ml Naphtholphosphat (in DMSO) Stammlösungen.
- Frisch bereiten Fast Blue BB-Lösung bei 0,5 mg / ml in SB8.2.
- Frisch bereiten Sie eine separate naphthol Phosphatlösung bei 0,5 mg / ml in SB8.2.
- Tropfenweise hinzufügen, die vorbereitete naphthol Phosphatlösung in die Fast Blue BB-Lösung unter ständiger Durchmischung mit einem Wirbel. Die resultierende endgültige Arbeitskonzentration von 0,25 mg / ml für die beiden Substratkomponenten.
Hinweis: Verschiedene Fast Blue / naphthol phospHass Kombinationen zu verschiedenen Farbtönen (siehe Tabelle 1).
- BCIP / NBT-Färbung
- Waschen Embryos zweimal für 15 Minuten in frischem SB9.5 Färbepuffer (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, 0,1% Tween-20).
- Für eine purpleblue chromogenen Signals, frisch vorbereiten BCIP / NBT-Färbung Lösung durch Zugabe von 1 ul Levamisol, 3,5 ul BCIP und 4,5 ul NBT pro ml SB9.5 Färbepuffer und gut mischen.
- INT Färbung
- Zweimal für 15 Minuten in frischem SB9.5 Färbepuffer Waschen Sie die Embryonen.
- Für eine gelbbraun chromogenen Signals, frisch vorbereiten INT Färbungslösung durch Zugabe von 1 & mgr; l Levamisol, 5 ul Magenta-Phos und 5 ul INT pro ml SB9.5 Färbepuffer und gut mischen.
Hinweis: Alternativ können Sie 7,5 ul / ml BCIP / INT ready-to-use-Färbelösung.
- Fast Red-Färbung
- Für die Farbreaktion Transfer-Embryo Probenauf eine 24-Well-Platte. Inkubieren jeder Probe in 400 ul des ausgewählten Färbungslösung im Dunkeln.
- Überwachen Sie gelegentlich Signalentwicklung unter einem Stereomikroskop. Stoppen Sie die Farbreaktion, wenn die gewünschte Signalstärke erreicht ist und bevor eine signifikante Hintergrundsignal beobachtet wird.
- Um die Farbreaktion zu stoppen, zu übertragen gefärbten Embryonen in Einsätzen aus einem 12-Well-Platte mit 2 ml TNT pro Vertiefung. Zweimal spülen Sie den gefärbten Embryonen in TNT.
- Zweimal Waschen Sie die Embryonen für 10 Minuten in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bei RT an Restsubstrat zu entfernen.
7. Antikörperentfernung / Alkalische Phosphatase-Inaktivierung
- Entfernen Antikörper und Inaktivierung der alkalischen Phosphatase durch Inkubation in 2 ml niedrigen pH-Stopplösung (0,1 M Glycin-HCl pH 2,2, 0,1% Tween-20) für 10 min bei RT.
- Spülen für 1 Minute mit 2 ml 1 × PBS, 0,1% Tween-20 bei Raumtemperatur.
- 3x waschen für 3 Minuten in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bei Raumtemperatur.
8. zweiten Erfassungs Runde
- Um das Verteilungsmuster eines zweiten Transkripts erkennen füllen Antikörper-Nachweis von Hapten-markierten Sonden (Schritt 5.1 bis 5.4) unter Verwendung von Antikörper-AP-Konjugate gegen das zweite Hapten Zeichens ausgerichtet.
- Zuführen chromogenen alkalische Phosphatase-Färbung (SCHRITT 6.1 bis 6.5) Aufbringen einer Substrat-Kombination, die eine Kontrastfarbe zu der in dem ersten Erfassungsrunde verwendet wird, erzeugt (Farbauswahl siehe Tabelle 1).
- Entfernen zweiten Antikörper-AP-Konjugat, wie in STEP 7.1 bis 7.3 beschrieben.
9. dritte Erfassungs Runde
- Um das Verteilungsmuster eines dritten Transkripts erkennt, gehen mit Antikörper-Nachweis von Hapten-markierten Sonden (Schritt 5.1 bis 5.4) unter Verwendung von Antikörper-AP-Konjugate, die für das dritte Hapten-Markierung.
- Zuführen chromogenen alkalische Phosphatase-Färbung (SCHRITT 6.1 bis 6.5) Aufbringen einer Substrat-Kombination, die keine AP warin den vorherigen Runden Erkennung versorgt. Wählen Sie eine Farbreaktion, die eine Farbe zu fällen leicht von denen der vorangegangenen zwei Detektionsrunden unterscheiden produziert (für Farbenwahl siehe Tabelle 1).
10. Montage und Imaging
- Übertragung richtig gefärbten Embryonen bis 30% Glycerin in PBS und Inkubation bis Embryonen sind vollständig in die Glycerinlösung eingetaucht. Sie sind gut ins Gleichgewicht gebracht, wenn sie auf den Boden sinken.
- Transferembryos bis 70% Glycerin in H 2 O und equilibrieren lassen bei RT. Die gefärbten Embryonen können in 70% Glyzerin bei 4 ° C gelagert werden.
- Für die Befestigung, Pipetten gefärbten Embryonen in einer 70% Glycerin Tröpfchens auf einem Objektträger und ohne Berührung der Abstandshalter mit dem Schlitten (3) aufgeklebt. Wenden Sie das Deckglas.
- Montiert anzeigen Embryonen unter einem Binokular. Bewegen Sie das Deckglas aufgebracht, so dass die Embryonen zu drehen, um die gewünschte Ausrichtung.
- Richtig beobachtenorientierte Embryonen bei hoher Auflösung (20X, 40X Ziele) im Rahmen eines zusammengesetzten Mikroskop mit Differentieller Interferenzkontrast-Optik.
- Machen Sie Bilder mit einer digitalen Farbkamera und sparen Sie die digitale Speichereinheit.
Representative Results
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Darstellung mehrerer Transkript Muster in verschiedenen Farben. MC-WISH hat den Vorteil, direkt zu vergleichen die Expressionsmuster verschiedener Gene in der gleichen Embryos. Als ein Beispiel, die Expressionsmuster von leeren Stigmen (ems) 19, fushi tarazu (FTZ) 20 und schlampig gepaart 1 (slp1) 21 werden direkt in Drosophila melanogaster Blastodermstadium Embryonen verglichen und in einer Vielzahl von Farbnuancen sichtbar gemacht (Abbildung 4) .
Verschiedene AP-Substrat-Kombinationen stehen zur Verfügung, um eine Platte von den Vereinsfarben Niederschläge (Tabelle 1) zu erhalten. Die von Fast Red und dem von BCIP / NBT produziert lila Niederschlag produziert rote Farbe Niederschlag kann leicht unterschieden werden und werden daher verwendet häufigstenly in Zweifarbenexperimenten (4A). Allerdings kann die BCIP / NBT-Färbung schnell in eine eher dunkle Farbe zu drehen, so dass der Fast Red Farbe wird bei Teil Co-Verteilung der Transkripte verkleidet. Daher kann die Anwendung von Fast Blue von Vorteil, die blau, grün und violett Produkte in Kombination mit NAMP, NAGP und NABP (Tabelle 1) erzeugt. Die Kombination von Fast Blue mit NAMP gibt eine hellblaue Farbe, die von der Fast Red Produkt in benachbarten oder überlappenden Expressionsdomänen leicht erkennbar ist, wie hier für ems und slp1 Expressionsstellen in rot und blau, jeweils visualisiert (4B) gezeigt. Die Fast Blue NAGP Kombination bietet eine ähnliche starke Gegensatz zum Fast Red-Färbung, so dass die grüne ems Domain ist klar von der markanten roten slp1 Expressionsstelle (4C). Allerdings, wenn ems und slp1 Expressionsstellen sind dedurch Fast Blue NABP und Fast Red geschützt jeweils die resultierende violette und rote Farbe Niederschläge sind weniger wahrnehmbar (4D). Wie oben erwähnt, Fast Red und Fast Blue NAGP sind leicht zu unterscheiden, wie durch slp1 und FTZ-Expression in rot und grün, jeweils (4D) gezeigt.
MagentaPhos in Kombination mit INT erzeugt ein gelber Niederschlag, der verwendet wird, um die segmentale Expression FTZ (4C, E) offenbaren. Die gelbe Niederschlag erzeugt guten Kontrast zu den blau gefärbten Substraten, wie durch den Nachweis von slp1 und FTZ mit Fast Blue NAMP und MAG / INT bzw. (4E) veranschaulicht. Ist der gelbe Niederschlag jedoch weniger leicht erkennbar aus der Fast Red Produkt. Die gelb gefärbten Ausdruck Domäne von ems kaum disti sein von der rostral Ausdruck slp1 in rot (4F) gezeigt nguished. Daher weist die Kombination aus Farbe Substrate sorgfältig für jedes Experiment ausgewählt werden.
Abbildung 1. Flussdiagramm der MC-WISH. Für mehrfarbige Darstellung von drei einzigartigen Transkript Mustern, zwischen verschiedenen Antikörper-AP-Konjugate und Farbe Substrat-Kombinationen in jedem Erfassungszyklus zu wählen. Abkürzungen: AP, alkalische Phosphatase; BIO, Biotin; DIG, Digoxigenin; FLUO, Fluorescein. Für anderer Abkürzungen siehe Legenden auf Figur 4 und Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Einsätze als Embryo Träger. (A) Einsätze an der Unterseite mit Polyestermembranen von 15 mm Durchmesser und 74 um Maschenweite ausgestattet sind, wie Drosophila-Embryo Träger verwendet. (B) Die Einsätze werden in 12-Well-Platten, die als Vorratsfächern für die verschiedenen Lösungen funktionieren montiert. (C) erhältlich Träger und Griffe ermöglichen die Verarbeitung von (D) 12 Einsätze / Embryo Proben gleichzeitig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Montage von gefärbten Embryonen. Die Embryonen werden in einen Tropfen von 70% igem Glycerin zwischen zwei Stapel von Deckplättchen, die als Abstandshalter fungieren montiert. Sanfte Bewegung des Applogen großen Deckglas hilft, die montiert Embryonen in die gewünschte Ausrichtung für die Beobachtung und Fotografie zu drehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Multicolor Visualisierung der mRNA-Transkripte in Drosophila-Embryos. Beispiele für MC-WISH Versuche in Drosophila Embryonen von Seitenansichten gezeigt. Die mRNA-Expressionsmuster von leeren Stigmen (ems), fushi tarazu (FTZ) und schlampig gepaarten 1 (slp1) werden durch unterschiedliche Farb AP Substrat-Kombinationen, die auf jeder Platte angegeben werden visualisiert. Transkripte wurden durch (A) FTZ FLUO und ems DIG, (detektiert
| Substrat-Kombination | In den 1 ml AP-Puffer | Concentration [pg / ml] | AP-Puffer | Farbe | Signalempfindlichkeit |
| BCIP NBT | 3,5 & mgr; l 4,5 & mgr; | 175 337,5 | SB9.5 | lila | +++ |
| MAG INT | 5 ul 5 ul | 250 250 | SB9.5 | gelb | + |
| BCIP / INT-Stammlösung | 7,5 ul | 250 250 | SB9.5 | gelb | + |
| Fast Blue NAMP | 5 ul 5 ul | 250 250 | SB8.2 | blau | ++ |
| Fast Blue NABP | 20 & mgr; l 10 & mgr; | 1.000 500 | SB8.2 | violett | ++ |
| Fast Blue NAGP | 10 & mgr; l 10 & mgr; | 500 500 | TT8.2 | grün | + |
| Fast Red NAMP | 1 Tablette | 1.000 400 | TT8.2 | rot | ++ |
Tabelle 1 Substrat-Kombinationen Abkürzungen: +++, stark;. ++, Medium; +, Schwache NBT, 4-Nitro-blau-Tetrazoliumchlorid; BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat; INT, 2- (4-Jodphenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-tetrazoliumchlorid; MAG, Magenta-Phos, 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-phosphat, NAMP, Naphthol-AS-MX-Phosphat; NABP, Naphthol-AS-BI-Phosphat; NAGP, Naphthol-AS-GR-Phosphat; SB9.5, Färbung bei pH 9,5; SB8.2, Färbung bei pH 8,2; TT8.2, Tris-Tween-Puffer bei pH 8,2.
Discussion
In situ-Hybridisierung (ISH) mit radioaktiv markierten Nukleinsäuresonden wird oft verwendet, um die Lokalisierung von RNA an Gewebeschnitten zu detektieren. Die radioaktiven ISH-Verfahren ist jedoch zeitaufwendig, weniger empfindlich, und nicht Aufwertung komplette Transkript Verteilungsmuster ganz-Halterungen ermöglichen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier beschriebene MC-WISH Verfahren den direkten Vergleich der multiplen Genexpression Domänen in kontrastierenden Farben in intakten Embryonen. MC-WISH hat den Vorteil, dass die histologische Kontext sofort ersichtlich und einfach durch Standard-Hellfeldmikroskopie visualisiert. Dies bietet die Möglichkeit, die Genexpression Domänen topographisch zueinander mit hoher Genauigkeit zu beziehen und festlegen einzigartige und überlappenden Expressionsstellen in einer schnellen und zuverlässigen Art und Weise. Auf der anderen Seite, ist Multiplex-Fluoreszenz ISH (FISH) leistungsfähiger in Bezug auf Empfindlichkeit und Auflösung und wird bevorzugt verwendet, wenn zelluläre oder subzelluläre WiederLösung von mRNA-Nachweis erforderlich ist.
Das breite Spektrum von Transkripten, die durch MC-WISH kartiert wurde legt nahe, dass praktisch jedes Transkript kann nicht nur in der embryonalen als auch in Larven und erwachsene Gewebe und in anderen als Drosophila-Arten analysiert werden. Tatsächlich ist die beschriebene Vorgehensweise für Drosophila hier detailliert, funktioniert ähnlich effizient mit Zebrafischembryonen 11,16,22. Darüber hinaus kann der MC-WISH Methode, um eine Vielzahl von Wirbellosen und Wirbeltierembryonen und Gewebeprobe angepasst werden.
Hapten-Etiketten und Sondenkonzentrationen
Wir verwenden routinemäßig Fluorescein, Digoxigenin und Biotin als Hapten-Markierungen von RNA-Sonden. Außerdem Dinitrophenol-markierte Sonden können verwendet werden, die im Zebrafisch WISH Experimente 23-25 eingeführt wurden. Fluorescein-markierten Sonden zeigen eine geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu den anderen Hapten-Etiketten, so dass Fluorescein wird am besten verwendet foder den Nachweis von reichlich vorhandenen Transkripte. Jeder neu transkribierten Sonde wird zunächst in einem einzigen WISH Versuchs, in dem seine Leistung wird entweder unter Verwendung von BCIP / NBT oder Fast Red als Substrat bewertet getestet. Eine Sonde Konzentration wird als optimal betrachtet werden, wenn ein starkes Signal, ohne Hintergrundentwicklung wird im Minuten bis wenigen Stunden erreicht.
Um sicherzustellen, dass die Expressionsdomänen von Interesse haben, in vollem Umfang von MC-WISH erfasst wurde, ist es wichtig, jedes Transkript Muster von einzelnen Bezeichnung WISH Experimente unter Verwendung der empfindlichsten Substrat-Kombination, BCIP / NBT zu visualisieren. Dies stellt sicher, dass eine schwache Expression Domänen sind nicht in der Multi-Target-Experiment übersehen. Um sich für die geringere Empfindlichkeit der anderen Substrat-Kombinationen zu kompensieren ist es wichtig, verdoppelt Gebrauch (bis zu verdreifacht) Sondenkonzentrationen im Vergleich zu Standard-BCIP / NBT-Färbung.
Niedrigen pH-Inaktivierung
Der niedrige pH Inaktivierungsschritt kann dazu führen,partielle Auflösung der Antisense haptenmarkierte RNA Sonde / Sense-mRNA-Hybride, was zu reduzierten Signalerfassung in dem zweiten und dritten Färbung Runden. Zu einem Verlust der Empfindlichkeit zu minimieren, sind die Inaktivierungsschritte so kurz wie möglich. Wir erlebten, dass ein 10 Minuten Inkubationszeit bei niedrigem pH-Wert reicht für Beseitigung der AP-Aktivität. Die anschließenden schnellen Waschungen in großen Stückzahlen sorgen für eine schnelle Verdünnung der ungebundenen Antikörper-AP-Konjugate und re-Bindung an die haptenisierte Sonden zu verhindern. Alternative Verfahren umfassen Para Fixierung und Hitze-Inaktivierung. Allerdings sind einige der Farb Niederschläge sind nicht hitzestabil und Paraformaldehyd Fixierung kann nicht ausreichend für die vollständige Inaktivierung der AP ist. Unvollständigen Inaktivierung der ersten aufgebrachten Antikörper-AP-Konjugat kann neu Visualisierung der mRNA-Muster in der folgenden Erkennungsrunde zu falsch positiven Überdeckung führt im Ausdruck mit der zweiten mRNA-Spezies zu erfassende führen. Daher wird in einem Kontrollexperiment the Embryonen nach der Inaktivierung der ersten aufgebrachten Antikörper-AP-Konjugat in zwei Fraktionen aufgeteilt. Der zweite Antikörper-AP-Konjugat wird von dem Kontrollfraktion weggelassen und sollte ein Signal in dem zweiten Farbreaktion nicht zu erzeugen. Wenn die zweite Farbreaktion erzeugt eine Signalverteilungsmuster entsprechend dem ersten, dann war jedoch die Inaktivierungsverfahren nicht effizient. In diesem Fall sollte die Inkubationszeit in niedrigen pH-Stop-Lösung für den nächsten Versuch verlängert werden.
Bestellungen von AP-Substrat-Anwendung
Da die Empfindlichkeit sinkt mit jeder weiteren Runde der Erkennung, ist es ratsam, weniger reichlich mRNAs vor reichlicher Transkripte nachzuweisen. Darüber hinaus ist die Fast Red und Fast Blue Substratkombinationen wesentlich weniger empfindlich als die purpleblue BCIP / NBT-Färbung, so dass schnelle Farbstoffe werden vorzugsweise in der ersten Runde Färbung zum Nachweis der stärker exprimiert Transkript aufgetragen. Dies auch hals Vorteil, dass anschließende BCIP / NBT-Färbung überwacht und gestoppt rechtzeitig vor purpleblue Signal wird zu dunkel im Hinblick auf die leichtere schnelle Farbstoffe werden. So ist in einer Standard-Zweifarbenexperiment erste desto stärker exprimierten mRNA wird von Fast Red erkannt und zweiten der Schwächere von BCIP / NBT. Als Alternative, um die schnelle Farbstoffe die gelben INT Substrat-Kombinationen angewendet werden können, die jedoch Präzipitate werden, nachdem einige Zeit diffundieren zu erzeugen. Daher BCIP / INT wird ausschließlich in der letzten Runde Färbung aufgetragen. Somit in einer Drei-Farben-Experiment, das wir verwenden oft ersten Fast Red, zweiten BCIP / NBT (oder Fast Blue) und der dritte ein INT-Substrat-Kombination. Man beachte, dass es ratsam ist, um Bunt Embryonen so schnell wie möglich zu fotografieren beim Aufbringen INT.
Fluoreszenzdetektion von Azofarbstoffen
Es kann manchmal schwierig sein, sich überlappenden Expressionsmuster zu erkennen, wenn eine dunklere Farbe Niederschlag wird Spiegeln einer leichteren. Foder kann beispielsweise ein stark entwickelt BCIP / NBT Niederschlag leichter Schnelle Farbsignale zu maskieren. Eine Möglichkeit, um dieses Problem zu erhalten ist, Bilder nach jeder Färbung sofort erfassen und entfernen Sie das angewandte Farbniederschlag vor der nächsten Erkennung Runde. In diesem Fall sind alkohollösliche Azofarbstoff (Fast Red) und INT Niederschläge mit Ethanol wäscht, nachdem die ersten und zweiten Erfassungs Runden entfernt sind und BCIP / NBT-Färbung wird als letzter AP-Substrat 26 aufgebracht. Eine andere Möglichkeit ist, den Vorteil der Fluoreszenz-Eigenschaften von Azofarbstoffen zu nehmen. Fast Red kann mit Rhodamin-Filter visualisiert setzt 27 werden, während Fast Blue kann mit weit Rotfilter 28,29 beobachtet werden. Vergleichs- bzw. Überlagerung von chromogenen und Fluoreszenzbilder kann die Seite des Zusammen distribution.Using dieses Ansatzes BCIP / NBT Signalentwicklungs offenbaren muss rechtzeitig gestoppt werden kann, so dass es nicht zu dicht werden und Quench des Fluoreszenzsignals des Azofarbstoffes Reaktionsprodukt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
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