Summary
우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.
Abstract
배아 발달하고 정확하게 상이한 유전자 시츄 서로 공간적 관계로 표현하는 방법을 정의하는 것이 필수적이다 형성기 중에 활성 유전자 조절 네트워크를 분석. 멀티 타겟 발색 전체 마운트 계내 혼성화 (MC-WISH)가 동일한 샘플 표본에 색 대조 상이한 mRNA의 종 특유의 시각화를 허용하기 때문에 크게 유전자 발현 패턴의 인스턴트 비교를 용이하게한다. 이는 가능성이 높은 정확도로 서로에 대해 지형적 유전자 발현 도메인을 관련시키는 독특한 발현과 겹치는 위치를 정의하기 위해 제공한다. 제시된 프로토콜에서는 초파리 배아에서 다른 유전자의 mRNA 발현 패턴을 비교하기 위해 MC-WISH 절차를 설명한다. 세 RNA 프로브, 각각 다른 유전자에 특이하고 다른 합텐으로 표시까지, 배아 샘플에 동시에 혼성이어서 알칼리에 의해 감지북동 비색 면역 조직 화학 염색을 포스 파타 아제는 기반. 설명 절차는 여기에 초파리에 대한 자세한하지만, 제브라 피쉬의 배아와 동일하게 작동합니다.
Introduction
현장 하이브리드 (ISH)에서 세포, 조직 및 생물 (1) 내의 형태 학적 맥락에서 감지 및 RNA 전 사체의 현지화에 대한 표준 방법입니다. ISH 절차에 의해 생성 된 신호는 일반적으로, 형광 및 발색 방사성 검출 시스템에 의해 가시화된다. 최근에는 형광 ISH에 상당한 기술적 진보 (물고기)의 2는 단일 분자 3,4 .WHILE까지 단일 셀 및 하위 세포 수준과 RNA를 시각화의 검출 및 RNA 발현의 정량을 허용 크게 향상 감도와 해상도를 결과 정교한 단일 분자 FISH 방법은보다 전문적인 응용 프로그램에 사용되는, 발색 ISH 연구 및 임상 진단의 현장 검출 방법의 일상적인 RNA로 널리 퍼져있다. 발색 검출을 위해 효소 침전 반응은 사이트에서 색상을 대조에 표시 제품을 생성하는 데 사용됩니다하이브리드 5. 이것은 RNA 시각화는 루틴 조직학 얼룩 및 형태학 컨텍스트와 결합 될 수있는 이점이 표준 명 시야 현미경으로 즉시 분명 갖는다. 또한,인가 색 기판은 다수의 영구 샘플 제제 5 얻어 지도록, 유기 및 / 또는 수성 매질에서 안정한 장착되어 석출물을 생성한다.
초파리에서 초기 ISH 프로토콜은 단면 한 재료 (6)에 성적 증명서 검출을 위해 방사성 동위 원소 표지 된 프로브를 적용했다. 이 조직 절편에서 전체 배아 또는 기관 시스템의 전체 전사 패턴을 재구성하는 것은 곤란하지만, 비 - 방사능 표지 된 프로브와 발색 ISH 절차의 적용은 가능한 전체 마운트 7 RNA 분포를 검출 전체적으로 할 수있다. 발색 ISH의 많은 변형이 존재하지만, 일반적인에서 현장 하이브리드 (위시) 프로토콜 HYB에서 전체 마운트ridized 합텐 표지 프로브는 항 합텐 항체 기자 효소에 결합하고 mRNA의 성적이 침전 발색에 의해 시각화에 의해 감지됩니다.
기자에 의해 생산 다르게 색 침전물의 팔레트는 알칼리성 포스파타제 (AP), 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (POD) 및 베타 - 갈 락토시다 (GAL) 하나에서 여러 대상의 특징 검출과 동일한 샘플 8-14을 허용 효소. 그러나, POD 효소 활성은 제한된 시간 기간 동안 지속하고 추가 (tyramide)는 신호 증폭 15 덜 풍부한 사체의 검출이 효소 어려울 수없이되도록 GAL 비색 반응은 다소 덜 민감하다. 이와는 대조적으로, AP의 지속적인 활성을 오랫동안 지속 기판 회전율 및 높은 신호 대 잡음 비율을 허용한다. 따라서, 다른 색 기판과 AP 기자 효소를 사용하여 순차적 검출이 유효에서 성공 입증하고단일 배아 10-12,16 최대 세 가지 성적 증명서의 특징 검출.
이 멀티 타겟 발색 위시 (MC-WISH) 방법 (그림 1) (14)의 경우, 표시 안티센스 RNA 프로브는 시험 관내 전사에 의해 생성하고 사용할 수 합텐 - 라벨 중 하나를 표시했다. 배아는 포름 알데히드 및 메탄올 고정 처리 및 프로 테이나 제 K에 의해 투과성이 분해된다. 배아의 하이브리드 동시에 최대 세 다르게 표시 안티센스 RNA 프로브 다른 유전자에 대한 각각의 특정과 함께 실시한다. 엄격 세척하여 언 바운드 프로브를 제거한 후 각 합텐 - 레이블 검출 별도 라운드에서 시각화된다. 단일 검출 라운드 지역화 안정적인 색 침전물을 생성하는 AP-기판의 응용 프로그램에서 AP와 RNA를 시각화에 결합 된 항 합텐 항체와 배아의 배양으로 구성되어 있습니다. 항체의 검출 및 염색, 적용 항체-AP의 conju 후게이트는 낮은 pH 세척에 의해 제거된다. 다색 실험에서 검출 각 라운드는 다른 햅텐 레이블에 대해 표적 항체를 채용하고, 각 전사 패턴이 다른 색 기판 (표 1)에 의해 가시화된다. 배아는 글리세롤에 장착 및 미분 간섭 대비 (DIC)를 사용하여 광학 고해상도 화합물 현미경으로 이미지화된다.
Protocol
시험 관내 전사에 의해 RNA 프로브 1. 라벨링
- 의 RNase가없는 조건에서 1.5 ml의 마이크로 튜브에 시험 관내 전사 반응을 조립 : 10.5 μL DEPC 처리 된 H 2 O, 4.0 μL 배 전사 버퍼, 1.0 μL DEPC 처리 된 H 2 O (1 μg의) 선형화, 정제 주형 DNA, 1.3 μL NTP 믹스, 0.7 μL의 합텐 표지 된 UTP, 0.5 μL의 RNA RiboLock 저해제 2.0 ㎕의 RNA 폴리머 라제.
주 : 최종 반응 부피가 20 μL이다. - 템플릿의 프로모터 서열 사용 T7에 따라, 시험 관내 전사를위한 T3 또는 SP6 RNA 폴리머 라 아제 (17 항목 참조).
- RNA 프로브에 대한 레이블로 제닌-11 UTP, 비오틴-16 UTP, 또는 형광-12 UTP를 선택합니다. 자세한 내용은 토론에서 합텐 - 라벨 및 프로브 농도의 설명을 참조하십시오.
- 전사 반응을 혼합하고 곧 스핀 다운.
- 전사하자37 ℃에서 3 시간 동안.
- , 주형 DNA의 제거를위한 전사 반응에 1 μL RNA 분해 효소가없는 DNase의 I 추가 잘 혼합하고, 37 ℃에서 15 분 동안 품어.
- DEPC 처리 된 H 2 O에 200 μL 샘플 량으로 조정한다.
- 라벨 RNA 프로브를 침전 100 μL (0.5 권) 7.5 M 초산 암모늄 600 μL (3 권) 에탄올을 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 품어.
- 이 비법 인 뉴클레오티드의 원치 않는 침전으로 이어질 수 있으므로, 얼음처럼 차가운 에탄올을 사용하지 마십시오.
- 20 ℃에서 30 분 동안 최대 속도 (20,800 XG)에서 온도 조절 원심 분리기의 전사 RNA를 스핀 다운. 조심스럽게 뜨는을 대기음.
- 20 ℃에서 10 분 동안 20,800 XG에 70 % 실온에서 에탄올과 원심 분리기와 그 결과 펠렛을 씻으십시오.
- 상층 액을 제거하고 실수 느슨한 펠렛을 대기음하지 않도록주의. 실온에서 몇 분 동안 열린 뚜껑 마이크로 튜브에 펠릿 건조 공기를 보자.
- 지DEPC 처리 된 H 2 O. 100 ㎕에서 얻어진 펠릿을 해결
- -20 ° C에서 300 μL 사전 하이브리드 버퍼를 추가 (50 % 부피 / 부피 탈 포름 아미드, 5 배 SSC, 50 μg의 / ㎖ 헤파린 나트륨 소금, 0.1 % 부피 / 부피 트윈 20, 5 ㎎ / ㎖ torula RNA) 및 저장 . 프로브는 -20 ° C에서 저장 장기 수있다.
주 : 100 ㎕의 혼성화 완충액 새롭게 전사 프로브 묽은 3 μL 합텐 표지 된 RNA 프로브의 제 시험용 WISH 실험의 최종 농도를 얻었다.
삽입을 사용하여 배아 샘플 2. 처리
주의 : 다른 배양 단계 배아를 처리하기위한 모세관 또는 멀티 웰 플레이트를 사용하여 용액의 실수 교환 중에 이들 흡입하여 배아 상당량의 손실 위험을 맺는다. 이러한 손실을 방지하기 위해, 절차를 통해 배아 샘플을 실시하기위한 (예 Netwell 인서트 등) 바구니를 사용하는 것이 도움이 될 수있다. 이들은에서 폴리스티렌 있습니다배아 처리 동안 휴식하는 저면 (도 2A)에서의 폴리 에스테르 메쉬와 탑승자가 앉아.
- 위시 절차에서 배아를 처리, 12 웰 플레이트 (그림 2B)의 삽입을 조립하고 각 웰에 적합한 솔루션 2 ㎖를 추가합니다.
- 블루 팁을 사용하여 삽입으로 배아를 피펫. 모든 배아가 액체에 빠져들되어 있는지 확인합니다.
- 배양 시간은 도처 다음 단계에 대한 솔루션으로 가득 다른 12- 웰 플레이트에서 태아 - 함유 삽입되면.
- (그림 2C)이 다른 (그림 2D)에 하나의 솔루션에서 한 번에 최대 12 개의 시료 전송 사업자와 핸들을 사용합니다.
참고 : 필요한 볼륨을 감소 염색 반응 (단계 6.2)에 대한 사전 하이브리드 / 하이브리드 단계 (단계 4.1 참조) 24 웰 플레이트 2.0 ML의 모세관을 사용합니다. 하이브리드 및 염색 반응은 100 권으로 수행1, L은 각각 400 μL.
- (그림 2C)이 다른 (그림 2D)에 하나의 솔루션에서 한 번에 최대 12 개의 시료 전송 사업자와 핸들을 사용합니다.
교잡 배아 3. 준비
- , dechorionate 수집, 수정 및 표준 절차 (14, 18)를 사용하여 배아를 devitellinize. 제조 된 배아는 정기적으로 -20 ° C에서 메탄올에 저장됩니다.
- 이식란 RT로 계내 혼성화에 사용하고 웰 당 2 ml의 메탄올로 채워진 12 웰 플레이트의 인서트에 분배한다.
- 실온에서 감소 메탄올 시리즈를 통해 배아를 재수. (I) 1X PBS에서 1X PBS (Ⅱ)의 50 % 메탄올 중의 75 % 메탄올, 트윈 -20 (III) 1X PBS 내의 25 % 메탄올, 0.1 % 트윈 -20 (IV, 0.1 %, 3 분의 배아 매번 부화 ) 1X PBS, 0.1 % 트윈 -20 (V)를 1 배 PBS, 0.1 % 트윈 -20.
- 실온에서 20 분 동안 1X PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 배아를 사전 해결.
- RT에서 1X PBS에서 3 분, 0.1 % 트윈 20 (4) 세척하여 정착액을 제거합니다. 한편 해동 및 단백질 분해 효소 K와 글리신 작업 솔루션을 준비합니다.
- 0.1 % 트윈 -20 RT에서 2 밀리그램 / 1X PBS 용액에 글리신, 두 개의 1 분간 린스하여 반응을 정지.
- 실온에서 20 분 동안 1X PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 배아를 포스트 - 수정.
- 그 후, 실온에서 1X PBS에서 3 분, 0.1 % 트윈 20 세척하여 네 번 파라 포름 알데히드 정착액을 제거합니다.
- 전송 후 고정 배아는 사전 하이브리드 화하는 버퍼. 사전 하이브리드 버퍼에 저장 배아 -20 ° C에서 직접 프로브의 하이브리드를 진행합니다.
프로브 4. 하이브리드
- 이식란 RT로 예비 혼성화 완충액에 -20 ℃에서 보관. 2.0 ml의 microtub에 사전 하이브리드 버퍼의 배아를 배포ES.
- 최소한 30 분 동안 예비 혼성화 완충액에 65 ° C에서 배아 샘플을 예비 혼성화.
참고 : 사전 하이브리드와 하이브리드를 들어 수조를 사용하는 단계를 반복합니다. 사전 하이브리드 동안 세 안티센스 RNA 프로브, 각각 다른 유전자 성적 증명서에 대한 구체적이고 다른 합텐으로 표시까지 결합하여 프로브 믹스를 준비 할 시간이있다. - 프로브 혼합을 얻기 위해, 100 ㎕의 혼성화 완충액 (50 % 부피 / 부피의 탈 포름 아미드, 5 배 SSC, 50 ㎍ / ml의 각 소망 원래 합텐 표지 된 안티센스 RNA 프로브 (일반적으로 1 μL μL 내지 6 사이에서) 함께 적당량 추가 헤파린 나트륨 염, 0.1 % 부피 / 부피 트윈 -20, 5 ㎎ / ㎖ torula RNA, 5 % 중량 / 부피 덱스 트란 설페이트).
주 : 덱스 트란 설페이트 첨가는 선택적이다. - 5 분 동안 80 ℃에서 가열 블럭에서 안티센스 RNA 프로브 믹스 변성. 이어서 65 ° C까지 직접 변성 프로브 믹스 옮긴다.
- 사전 하이브리드의 대부분을 제거배아 샘플에서 버퍼와 변성 프로브 믹스를 추가합니다.
- 배아 샘플을 65 ℃에서 혼합 O / N을 조사하기 위해 하이브리드 보자.
주 : 55 ° C와 65 ° C 사이의 온도 범위는 정기적으로 하이브리드, 사전 및 사후 하이브리드 단계에 사용됩니다. 65 ° C에서 하이브리드는 가장 엄격한 조건을 제공하고 낮은 온도를 사용할 때 배경의 문제가있는 경우에 권장합니다. 배경 아무런 문제 향상된 신호 강도 및 개선 된 배아의 무결성의 이점을 제공한다 55 ℃에서 혼성화 추천은,이없는 경우. - 다음날 아침에는 먼저 그들이 시간에 정확한 온도로 가열되어 있는지 확인하기 위해, 65 ° C에 엄격 세척 솔루션을 전송합니다.
- 2ml를 미리 예열 혼성화 세척 완충액 함유 12- 웰 플레이트의 삽입에 2.0 ml의 마이크로 튜브에서 배아와 전사 혼성화 프로브 믹스 (2 × SSC 중 50 % 포름 아미드를, 0.1 % 트윈 -20). 그들을 함유하는 12 웰 플레이트를 배치오븐에 bryo 샘플 및 65 ℃에서 20 분 동안 품어.
- 2 ml의 새로운 하이브리드 세척 버퍼로 전송 배아 샘플 및 65 ℃에서 20 분 동안 품어. 다시 한 번이 단계를 반복합니다.
- 2 × SSC에 한 번, 65 ℃에서 20 분 세척에 의해 초과 프로브를 제거, 0.1 % 트윈 20, 0.2 × SSC에 세 번, 0.1 % 트윈 20.
- PBS, 트윈 20 실온에서 0.1 %를 1 배 배아 샘플을 전송합니다.
- 실온에서 적어도 30 분 동안 차단 버퍼 (1X PBS, 0.1 % 트윈 20에서 8 % 양 혈청)에서 배아를 품어.
합텐 표지 프로브 5. 항체 검출
주 : 모든 세 다르게 표지 프로브의 혼성화 동시 대조적으로, 각각의 프로브와 인큐베이션 항체 염색 별도 라운드에서 잇달아 검출된다. 따라서 각 검출 라운드에서 단 하나의 항체가 사용된다 (안티 - 디그 옥시 제닌 AP 또는 안티 플루 오레 신 - AP 또는 안티 - 비오틴 - AP 중).
- 단계 중에서 선택5.1.1 5.1.3 검출 될 합텐 라벨에 따라 적절한 항체 희석을 준비하려면.
참고 : 다른 레이블 프로브의 순차적 검출을 위해, 다른 항 합텐 항체는 각 검색 사이클에 적용됩니다.- 버퍼를 차단에서 4,000 : 형광 표지 된 프로브의 검출이 희석 안티 형광을-AP는 1 공액.
- 버퍼를 차단에서 4,000 : 제닌 - 표지 된 프로브의 검출이 희석 안티 제닌을-AP는 1 공액.
- 블로킹 완충액에 희석 4,000 : 바이오틴 - 표지 된 프로브의 검출을 위해 하나의 안티 비오틴 AP 접합체 용액을 제조 하였다.
- 실온에서 3 시간 4의 선택 항 합텐-AP 솔루션의 배아를 품어. 또한, O / N 4 ° C에서 품어. 동시에 세 개의 항체를 사용하지 마십시오.
- 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 PBS 1X, RT에서 0.1 % 트윈 -20 시간 (4)에 대한 15 분으로 배아 씻는다.
- 버퍼 시스템을 변경했다TNT에 RT에서 H 두 번, 15 분 (8.0, 0.1 M 트리스 -HCl pH를 0.1 M의 NaCl, 0.1 % 트윈 -20).
6. 알카라인 포스파타제 원체 염색
- 항체의 검출에 후속하여 (표 1 참조) 단계 6.1.4 6.1.1 중에서 선택하고, 원하는 색상 신호를 얻기 위해 알칼리성 포스파타제 염색 발색 반응의 진행 하나. 검출의 각 라운드마다 다른 발색 기질 반응은 다른 색상 각 성적 패턴을 강조하기 위해인가된다.
- 빠른 레드 염색
- TT8.2 15 분 (0.1 M 트리스 - 염산의 pH 8.2, 0.1 % 트윈 20)에 대한 배아 두 번 씻으십시오.
- 배아를 세척하면서, 패스트 레드 TR / NAMP 알칼리성 포스파타제 기질 정제 세트로부터 패스트 레드 염색 용액을 제조 하였다.
- 증류수 1ml를 설정할 정제 버퍼 정제를 용해하고, 0.1 M 트리스 -HCl pH가 8.2을 수득 텍싱하여 혼합한다.
- 준비된 T에 고속 레드 TR / NAMP 태블릿을 드롭RIS 버퍼 패스트 레드 염색 용액을 얻었다 텍싱하여 녹인다.
- 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 용해되지 않은 입자가 클리어 패스트 레드 염색 액.
- 빠른 블루 염색
- 신선한 SB8.2 염색 완충액을 15 분 동안 배아 두 번 씻어 (0.1 M 트리스 -HCl pH가 8.2, 0.1 M의 NaCl, 0.05 M의 MgCl 2, 0.1 % 트윈 -20).
- 배아를 세척하면서, 50 밀리그램 / (DMF)에서 용액 패스트 블루 BB 및 (DMSO)에 50 ㎎ / ㎖ 나프톨 포스페이트 스톡 용액으로부터 패스트 블루 염색 액을 준비한다.
- 갓 SB8.2 0.5 ㎎ / ㎖에서 빠른 블루 BB 솔루션을 준비합니다.
- 갓 SB8.2 0.5 ㎎ / ㎖에서 별도의 나프톨 인산 용액을 제조.
- 소용돌이와 일정한 혼합에서 빠른 블루 BB 솔루션에 준비된 나프톨 인산 솔루션을 추가 적가. 생성 된 최종 농도는 작업 모두 기판 구성 요소 용액 0.25 밀리그램 /이다.
참고 : 다른 빠른 블루 / 나프톨 phosp을증오 조합은 상이한 색조 (표 1 참조)를 초래한다.
- BCIP / NBT 염색
- 신선한 SB9.5 염색 완충액을 15 분 동안 배아 두 번 씻어 (0.1 M 트리스 -HCl pH가 9.5, 0.1 M의 NaCl, 0.05 M의 MgCl 2, 0.1 % 트윈 -20).
- purpleblue 발색 신호에 대해, 신선 1 μL의 레바 미솔, 3.5 μL의 BCIP 및 SB9.5 염색 완충액 1 ㎖ 당 4.5 μL의 NBT를 추가하여 BCIP / NBT 염색 용액을 제조하고 잘 혼합한다.
- INT 염색
- 신선한 SB9.5 염색 버퍼에 15 분 동안 배아 두 번 씻으십시오.
- yellowbrown 발색 신호를 들어, 갓 1 μL의 레바 미솔, 5 μL 마젠타 - PHOS 및 SB9.5 염색 버퍼 1 ㎖ 당 5 μL의 INT를 추가하여 INT 염색 용액을 제조하고 잘 섞는다.
참고 : 또는 7.5 μL / ㎖ BCIP / INT 즉시 사용 가능한 염색 액을 사용한다.
- 빠른 레드 염색
- 염색 반응 전송 배아 샘플24 웰 플레이트에. 어둠 속에서 선택한 염색 액 400 μL의 각 샘플을 품어.
- 실체 현미경 하에서 개발 신호 가끔 모니터링합니다. 원하는 신호 강도가 얻어 상당한 배경 신호가 관찰되기 전에 때 염색 반응을 정지.
- , 발색 반응을 중지 아니라 당 2 ml의 TNT를 포함하는 12 웰 플레이트의 삽입에 스테인드 배아를 전송합니다. TNT의 스테인드 배아 두 번 씻어.
- 1 × PBS에 10 분 동안 배아 두 번 씻고, 실온에서 0.1 % 트윈 20 잔류 기판을 제거합니다.
7. 항체 제거 / 알칼리성 인산 가수 분해 효소 불 활성화
- 항체를 제거하고 실온에서 10 분 동안 낮은 pH 정지 용액 (0.1 M 글리신 - 염산 pH를 2.2, 0.1 % 트윈 -20) 2 ㎖로 배양 알칼리성 포스파타제 불활.
- RT에서 1 × PBS 중 2 ㎖, 0.1 % 트윈 -20로 1 분 동안 헹구고.
- 1 × PBS로 3 분 동안 3 회 반복, 0.1 % 트윈 20 실온에서.
8. 제 2 검출 라운드
- 제 사체의 분포 패턴을 검출하는 제 합텐 레이블에 대해 타겟 AP 항체 접합체를 사용하여 합텐 표지 된 프로브 (STEP 5.1-5.4) 항체의 검출을 진행.
- 알칼리성 포스파타제 염색 발색 (STEP 6.1-6.5) (가능한 색상 표 1 참조) 제 1 검출 원에서 사용되는 것과 대조되는 색을 생성하는 기판 조합을인가를 수행한다.
- 7.3 단계 7.1에 설명 된대로 두 번째 항체-AP 복합체를 제거합니다.
9. 제 3 검출 라운드
- 제 사체의 분포 패턴을 검출하기 위해서, 항체가 AP 셋째 합텐 표지를 사용하여 특정 공액 합텐 표지 된 프로브의 검출 항체 (STEP 5.1-5.4)로 진행.
- 알칼리 포스 파타 아제 발색 염색 (단계 6.1-6.5) AP 아니었다 기판의 조합을 적용 수행이전 검출 라운드에서 먹었. 색 검출 이전 두 라운드의 것과 구별하기 쉽게 침전 생성 발색 반응을 선택 (색상 선택은 표 1 참조).
10. 설치 및 영상
- PBS에서 30 % 글리세롤로 적절히 이동시켜 염색 배아 배아 완전히 글리세롤 용액에 침지 될 때까지 배양한다. 그들은 바닥에 가라 앉을 때 잘 평형있다.
- H 2 O 70 % 글리세롤로 전송 배아 및 실온에서 평형 수 있습니다. 염색 배아는 4 ° C에서 70 % 글리세린에 저장 될 수있다.
- 장착, 피펫은 객체의 슬라이드에 슬라이드 (그림 3)에 붙어 스페이서를 건드리지 않고 70 % 글리세롤 방울의 배아를 스테인드. 커버 슬립을 적용합니다.
- 보기 해부 현미경 배아를 탑재. 배아가 원하는 방향으로 회전 할 수 있도록, 적용 커버 슬립을 이동합니다.
- 제대로 관찰미분 간섭 대비 광학와 복합 현미경 높은 해상도 (20X, 40X 목적)에서 지향 배아.
- 디지털 컬러 카메라로 이미지를 캡처 및 디지털 저장 장치에 저장한다.
Representative Results
설명 프로토콜은 서로 다른 색상의 여러 사본 패턴의 동시 시각화 할 수 있습니다. MC-WISH 직접 배아 같은 상이한 유전자의 발현 양상을 비교할 수있는 이점을 제공한다. 예를 들어, 빈 spiracles의 발현 패턴 (EMS) (19), 부사 tarazu (FTZ) (20)와 단 정치 못한 쌍 1 (slp1) (21)가 직접 초파리 melanogaster의의 배반 엽 단계의 배아에서 비교 및 색상 색조의 다양한 시각입니다 (그림 4) .
다른 AP 기질 조합이 색 침전물 (표 1)의 대조 패널을 얻는 것이 가능하다. 패스트 레드 BCIP / NBT에 의해 생성 된 침전물 제조 보라색 적색 침전물을 쉽게 구별 할 수 있고, 따라서 일반적인 사용2 색 실험 LY (도 4A). 빠른 붉은 색이 성적 증명서의 일부 공동 분배의 경우에는 위장되도록 그러나, BCIP / NBT 얼룩 신속하게, 다소 어두운 색으로 설정할 수 있습니다. 따라서, 빠른 블루의 응용 프로그램은 NAMP, NAGP 및 NABP, 각각 (표 1)과 함께, 녹색, 파란색과 보라색의 제품을 생성하는 장점이 될 수 있습니다. NAMP와 빠른 블루의 조합은 EMS 각각 빨간색과 파란색으로 시각화 slp1 표현 사이트 (그림 4B)에 대해 다음과 같이 인접한 또는 중복 표현 영역에서 빠른 레드 제품을 쉽게 식별 할 수있는 밝은 파란색 색상을 제공합니다. 녹색 EMS 도메인이 명확하게 빨간 slp1 발현 사이트 (그림 4C)에서 독특한되도록 빠른 블루 NAGP 조합, 빠른 붉은 얼룩과 비슷한 강한 대비를 제공합니다. 그러나, EMS 및 slp1 식 사이트 드 않으면빠른 블루 NABP 및 고속 레드에 의해 tected, 각각 결과 보라색과 붉은 색의 침전물 (그림 4D) 이하 식별 할 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이 빨간색과 녹색, 각각 (그림 4D)에 slp1과 자유 무역 식으로 같이 빠른 빨간색과 빠른 블루 NAGP 구별하기 쉽다.
INT와 함께 MagentaPhos은 자유 무역 지역의 분절 표현 (그림 4C, E)를 나타 내기 위해 사용되는 노란색 침전물을 생성한다. 노란 색의 침전물을 빨리 블루 NAMP 각각 (그림 4E) MAG / INT와 slp1과 자유 무역의 검출에 의해 예시 된 바와 같이 푸른 색 기판에 좋은 대조를 생성합니다. 그러나, 황색 침전물이 패스트 레드 생성물로부터 쉽게 식별 이하이다. EMS의 노란색 스테인드 표현 도메인은 거의 disti 될 수 있습니다 빨간색 (그림 4 층)에 표시된 slp1의 주동이의 표현에서 nguished. 따라서, 색상의 기판 조합이 각각의 실험에 대해 신중하게 선택되어야한다.
그림 MC-위시 1. 순서도. 세 가지 독특한 성적 증명서 패턴의 여러 가지 빛깔의 시각화를 들어, 각 검색 사이클 다른 항체 AP 접합체 및 색상 기판 조합 사이에 선택합니다. 약어 : AP, 알칼리 포스 파타 아제; 바이오, 비오틴, DIG, 디그 옥시 제닌; FLUO, 형광. 다른 약어 전설 4 및 표 1을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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배아 캐리어로서도 2 삽입한다. (A) 15mm 직경 및 74 ㎛의 메쉬 크기의 폴리 에스테르 막과 하단에 장착 인서트 초파리 배아 담체로서 사용된다. (나) 삽입은 다양한 솔루션을위한 저수지 트레이의 기능을 12 웰 플레이트에 조립된다. (C) 사용 가능한 사업자 및 핸들 (12) 삽입 / 배아 샘플을 동시에. (D)의 처리가 가능 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
스테인드 배아 그림 3. 장착. 태아는 스페이서로 작동 된 커버의 두 스택 사이에 70 % 글리세롤의 드롭에 장착되어있다. 응용 프로그램의 부드러운 이동거짓말 큰 coverslip에 관찰과 사진의 원하는 방향에 탑재 된 배아를 회전하는 데 도움이됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 초파리 배아에서 mRNA의 성적 증명서의 여러 가지 빛깔의 시각화. 초파리 배아에서 MC-위시 실험의 예는 측면보기에서 표시됩니다. 빈 spiracles의 mRNA 발현 패턴 (EMS), 부사 tarazu (FTZ)와 실수 페어링 1 (slp1)은 각 패널에 표시되는 다른 AP 색상 기판의 조합에 의해 시각입니다. 성적 증명서는 (A) 자유 무역 FLUO 및 EMS DIG, (가 검출되었다
| 기판 조합 | 1 ml의 AP 버퍼에 추가 | 집중하고기 [μg의 / ㎖] | AP 버퍼 | 색 | 신호 감도 |
| BCIP NBT | 3.5 μL 4.5 μL | (175) 337.5 | SB9.5 | 보라색 | +++ |
| MAG의 INT | 5 μL 5 μL | (250) (250) | SB9.5 | 황색 | + |
| BCIP / INT 원액 | 7.5 μL | (250) (250) | SB9.5 | 황색 | + |
| 빠른 블루 NAMP | 5 μL 5 μL | (250) (250) | SB8.2 | 파랑 | ++ |
| 빠른 블루 NABP | 20 μL 10 μL | 1,000 (500) | SB8.2 | 제비꽃 | ++ |
| 빠른 블루 NAGP | 10 μL 10 μL | (500) (500) | TT8.2 | 녹색 | + |
| 빠른 레드 NAMP | 1 태블릿 | 1,000 (400) | TT8.2 | 빨간 | ++ |
표 1. 기판 조합 약어 : +++, 강한,. ++ 매체; +, 약한 NBT, 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드; BCIP, 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트; INT, 2- (4- 요오도 페닐) -3- (4- 니트로 페닐) -5- 페닐 테트라 졸륨 클로라이드; MAG, 마젠타 PHOS, 5- 브로 모 -6- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트, NAMP, 나프톨 AS-MX 인산; NABP, 나프톨 AS-BI 포스페이트; NAGP, 나프톨 AS-GR-인산; SB9.5, pH가 9.5에서 염색 버퍼; SB8.2, pH가 8.2에서 염색 버퍼; TT8.2, pH가 8.2에서 트리스 - 트윈 버퍼.
Discussion
방사능 표지 된 핵산 프로브를 원위치 혼성화 (ISH)에서 종종 조직 섹션에 RNA의 현지화를 검출하는데 사용된다. 방사성 ISH 방법은, 그러나, 덜 민감 시간 소모하며, 전체 마운트에서 전체 성적 분포 패턴의 감사를 허용하지 않습니다. 대조적으로, 본원에 기재된 MC-WISH 방법은 그대로 배아 내의 색 대조에서 여러 유전자의 발현 도메인의 직접적인 비교를 허용한다. MC-소원은 조직 학적 상황을 즉시 알 수있다 표준 시야 현미경으로 간단하게 시각화 장점이있다. 이는 가능성이 높은 정확도로 서로에 대해 지형적 유전자 발현과 관련된 도메인을 신속하고 신뢰할 수있는 방법에 고유하고 중복 발현 부위를 정의하기 위해 제공한다. 한편, 멀티 플렉스 형광 ISH (FISH)는 감도 및 해상도에 대해 더 강력하며, 바람직하다면 셀룰러 또는 셀룰러 서브 재 사용되고mRNA의 검출의 용액이 필요하다.
MC-위시하여 매핑 된 성적 증명서의 넓은 스펙트럼은 거의 모든 증명서는 배아에서뿐만 아니라 애벌레 및 성인 조직과 초파리가 아닌 다른 종에서뿐만 아니라 분석 할 수 있음을 시사한다. 실제로, 초파리 여기 자세한 설명 절차는 제브라 피쉬 배아 11,16,22와 마찬가지로 효율적으로 작동합니다. 또, MC-WISH 방법은 무척추 동물과 척추 동물 배아 조직 표본의 다양한 적응 될 수있다.
합텐 - 라벨 및 프로브 농도
우리는 일상적으로 RNA 프로브의 합텐 레이블로 형광, 제닌, 및 비오틴을 사용합니다. 또한, 디 니트로 페놀 표지 된 프로브를 적용 할 수 있고, 제브라 피쉬 WISH 실험 23-25에 도입되어있다. 그 형광 가장 F를 사용하므로 형광 표지 된 프로브는 다른 햅텐 라벨에 비해 낮은 감도를 표시풍부한 성적 증명서 또는 검출. 각 새로 전사 프로브는 먼저 성능이 기판으로 BCIP / NBT 또는 고속 레드를 사용하거나 평가되는 단일 위시 실험에서 시험한다. 배경 개발없이 강한 신호가 몇 시간에 분 이내에 달성 될 때 프로브 농도를 최적으로 간주됩니다.
관심의 표현 영역이 MC-위시하여 자신의 전체 범위에서 발견되었는지 확인하기 위해, 가장 민감한 기판 조합, BCIP / NBT를 사용하여 단일 레이블 위시 실험에 의해 각각의 성적 패턴을 시각화하는 것이 필수적이다. 이것은 약한 발현 도메인이 멀티 타겟 실험에서 간과하지 않는 것을 보장한다. 다른 기판 조합의 적은 민감도를 보상하기 위해 그 표준 BCIP / NBT 염색에 비해 프로브 농도 (세배로) 배로 사용하는 것이 필수적이다.
낮은 pH 불 활성화
낮은 pH 불 활성화 단계로 이어질 수두 번째 및 세 번째 라운드에서 염색 감소 신호 검출 결과 안티센스 합텐 표지 된 RNA 프로브 / 센스 mRNA의 하이브리드의 부분 분해. 감도의 손실을 최소화하기 위해, 불 활성화 단계는 가능한 한 짧다. 우리는 낮은 pH에서 10 분 배양 시간은 AP-활동의 제거를위한 충분하다는 것을 경험했다. 많은 양의 후속 빠른 세척은 언 바운드 항체-AP 복합체의 신속한 희석을 보장하고 haptenized 프로브에 다시 결합을 방지 할 수 있습니다. 대체 절차는 파라 포름 알데히드 고정 및 열 불 활성화를 포함한다. 그러나, 컬러 석출물의 일부는 안정되지 않고, 가열 파라 포름 알데히드 고정은 AP의 완전한 불 활성화하기에 충분하지 않을 수있다. 첫 번째 적용 항체-AP 복합체의 불완전 불 활성화는 다음 검출 라운드 검출 할 두 번째 mRNA의 종 식 가양 중복으로 이어지는에서 mRNA의 패턴의 시각화를 다시 발생할 수 있습니다. 따라서, 대조 실험에서 번째전자 배아는 처음 적용된 항체-AP 복합체의 불 활성화 후 2 분획으로 분할됩니다. 제 항체-AP 복합체는 제어 부분에서 생략되고 제 2 색에 반응하는 신호를 생성 할 것이다. 제 2 색 반응이 처음에 대응하는 신호의 분포 패턴을 생성하는 경우 비활성화 절차는 비효율적이었다. 이 경우에, 낮은 pH 정지 용액에서 배양 시간은 다음 실험에 대해 연장한다.
AP 기판 애플리케이션의 오더
감도가 검출 이후의 각 라운드로 떨어 때문에, 이전에 더 풍부 성적에 덜 풍부한 mRNA를 검출하는 것이 좋습니다. 고속 염료가 바람직 강한 발현 사체 검출 용 제 염색 라운드에서 적용되도록 또한, 패스트 레드 및 블루 빠른 기판의 조합은 상당히 purpleblue의 BCIP / NBT 얼룩보다 덜 민감하다. 이 또한 시간후속 BCIP / NBT 염색 모니터링 및 purpleblue 신호 라이터 고속 염료 관련 너무 어두워지기 전에 시간에 정지 될 수있는 장점이있다. 따라서 표준 2 색 실험에서는 제 mRNA의 강한 발현은 패스트 레드에 의해 검출되고, 두 번째 약한 BCIP / NBT 의해. 그러나 잠시 후 확산 될 석출물을 생성 황색 INT 기판 조합이 적용될 수있다 고속 염료에 대한 대안으로서,. 따라서 BCIP / INT는 독점적으로 마지막 염색 라운드에서 적용된다. 따라서 세 가지 컬러 실험에서 우리는 종종 첫 번째 빠른 레드, 두 번째 BCIP / NBT (또는 고속 블루)와 세 번째 INT 기판의 조합을 사용합니다. 이 INT를 적용 할 때 가능한 한 빨리 스테인드 배아를 촬영하는 것이 좋습니다 있습니다.
아조 염료의 형광 검출
이는 어두운 색 침전물 라이터 하나 섀도우 때 중첩 발현 패턴을 인식하는 것이 때로는 어렵다. 에프또는 예를 들어, 강력한 개발 BCIP / NBT의 침전물 가벼운 빠른 염료 신호를 마스크 할 수 있습니다. 이 문제를 극복하는 한가지 방법은 각각의 염색 직후에 이미지를 캡쳐하고, 다음 검출 라운드 전에인가 색 침전물을 제거하는 것이다. 이 경우, 알코올 가용성 아조 염료 (패스트 레드) 및 INT 침전물을 각각 제 1 및 제 2 검출 발사 후 에탄올 세척에 의해 제거되고, BCIP / NBT 염색은 마지막 AP-기판 (26)으로인가된다. 또 다른 가능성은 아조 염료의 형광 특성을 활용할 수있다. 패스트 블루 원적외선 필터 (28, 29)에 의해 관찰 될 수있는 반면 패스트 레드 27 세트 로다 민 필터를 사용하여 가시화 될 수있다. 너무 조밀되고 아조 염료의 형광 신호를 급냉 않도록 비교 또는 발색 및 형광 화상의 중첩은, 시간에 정지되어야 공동 distribution.Using이 방법을, BCIP / NBT 신호 개발 사이트를 밝힐 수 반응 생성물.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
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