Summary
Vi beskriver en multi-target kromogenisk hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) prosedyre i intakte Drosophila embryoer tillater simultan og spesifikk påvisning av tre forskjellige mRNA fordelingsmønstre av kontrastfarger utfellinger.
Abstract
For å analysere gen regulatoriske nettverk aktive under embryonal utvikling og organogenese er det viktig å presisere hvordan de forskjellige gener blir uttrykt i romlig forhold til hverandre in situ. Multi-target kromogenisk hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) i stor grad forenkler umiddelbar sammenligning av genutrykksmønster, som gjør det mulig karakteristiske visualisering av forskjellige mRNA arter i kontrastfarger i samme prøve prøven. Dette gir mulighet for å relatere genekspresjon domener topografisk til hverandre med stor nøyaktighet og til å definere unike og overlappende uttrykk områder. I presenterte protokollen beskriver vi en MC-WISH prosedyre for å sammenligne mRNA uttrykk mønstre av forskjellige gener i Drosophila embryoer. Opp til tre RNA-prober, hver spesifikk for et annet gen, og merket med et annet hapten, er samtidig hybridiserte til embryoet prøvene og senere detektert av alkali-ne fosfatase-basert kolo immunhistokjemi. Den beskrevne fremgangsmåte er detaljert her for Drosophila, men fungerer like godt med sebrafisk embryoer.
Introduction
In situ hybridisering (ISH) er standardmetoden for påvisning og lokalisering av RNA-transkripter i et morfologisk sammenheng, innenfor celler, vev og organismer 1. Signalene som produseres av ISH prosedyren blir ofte visualisert ved radioaktive, fluorescerende og kromogeniske deteksjonssystemer. I de senere årene betydelige teknologiske fremskritt i fluorescerende ISH (fisk) 2 resulterte i dramatisk forbedret følsomhet og oppløsning, slik at påvisning og kvantifisering av RNA uttrykk ved encellede og sub-cellulære nivåer og RNA visualisering opp til enkle molekyler 3,4 .Mens sofistikerte single-molekyl FISH metoder brukes for mer spesialiserte programmer, er kromogenisk ISH utbredt som en rutine RNA in situ deteksjonsmetode i forskning og klinisk diagnostikk. For kromogen deteksjon brukes enzymet utfellingsreaksjoner, som genererer synlige produkter i kontrastfarger på nettstedeneav hybridisering 5. Dette har den fordelen at RNA visualisering kan kombineres med rutine histologiske flekker og morfologiske sammenheng er umiddelbart tydelig av standard lysfelt mikroskopi. Videre er mange av de anvendte farge substratene produserer utfellinger, som er stabile i organiske og / eller vandige medier montering, slik at permanente prøve preparater kan oppnås 5.
I Drosophila, innledende ISH protokoller brukt radioisotop-merkede prober for transkripsjon deteksjon på kåret material 6. Mens det er vanskelig å rekonstruere fra vevssnittene fullstendige transkriptmønstre hele embryoer eller organsystemer, gjør anvendelsen av kromogene ISH prosedyrer med ikke-radioaktivt merkede prober det mulig å foreta en total påvise RNA-fordelinger i hel-monteringer 7. Selv om mange varianter av kromogen ISH eksisterer, i typisk hel-mount in situ hybridisering (vil) protokoller hybridized hapten-merkede prober blir oppdaget av anti-hapten antistoffer konjugert til en reporter enzym og mRNA transkripsjoner er visualisert ved et utfellende kromogen.
Paletten av forskjellig fargede presipitater fremstilt av reporter enzymene alkalisk fosfatase (AP), pepperrot-peroksidase (POD) og beta-galaktosidase (GAL) gjør det mulig for den særegne deteksjon av flere mål i en og samme prøve 8-14. Imidlertid varer POD enzymatisk aktivitet bare i en begrenset tidsperiode, og GAL kolorimetrisk reaksjon er noe mindre følsom, slik at uten ekstra (tyramide) signalforsterkning 15 påvisning av mindre rikelig transkriptene kan være utfordrende med disse enzymene. I motsetning til dette, den varige aktiviteten av AP muliggjør langvarig substrat omsetning og høyt signal-til-støy-forhold. Derfor har vist, sekvensiell deteksjon ved hjelp AP reporter enzym med forskjellig fargede underlag vellykket i effektiv ogkarakteristiske deteksjon av opp til tre ulike transkripsjoner i enkle embryoer 10-12,16.
For denne multi-target kromogen WISH (MC-WISH) metode (figur 1) 14, er merket antisens RNA-prober ble generert ved in vitro transkripsjon og som er merket med ett av de tilgjengelige hapten-etiketter. Embryoer er formaldehyd faste og permeabilized av metanol behandling og proteinase K fordøyelsen. Hybridisering av embryoer er samtidig utført med opp til tre forskjellig merkede antisense-RNA-prober hver spesifikke for et annet gen. Etter fjerning av ubundet probe av stringens vaskinger hver hapten-etikett er anskueliggjort i en egen runde med deteksjon. En enkelt deteksjon runde består av inkubering av embryoer med et anti-hapten-antistoff koblet til AP, og RNA visualisering ved bruk av en AP-substrat som gir en lokalisert stabil farge bunnfall. Etter antistoffpåvisning og flekker, den anvendte antistoff-AP conjuPorten er fjernet ved en lav pH-vask. I flerfarget eksperimenter, hver runde av deteksjons anvendes et antistoff rettet mot et annet hapten-merket og hvert transkript mønster blir visualisert ved en annen farge substrat (tabell 1). Embryoer er montert i glyserol og avbildes under en høyoppløselig sammensatt mikroskop ved hjelp av differensial interferens kontrast (DIC) optikk.
Protocol
1. Merking av RNA-prober ved in vitro transkripsjon
- Montere in vitro transkripsjonsreaksjon i et 1,5 ml mikrorør i henhold til RNase-frie betingelser: 10,5 ul DEPC-behandlet H2O, 4,0 ul 5x transkripsjon buffer, 1,0 pl (1 pg) linearisert, renset DNA i DEPC-behandlet H 2 O, 1,3 mL NTP mix, 0,7 mL hapten-merket UTP, 0,5 mL RiboLock RNA-hemmer, 2,0 mL RNA polymerase.
Merk: Det endelige reaksjonsvolumet er 20 pl. - Avhengig av malens promotersekvensen bruk T7, T3 eller SP6 RNA-polymerase for in vitro transkripsjon (se henvisning 17).
- Velg digoksigenin-11-UTP, biotin-16-UTP, eller fluorescein-12-UTP som etikett for RNA-probe. For flere detaljer, se omtale av haptenet-etiketter og sonde konsentrasjoner i diskusjonen.
- Bland transkripsjon reaksjon og spinne ned innen kort tid.
- La transkriberei 3 timer ved 37 ° C.
- Tilsett 1 ul RNase-fri DNase I til transkripsjonsreaksjon for fjerning av templat-DNA, bland godt og inkuber i 15 min ved 37 ° C.
- Juster med DEPC-behandlet H2O prøvevolumet til 200 ul.
- Tilsett 100 ul (0,5 vol) 7,5 M ammoniumacetatbuffer og 600 ul (3 vol) etanol for å felle merket RNA probe. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Ikke bruk iskald etanol, da dette kan føre til uønsket utfelling av uinkorporerte nukleotider.
- Spinne ned den transkriberte RNA i et temperaturkontrollert sentrifuge ved maksimal hastighet (20.800 xg) i 30 minutter ved 20 ° C. Aspirer nøye supernatant.
- Vask den resulterende pellet med 70% etanol ved romtemperatur og sentrifuger ved 20 800 xg i 10 min ved 20 ° C.
- Fjern supernatanten og være forsiktig for ikke å uhell aspirer løs pellet. La pellet lufttørke i microtube med åpnet lokk for noen min ved RT.
- Disløse den oppnådde pellet i 100 ul DEPC-behandlet H2O
- Tilsett 300 ul pre-hybridiseringsbuffer (50% volum / volum deionisert formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin-natriumsalt, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA) og oppbevares ved -20 ° C . Prober kan være langsiktig lagret ved -20 ° C.
Merk: For en første prøve av den nylig transkriberte probe fortynnet 3 ul hapten-merket RNA-probe i 100 mikroliter hybridiseringsbuffer for å oppnå den endelige konsentrasjonen på WISH eksperimentet.
2. Behandling av embryo prøver ved hjelp Setter
Merk: Bruk av mikrorør eller multi-brønnplater for behandling av embryoer gjennom de forskjellige trinnene inkubasjons bærer risikoen for å miste betydelige mengder av embryoer ved et uhell å aspirere dem under utveksling av løsninger. For å unngå dette tap, kan det være nyttig å bruke kurver (for eksempel NetWell inserts) for gjennomføring embryoprøver gjennom prosedyren. Dette er polystyren iinnsatsene med et polyesternett på bunnen (figur 2A), som embryoene hvile under behandlingen.
- For behandling av embryoer i WISH prosedyren, montere innstikk i en 12-brønns plate (figur 2B) og tilsett 2 ml av den riktige løsningen til hver brønn.
- Pipette embryoene til innsatsene ved hjelp av en blå tips. Sørg for at alle fostre er nedsenket i væske.
- Når inkubasjonstiden er slutt sted embryo-inneholdende innstikk i en annen 12-brønns plate, som er fylt med løsningen for neste trinn.
- Bruk bærere og håndtak (figur 2C) for å overføre inntil 12 prøver om gangen fra en oppløsning til en annen (figur 2D).
Merk: For å redusere de nødvendige volumer, bruker 2,0 ml mikrorør for prehybridisering / hybridiseringsbetingelser trinn (se STEP 4.1) og 24-brønners plater for fargereaksjonene (trinn 6.2). Hybridiseringsreaksjonene og farge-reaksjoner blir utført i volumer på 1001; l og 400 ul, respektivt.
- Bruk bærere og håndtak (figur 2C) for å overføre inntil 12 prøver om gangen fra en oppløsning til en annen (figur 2D).
3. Utarbeidelse av embryoer for Hybridisering
- Samle, dechorionate, fikse og devitellinize embryoer ved hjelp av standard prosedyrer 14,18. De fremstilte Embryoene blir rutinemessig lagret i metanol ved -20 ° C.
- Overfør embryoer som skal anvendes for in situ hybridisering til RT og fordele i innsatsene på en 12-brønns plate som er fylt med 2 ml metanol per brønn.
- Rehydrere embryos gjennom en avtagende metanol serie på RT. Inkuber embryoer hver gang i 3 min i: (i) 75% metanol i 1 x PBS (ii) 50% metanol i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% metanol i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1 x PBS, 0,1% Tween-20.
- Pre-fikse embryoene i 4% paraformaldehyd i 1 x PBS i 20 minutter ved RT.
- Fjern fiksativ ved 4 vaskinger i 3 min i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved romtemperatur. I mellomtiden tine og forberede proteinase K og glycin arbeidsløsninger.
- Stopp reaksjonen av to skyllinger i 1 min 2 mg / ml glycin i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved romtemperatur.
- Post-fikse embryoene i 4% paraformaldehyd i 1 x PBS i 20 minutter ved RT.
- Deretter fjernes paraformaldehyd fiksativ av vasking fire ganger i 3 min i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved romtemperatur.
- Overfør etter fast embryoer til pre-hybridisering buffer. Oppbevar embryoene i pre-hybridiseringsbuffer ved -20 ° C, eller direkte fortsette med hybridisering av sonder.
4. Hybridisering av prober
- Overfør embryoene lagret ved -20 ° C i pre-hybridiseringsbuffer til RT. Fordel embryoer i pre-hybridiseringsbuffer inn 2,0 ml microtubes.
- I 30 minutter på et minimum, pre-hybridiserer embryo prøver ved 65 ° C i pre-hybridiseringsbuffer.
Merk: For pre-hybridisering og hybridisering trinn et vannbad brukes. I løpet av pre-hybridisering det er tid for å fremstille sonden blanding ved å kombinere opptil tre antisense-RNA sonder, som hver er spesifikke for et annet gen transkripsjon og merket med et annet hapten. - For å få sonden blandingen, legger sammen passende mengder (vanligvis mellom 1 pl til 6 ul) av hver ønsket opprinnelige hapten-merket antisens RNA probe i 100 mikroliter hybridiseringsbuffer (50% volum / volum deionisert formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin-natriumsalt, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA, 5% vekt / volum dekstransulfat).
Merk: Tilsetning av dekstransulfat er valgfritt. - Denaturere antisens-RNA-probe blandingen i en varmeblokk ved 80 ° C i 5 min. Deretter overføres den denaturerte probe blandingen direkte til 65 ° C.
- Fjerne det meste av pre-hybridiseringbuffer fra embryo prøver og legge den denaturert probe mix.
- La embryo prøver hybridiserer å sondere mix O / N ved 65 ° C.
Note: temperaturer mellom 55 ° C og 65 ° C blir rutinemessig brukt for hybridisering, pre- og post hybridiseringsbetingelser trinn. Hybridisering ved 65 ° C gir de strengeste forhold og anbefales i tilfelle av bakgrunns problemer når du bruker lavere temperaturer. Dersom det ikke er noen bakgrunnsproblemer, hybridisering ved 55 ° C anbefales, noe som gir fordelen av forbedret signalstyrke og forbedret embryo integritet. - Neste morgen, først overføre stringens vaskeløsninger til 65 ° C, for å sørge for at de er varmet opp til riktig temperatur i tid.
- Overføring hybridiseringsprobe blanding med embryoer fra 2,0 ml mikrorør til innsetninger av en 12-brønners plate inneholdende 2 ml forvarmet hybridisering vaskebuffer (50% formamid i 2 x SSC, 0,1% Tween-20). Plasser 12-brønns plate som inneholder embryo prøvene i en ovn, og inkuber i 20 min ved 65 ° C.
- Overfør embryo prøvene til 2 ml ny hybridisering vaskebuffer og inkuber i 20 min ved 65 ° C. Gjenta dette trinnet en gang.
- Fjern overskudd av probe etter 20 min vaskinger ved 65 ° C, en gang i 2 x SSC, 0,1% Tween-20 og tre ganger i 0,2 x SSC, 0,1% Tween-20.
- Overfør embryo prøvene til 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved romtemperatur.
- Inkuber embryoene i blokkerende buffer (8% saueserum i 1 x PBS, 0,1% Tween-20) i minst 30 minutter ved romtemperatur.
5. Antistoff Påvisning av hapten-merkede prober
Merk: I motsetning til den samtidige hybridisering av alle tre forskjellig merkede prober, er hver probe detekteres etter hverandre i separate runder med inkubering antistoff og farging. Derfor, i hvert deteksjons runde bare ett antistoff (enten anti-digoksigenin-AP eller anti-fluorescein-AP eller anti-biotin-AP) anvendt.
- Velg mellom STEP5.1.1 til 5.1.3 og fortsette med å fremstille den passende antistoff-fortynning i henhold til hapten-etikett som skal detekteres.
Merk: For sekvensiell påvisning av forskjellig merkede prober, er en annen anti-hapten-antistoff som benyttes i hvert deteksjon syklus.- For deteksjon av en fluorescens-merket probe fortynnet anti-fluorescein-AP-konjugater 1: 4000 i blokkeringsbuffer.
- For påvisning av en digoxigenin-merket probe fortynnet anti-digoksigenin-AP-konjugater 1: 4000 i blokkeringsbuffer.
- For påvisning av en biotin-merket probe fremstille et anti-biotin-AP-konjugat oppløsning ved en 1: 4000 fortynning i blokkeringsbuffer.
- Inkuber embryo i det merkede anti-hapten-AP-løsning for 3 til 4 timer ved RT. Alternativt ruge O / N ved 4 ° C. Gjelder ikke alle tre antistoffer samtidig.
- For å fjerne ubundet antistoff vaskes embryoene med 1 x PBS, 0,1% Tween-20 for fire ganger i 15 min ved RT.
- For å endre buffersystemer varh to ganger 15 min ved RT i TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20).
6. alkalisk fosfatase Chromogenic Farging
- Etter antistoffpåvisning velge mellom STEP 6.1.1 til 6.1.4 og gå videre med en av alkalisk fosfatase kromogeniske fargings reaksjoner for å oppnå det ønskede fargesignal (se tabell 1). For hver runde av deteksjon en annen kromogent substrat reaksjon er brukt for å markere hver transkripsjon mønster i en annen farge.
- Fast Red Farging
- Vask embryoene to ganger i 15 minutter i TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% Tween-20).
- Mens vaske embryoer, forberede Fast Red fargeløsning fra Fast Red TR / NAMP Alkaline fosfatasesubstrat Tabletter Set.
- Løs opp en buffer tablett fra tablett satt i 1 ml destillert vann, og bland ved virvling for å oppnå 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
- Drop en Fast Red TR / NAMP tablett i forberedt Tris buffer og løses opp ved å virvle å oppnå Fast Red fargeløsning.
- Klar Fast Red fargeløsning fra ikke-oppløste partikler gjennom et 0,2 um sprøytefilter.
- Fast Blå Farging
- Vask to ganger embryoer i 15 minutter i frisk SB8.2 farging buffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- Mens vasking av embryoer, forberede Fast blå fargeløsning fra 50 mg / ml Fast blå BB (i DMF) og 50 mg / ml naftol-fosfat (i DMSO) stamløsninger.
- Tilbereder en vaskeekte blå BB løsning på 0,5 mg / ml i SB8.2.
- Tilbereder en separat naftol fosfatoppløsning på 0,5 mg / ml i SB8.2.
- Dråpevis legge den tilberedte naftolen fosfatoppløsning inn i Fast blå BB løsningen under konstant blanding med en vortex. Den resulterende endelige arbeidskonsentrasjon 0,25 mg / ml for begge substratkomponenter.
Merk: Ulike Fast Blå / naphthol phosphat kombinasjoner resulterer i forskjellige fargenyanser (se tabell 1).
- BCIP / NBT Farging
- Vask to ganger embryoer i 15 minutter i frisk SB9.5 farging buffer (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- For en purpleblue kromogenisk signal, fersk forberede BCIP / NBT farging løsning ved å legge en fil levamisole, 3,5 mL BCIP og 4,5 mL NBT per ml SB9.5 flekker buffer og bland godt.
- INT Farging
- Vask embryoene to ganger i 15 minutter i frisk SB9.5 flekker buffer.
- For en yellowbrown kromogenisk signal, fersk forberede INT farging løsning ved å legge en fil levamisole, 5 pl Magenta-Phos og 5 mL INT per ml SB9.5 flekker buffer og bland godt.
Merk: Alternativt kan du bruke 7,5 mL / ml BCIP / INT klar til bruk fargeløsning.
- Fast Red Farging
- For farging reaksjon overføre embryo prøvertil en 24-brønns plate. Inkuber hver prøve i 400 ul av den valgte fargeløsning som i mørket.
- Overvåke tidvis signalisere utvikling under en stereomikroskop. Stopp farvereaksjon når signalstyrken ønskede oppnås og før betydelig bakgrunnssignal blir observert.
- For å stoppe den kromogene reaksjonen, overføre farget embryoer inn innstikk av en 12-brønns plate som inneholder 2 ml TNT per brønn. Skyll de fargede embryoene to ganger i TNT.
- Vask embryoene to ganger i 10 minutter i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved romtemperatur fjerne gjenværende substrat.
7. Antistoff Fjerning / alkalisk fosfatase Inaktive
- Fjern antistoff og inaktiverer alkalisk fosfatase ved inkubering i 2 ml lav pH stoppløsning (0,1 M glycin-HCl pH 2,2, 0,1% Tween-20) i 10 minutter ved RT.
- Skyll i 1 min med 2 ml av 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved romtemperatur.
- Vask 3 ganger i 3 min i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 ved romtemperatur.
8. Second Detection Round
- For å oppdage fordelingen mønster av et sekund transkripsjon fortsette med antistoffpåvisning av hapten-merkede prober (trinn 5.1 til 5.4) ved hjelp av antistoff-AP konjugater rettet mot andre hapten-label.
- Utføre kromogent alkalisk fosfatase-farging (TRINN 6,1 til 6,5) påføring av et substrat kombinasjon som frembringer en kontrastfarge til den som ble benyttet i den første deteksjons runde (for forskjellige farger, se tabell 1).
- Fjerne andre antistoff-AP-konjugat, som beskrevet i trinn 7.1 til 7.3.
9. Tredje Detection Round
- For å påvise den fordelingsmønsteret av en tredje transkripsjon, fortsette med antistoff-påvisning av hapten-merkede prober (TRINN 5,1 til 5,4) ved bruk av antistoff-AP-konjugater som er spesifikt for den tredje hapten-merket.
- Utføre kromogent alkalisk fosfatase-farging (TRINN 06/01 til 06/05) påføre et substrat kombinasjon som ikke var aptrafikkert i de foregående deteksjons runder. Velg en kromogen reaksjon som produserer en farge fremskynde lett å skille fra de av de to foregående deteksjons runder (for fargevalg, se tabell 1).
10. Montering og bildebehandling
- Overfør riktig farget embryoer til 30% glycerol i PBS og inkuberes inntil embryoer er fullstendig fuktet i glyceroloppløsning. De er godt i likevekt når de synker til bunns.
- Overfør embryoene til 70% glyserol i H 2 O og la likevekt ved RT. De fargede Embryoene kan lagres i 70% glycerol ved 4 ° C.
- For montering, pipette farget embryo i en 70% glycerol dråpe på et objekt sklie og uten å berøre avstandsstykkene limt til lysbilde (figur 3). Påfør dekkglass.
- Vis montert embryoer under et disseksjonsmikroskop. Flytt påføres dekkglass, slik at embryoene drei til ønsket retning.
- Observere riktigorienterte embryoer med høy oppløsning (20X, 40X mål) under et sammensatt mikroskop med differensial Interference Contrast optikk.
- Ta bilder med et digitalt fargekamera og spare på digital lagringsenhet.
Representative Results
Den beskrevne protokoll tillater samtidig visualisering av flere transkriptmønstre i ulike farger. MC-WISH gir fordel å direkte sammenligne uttrykk mønstre av forskjellige gener i samme embryo. Som et eksempel, de uttrykk mønstre av tomme spiracles (EMS) 19, fushi tarazu (FTZ) 20 og slurvet paret en (slp1) 21 sammenlignet direkte i Drosophila melanogaster blastoderm scene embryoer og visualisert i en rekke fargenyanser (figur 4) .
Forskjellige AP substrat kombinasjoner er tilgjengelige for å oppnå et panel av kontrastfarger utfellinger (Tabell 1). Den røde fargen bunnfall som produseres av Fast Red, og den fiolette bunnfall fremstilt ved BCIP / NBT kan lett skilles og brukes derfor vanligstly i to-farge eksperimenter (Figur 4A). Imidlertid kan BCIP / NBT flekken fort bli til en ganske mørk farge, slik at Fast Rød farge er forkledd i tilfelle av delvis co-distribusjon av vitnemål. Derfor kan bruk av Fast blå være fordelaktig, som genererer blå, grønn og fiolett produkter i kombinasjon med NAMP, NAGP og NABP, henholdsvis (tabell 1). Kombinasjonen av Fast Blå med NAMP gir en lys blå farge som er lett synlige fra Fast Red produktet i tilgrensende eller overlappende uttrykk domener som vist her for EMS og slp1 uttrykk nettsider visualisert i rødt og blått, henholdsvis (figur 4b). Fast Blå NAGP kombinasjonen gir en tilsvarende sterk kontrast til Fast Red flekken, slik at den grønne EMS domenet er klart forskjellig fra den røde slp1 uttrykk området (Figur 4C). Men hvis EMS og slp1 uttrykk nettsteder er debeskyttes av Fast blå NABP og Fast Red, henholdsvis den resulterende fiolette og røde farge utfellinger er mindre synlige (figur 4D). Som nevnt ovenfor, Fast Red og Fast blå NAGP er lett å skille, som vist ved slp1 og FTZ ekspresjon i rødt og grønt, henholdsvis (figur 4D).
MagentaPhos i kombinasjon med INT frembringer et gult bunnfall, som brukes til å avsløre segmental ekspresjon av FTZ (figur 4C, E). Et gult bunnfall genererer god kontrast til de blå farget underlag som eksemplifisert ved påvisning av slp1 og FTZ med Fast Blå NAMP og MAG / INT, henholdsvis (figur 4E). Imidlertid er det gule bunnfall mindre lett skjelnes fra Fast Red produktet. Den gule farget uttrykk domene av EMS kan være knapt utmer nguished fra rostralt uttrykk for slp1 vist i rødt (figur 4F). Derfor har kombinasjonen av farge substrater velges nøye for hvert eksperiment.
Figur 1. Flytskjema av MC-WISH. For flerfarget visualisering av tre unike avskrift mønstre, velge mellom ulike antistoff-AP konjugater og farge underlaget kombinasjoner i hver deteksjon syklus. Forkortelser: AP, alkalisk fosfatase; BIO, biotin; DIG, digoxigenin; FLUO, fluorescein. For andre forkortelser se legender til figur 4 og tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
s / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg "/>
Figur 2. Setter som embryo bærere. (A) Setter montert på bunnen med polyester membraner av 15 mm diameter og 74 mikrometer maskevidde blir brukt som Drosophila embryo bærere. (B) Innsatsene er sammenstilt i 12-brønns plater, som virker som reservoar skuffer for de forskjellige oppløsninger. (C) Tilgjengelige bærere og håndtak tillate behandling av (D) 12 enheter / embryo prøver samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Montering av farget embryoer. Embryoet er montert i en dråpe av 70% glycerol mellom to stabler av dekkglass, som virker som avstandsstykker. Lett flytting av appløy store dekk bidrar til å rotere montert embryoer i ønsket retning for observasjon og fotografering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Multicolor visualisering av mRNA transkripter i Drosophila embryoer. Eksempler på MC-Wish eksperimenter i Drosophila embryoer blir vist fra sidevisninger Figur 4.. De mRNA uttrykk mønstre av tomme spiracles (EMS), fushi tarazu (Ftz) og slurvet med parvise 1 (slp1) er visualisert ved ulike AP fargeunderlagskombinasjoner, som er angitt på hvert panel. Transkripsjoner ble oppdaget av (A) FTZ FLUO og ems DIG, (
| Substratkombinasjonen | Legg til en ml AP buffer | Concentrasjon [ug / ml] | AP buffer | Farge | Signal følsomhet |
| BCIP NBT | 3,5 mL 4,5 mL | 175 337,5 | SB9.5 | lilla | +++ |
| MAG INT | 5 pl 5 pl | 250 250 | SB9.5 | gul | + |
| BCIP / INT stamløsning | 7,5 mL | 250 250 | SB9.5 | gul | + |
| Fast Blå NAMP | 5 pl 5 pl | 250 250 | SB8.2 | blå | ++ |
| Fast Blå NABP | 20 mL 10 pl | 1000 500 | SB8.2 | fiolett | ++ |
| Fast Blå NAGP | 10 mL 10 pl | 500 500 | TT8.2 | grønn | + |
| Fast Red NAMP | 1 tablett | 1000 400 | TT8.2 | rød | ++ |
Tabell 1. underlag kombinasjoner Forkortelser: +++, sterk;. ++, Medium; +, Svak NBT, 4-nitro-blå-tetrazoliumklorid; BCIP, 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat; INT, 2- (4-jodfenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5-fenyl-tetrazoliumklorid; MAG, Magenta-Phos, 5-brom-6-klor-3-indolyl-fosfat, NAMP, Naphthol-AS-MX-fosfat; NABP, Naphthol-AS-BI-fosfat; NAGP, Naphthol-AS-GR-fosfat; SB9.5, beising buffer ved pH 9,5; SB8.2, beising buffer ved pH 8,2; TT8.2, Tris-Tween-buffer ved pH 8,2.
Discussion
In situ hybridisering (ISH) med radioaktivt merkede nukleinsyreprober blir ofte brukt til å detektere lokalisering av RNA på vevssnitt. Den radioaktive ISH metoden er imidlertid tidkrevende, mindre følsom, og tillater ikke verdsettelse av komplette karakterfordelingsmønstre i hel-mounts. I kontrast, tillater heri beskrevet MC-WISH metoden direkte sammenligning av flere genuttrykk domener i kontrastfarger innen intakte embryoer. MC-WISH har den fordelen at histologisk sammenheng er umiddelbart tydelig og visualisert bare ved standard lysfelt mikroskopi. Dette gir mulighet for å relatere genekspresjon domener topografisk til hverandre med stor nøyaktighet og definere unike og overlappende uttrykk områder i en rask og pålitelig måte. På den annen side er multiplekset fluorescerende ISH (FISH) kraftigere med hensyn til sensitivitet og oppløsning, og blir fortrinnsvis anvendt, hvis mobil eller sub-cellulære reoppløsning av mRNA deteksjon er nødvendig.
Det brede spekteret av transkripter som er kartlagt ved MC-WISH tyder på at praktisk talt alle transkripsjon kan analyseres ikke bare i embryonale, men også i larver og voksne vev og i andre enn Drosophila arter. Faktisk, den beskrevne fremgangsmåten beskrevet her for Drosophila, fungerer på samme effektive med sebrafisk embryo 11,16,22. Videre kan MC-WISH metode tilpasses et bredt spekter av invertebrate og virveldyr embryoer og vevsprøve.
Haptenet-etiketter og probe konsentrasjoner
Vi bruker rutinemessig fluorescein, digoxigenin, og biotin som hapten etikettene av RNA-prober. Videre dinitrofenol-merkede prober kan påføres, som har blitt introdusert i sebrafisk WISH eksperimenter 23-25. Fluorescein-merkede prober vise en mindre følsomhet i forhold til de andre hapten-etiketter, slik som fluorescein er best brukes feller deteksjon av rikelig transkripsjoner. Hver nylig transkriberes sonden er først testet i en enkelt WISH eksperiment, der ytelsen blir evaluert bruker BCIP / NBT eller Fast Red som substrat. En sonde konsentrasjon anses som optimal når et sterkt signal uten bakgrunn utvikling er oppnådd innen minutter til noen få timer.
For å være sikker på at uttrykket domener av interesse har blitt oppdaget i sin fulle utstrekning av MC-WISH, er det viktig å visualisere hver transkripsjon mønster av single-label WISH eksperimenter med den mest sensitive underlaget kombinasjon, BCIP / NBT. Dette sikrer at svake uttrykk domener ikke blir oversett i multi-target eksperiment. For å kompensere for den mindre følsomhet av de andre underlagskombinasjoner er det viktig å bruke fordoblet (for å tredoblet) probe konsentrasjoner sammenlignet med standard BCIP / NBT farging.
Lav pH inaktive
Den lave pH-inaktiveringstrinnet kan føre tildelvis desintegrering av antisense-hapten-merket RNA-probe / forstand mRNA-hybrider som resulterer i redusert deteksjonssignal i den andre og tredje fargings runder. For å minimere tap i følsomhet, er inaktiveringsfremgangsmåten er så korte som mulig. Vi har erfart at en 10 minutters inkubering tid ved lav pH er tilstrekkelig for eliminering av AP-aktivitet. De påfølgende raske vasker i store volumer sikre rask fortynning av ubundet antistoff-AP konjugater og forhindre re-binding til haptenized sonder. Alternative prosedyrer inkluderer paraformaldehyde fiksering og varmeinaktivering. Imidlertid er noen av de farge utfellinger ikke varmestabile og paraformaldehyd fiksering kan ikke være tilstrekkelig for fullstendig inaktivering av AP. Ufullstendig inaktivering av det første påførte antistoff-AP-konjugat kan føre til gjen visualisering av mRNA mønster i det følgende deteksjons runde fører til falske positive overlapping i uttrykk med den andre mRNA-arter som skal påvises. Derfor, i et kontrolleksperiment the embryoer blir splittet i to fraksjoner etter inaktivering av det første påførte antistoff-AP-konjugatet. Det andre antistoff-AP-konjugat er utelatt fra styre fraksjon, og bør ikke produsere et signal i den andre fargereaksjon. Imidlertid, hvis den andre fargereaksjonen frembringer et signal fordelingsmønster som svarer til den første, og deretter inaktive prosedyren var ikke effektiv. I dette tilfellet bør inkubasjonstiden ved lav pH stoppløsning forlenges til neste eksperiment.
Bestillinger av AP underlaget søknad
Siden følsomheten synker med hver påfølgende runde av gjenkjenning, er det tilrådelig å oppdage mindre rikelig mRNA før mer rikelig transkripsjoner. I tillegg Fast Red og vaskeekte blå underlagskombinasjoner er betydelig mindre følsom enn den purpleblue BCIP / NBT flekken, slik at rask fargestoffer er fortrinnsvis påført i den første runden farging for deteksjon av det sterkere uttrykt transkripsjon. Dette også hsom den fordelen at en etterfølgende BCIP / NBT farging kan overvåkes og stoppes i tide før purpleblue signal blir for mørk i forhold til de lettere Fast fargestoffer. Dermed i en standard to-farge eksperiment, først sterkere uttrykt mRNA blir oppdaget av Fast Red og andre svakere en etter BCIP / NBT. Som et alternativ til de gule fargestoffer Fast INT underlagskombinasjoner kan anvendes, noe som imidlertid produserer utfellinger som blir diffunderer etter en tid. Derfor BCIP / INT utelukkende anvendes i den siste runden farging. Følgelig i en tre-farge eksperiment vi ofte først Fast Red, andre BCIP / NBT (eller Fast blå) og tredje en INT substrat kombinasjon. Legg merke til at det er tilrådelig å beiset embryoer så snart fotografere som mulig når du søker INT.
Fluorescerende påvisning av azofargestoffer
Det kan noen ganger være vanskelig å kjenne igjen overlappende uttrykk mønstre når en mørkere farge bunnfallet skygging en lettere en. Feller eksempel kan en sterkt utviklet BCIP / NBT utfelling maskere lettere Raske dye signaler. En måte å komme rundt dette problemet er å ta bilder umiddelbart etter hver farging og fjerne den påførte farge bunnfallet før neste deteksjon runde. I dette tilfellet, er alkohol-oppløselige azo-fargestoff (Fast Red) og INT bunnfall fjernes ved etanolvaskinger etter den første og andre deteksjons runder, henholdsvis, og BCIP / NBT flekker brukes som den siste AP-substrat 26. En annen mulighet er å dra nytte av de fluorescerende egenskapene til azofargestoffer. Fast Red kan visualiseres ved hjelp rhodamin filter setter 27, mens Fast Blå kan observeres med vidt røde filtre 28,29. Sammenligning eller overlapping av kromogene og fluoriserende bilder kan avsløre stedet for co-distribution.Using denne tilnærmingen, BCIP / NBT signal utvikling har å bli stoppet i tide, slik at det ikke blir for tett og slukke fluorescenssignalet av azo fargestoff reaksjonsproduktet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T.
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
