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Developmental Biology

मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय साबुत माउंट Published: January 31, 2016 doi: 10.3791/53830
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The Wenner-Gren Institute (MBW), Stockholm University

Summary

हम रंग अवक्षेप विषम द्वारा तीन अलग-अलग mRNA वितरण पैटर्न के एक साथ और विशिष्ट पहचान के लिए अनुमति देता बरकरार ड्रोसोफिला भ्रूण में एक बहु लक्ष्य वर्णजनीय पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण में (एम सी इच्छा) प्रक्रिया का वर्णन।

Abstract

भ्रूण विकास और यह ठीक विभिन्न जीनों बगल में एक दूसरे के स्थानिक संबंध में व्यक्त कर रहे हैं कि कैसे परिभाषित करने के लिए आवश्यक है जीवोत्पत्ति के दौरान सक्रिय जीन विनियामक नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए। मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण (एम सी इच्छा) यह एक ही नमूना नमूना में विषम रंगों में अलग mRNA प्रजातियों की विशिष्ट दृश्य की अनुमति देता के रूप में बहुत, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के त्वरित तुलना की सुविधा में। इस संभावना को उच्च सटीकता के साथ एक दूसरे के लिए भौगोलिक विवरण के अनुसार जीन अभिव्यक्ति डोमेन संबंधित करने के लिए और अद्वितीय और ओवरलैपिंग अभिव्यक्ति साइटों को परिभाषित करने के लिए प्रदान करता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम ड्रोसोफिला भ्रूण में विभिन्न जीनों की mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना के लिए एक एम सी-काश प्रक्रिया का वर्णन। तीन आरएनए जांच, प्रत्येक एक और जीन के लिए विशिष्ट है और एक अलग hapten द्वारा लेबल तक, भ्रूण के नमूने को एक साथ संकरित और बाद में क्षार से पता चला रहे हैंNE वर्णमिति इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री फॉस्फेट आधारित। वर्णित प्रक्रिया यहाँ ड्रोसोफिला के लिए विस्तृत है, लेकिन zebrafish भ्रूण के साथ समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है।

Introduction

सीटू संकरण (ISH) में कोशिकाओं, ऊतकों और जीवों 1 के भीतर एक रूपात्मक संदर्भ में पता लगाने और शाही सेना टेप के स्थानीयकरण, के लिए मानक तरीका है। ISH प्रक्रिया द्वारा उत्पादित संकेतों सामान्यतः, रेडियोधर्मी फ्लोरोसेंट और वर्णजनीय का पता लगाने प्रणालियों द्वारा कल्पना कर रहे हैं। हाल के वर्षों में फ्लोरोसेंट ISH में महत्वपूर्ण तकनीकी विकास (मछली) 2 एकल अणुओं 3,4 .While अप करने के लिए एकल कोशिका और उप सेलुलर स्तर और आरएनए दृश्य में पता लगाने और आरएनए अभिव्यक्ति के quantitation अनुमति देता है, नाटकीय रूप से सुधार संवेदनशीलता और संकल्प के परिणामस्वरूप परिष्कृत एकल अणु मछली तरीकों को और अधिक विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, वर्णजनीय ISH अनुसंधान और नैदानिक ​​निदान में सीटू का पता लगाने विधि में एक नियमित आरएनए के रूप में व्यापक है। वर्णजनीय का पता लगाने के लिए एंजाइम वर्षा प्रतिक्रियाओं स्थलों पर विषम रंगों में दिखाई दे उत्पादों उत्पन्न है, जो इस्तेमाल कर रहे हैंसंकरण 5 की। यह आरएनए दृश्य दिनचर्या ऊतकीय दाग और रूपात्मक संदर्भ के साथ जोड़ा जा सकता है कि लाभ मानक brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा तुरंत स्पष्ट है है। इसके अलावा, लागू रंग substrates के कई स्थायी नमूना तैयारियों 5 प्राप्त किया जा सकता है, ताकि जैविक और / या जलीय बढ़ते मीडिया में स्थिर रहे हैं जो अवक्षेप, उत्पादन।

ड्रोसोफिला में, प्रारंभिक ISH प्रोटोकॉल sectioned सामग्री 6 पर प्रतिलेख का पता लगाने के लिए रेडियो आइसोटोप लेबल जांच लागू होता है। यह ऊतक वर्गों से पूरे भ्रूण या अंग प्रणालियों की पूरी प्रतिलेख पैटर्न को फिर से संगठित करने के लिए मुश्किल है, वहीं गैर-radioactively लेबल जांच के साथ वर्णजनीय ISH प्रक्रियाओं के आवेदन के लिए यह संभव पूरे आरोह 7 में शाही सेना वितरण का पता लगाने के लिए विश्व स्तर पर बनाता है। वर्णजनीय ISH के कई रूपों मौजूद हैं, ठेठ में सीटू संकरण (इच्छा) प्रोटोकॉल hyb में पूरे माउंटridized hapten लेबल जांच विरोधी hapten एंटीबॉडी एक पत्रकार एंजाइम संयुग्मित और mRNA टेप एक precipitating वर्णकोत्पादक द्वारा कल्पना कर रहे हैं से पता चला रहे हैं।

संवाददाता द्वारा उत्पादित अलग रंग अवक्षेप की पट्टी alkaline फॉस्फेट (एपी), हॉर्सरैडिश peroxidase (पॉड), और बीटा galactosidase (लड़की) से एक में कई लक्ष्यों के विशिष्ट पता लगाने और एक ही नमूना 8-14 के लिए अनुमति देता है एंजाइमों। हालांकि, पॉड enzymatic गतिविधि केवल एक सीमित समय अवधि के लिए रहता है और अतिरिक्त (tyramide) संकेत प्रवर्धन 15 कम प्रचुर मात्रा में टेप का पता लगाने के लिए इन एंजाइमों के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकता है बिना इतना है कि लड़की वर्णमिति प्रतिक्रिया है, कुछ हद तक कम संवेदनशील है। इसके विपरीत, एपी के स्थायी गतिविधि लंबे समय से स्थायी सब्सट्रेट कारोबार और उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए अनुमति देता है। इसलिए, अलग रंग substrates के साथ एपी रिपोर्टर एंजाइम का उपयोग अनुक्रमिक का पता लगाने के लिए प्रभावी करने में सफल साबित हो गया है औरएकल भ्रूण 10-12,16 में करने के लिए तीन अलग-अलग टेप की विशिष्ट पहचान।

इस बहु लक्ष्य वर्णजनीय इच्छा (एम सी इच्छा) विधि (चित्रा 1) 14 के लिए, लेबल antisense शाही सेना जांच में इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं और उपलब्ध hapten-लेबल के साथ चिह्नित। भ्रूण फॉर्मेल्डीहाइड तय की और मेथनॉल उपचार और proteinase कश्मीर पाचन द्वारा permeabilized हैं। भ्रूण के संकरण एक साथ करने के लिए तीन अलग लेबल antisense शाही सेना जांच के लिए एक अलग जीन के लिए प्रत्येक विशिष्ट साथ किया जाता है। तंगी washes के द्वारा अनबाउंड जांच को हटाने के बाद प्रत्येक hapten-लेबल का पता लगाने का एक अलग दौर में कल्पना की है। एक एकल का पता लगाने दौर एक स्थानीय स्थिर रंग वेग पैदा करता है कि एक एपी सब्सट्रेट के आवेदन के द्वारा एपी और आरएनए दृश्य करने के लिए मिलकर एक विरोधी hapten एंटीबॉडी के साथ भ्रूण की ऊष्मायन के होते हैं। एंटीबॉडी का पता लगाने और धुंधला, लागू एंटीबॉडी एपी conju के बादगेट एक कम पीएच धोने से निकाल दिया जाता है। बहुरंगा प्रयोगों में, पता लगाने के प्रत्येक दौर के एक अलग hapten-लेबल के खिलाफ लक्षित एक एंटीबॉडी को रोजगार और प्रत्येक प्रतिलिपि पैटर्न एक अलग रंग सब्सट्रेट (1 टेबल) द्वारा कल्पना की है। भ्रूण ग्लिसरॉल में मुहिम शुरू की और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी का उपयोग कर एक उच्च संकल्प यौगिक खुर्दबीन के नीचे imaged हैं।

Protocol

इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा शाही सेना जांच के 1. लेबलिंग

  1. RNase मुक्त परिस्थितियों में एक 1.5 मिलीलीटर microtube में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया इकट्ठा: 10.5 μl DEPC इलाज एच 2 हे, 4.0 μl 5x प्रतिलेखन बफर, 1.0 μl DEPC इलाज एच 2 ओ में (1 माइक्रोग्राम) linearized, शुद्ध टेम्पलेट डीएनए, 1.3 μl एनटीपी मिश्रण, 0.7 μl hapten लेबल UTP, 0.5 μl RiboLock आरएनए अवरोध, 2.0 μl आरएनए पोलीमर्स।
    नोट: अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 20 μl है।
  2. टेम्पलेट के प्रमोटर अनुक्रम का उपयोग T7 पर निर्भर करता है, इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए T3 या SP6 शाही सेना पोलीमरेज़ (17 संदर्भ देखें)।
  3. आरएनए जांच के लिए लेबल के रूप में digoxigenin-11-UTP, बायोटिन-16-UTP है, या fluorescein-12-UTP का चयन करें। अधिक जानकारी के लिए चर्चा में Hapten-लेबल और जांच सांद्रता की चर्चा देखें।
  4. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण और शीघ्र ही नीचे स्पिन।
  5. नक़ल करते हैं37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए।
  6. , टेम्पलेट डीएनए को हटाने के लिए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए 1 μl RNase मुक्त DNase मैं जोड़ मिश्रण अच्छी तरह से, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. DEPC इलाज एच 2 ओ 200 μl के लिए नमूना मात्रा के साथ समायोजित करें।
  8. लेबल शाही सेना जांच के वेग के लिए 100 μl (0.5 खंड) 7.5 एम अमोनियम एसीटेट और 600 μl (3 खंड) इथेनॉल जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    1. इस अनिगमित न्यूक्लियोटाइड के अवांछित वर्षा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, के रूप में ठंडा इथेनॉल का प्रयोग न करें।
  9. 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अधिकतम गति (20,800 XG) में तापमान नियंत्रित सेंट्रीफ्यूज में लिखित आरएनए स्पिन। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
  10. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,800 XG पर 70% आरटी पर इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के साथ जिसके परिणामस्वरूप गोली धो लें।
  11. तैरनेवाला निकालें और गलती से ढीला गोली महाप्राण के लिए नहीं सावधान रहना होगा। आरटी पर कुछ मिनट के लिए खोला ढक्कन के साथ microtube में गोली हवा शुष्क करते हैं।
  12. जिलेDEPC इलाज एच 2 ओ के 100 μl में प्राप्त गोली का समाधान
  13. -20 डिग्री सेल्सियस पर 300 μl पूर्व संकरण बफर जोड़ें (50% / खंड खंड विआयनीकृत formamide, 5x एसएससी, 50 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन सोडियम नमक, 0.1% / खंड खंड बीच -20, 5 मिलीग्राम / एमएल torula आरएनए) और दुकान । जांच -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लंबी अवधि के हो सकते हैं।
    नोट: 100 μl संकरण बफर में नव लिखित जांच पतला 3 μl hapten लेबल शाही सेना जांच के पहले टेस्ट मैच के लिए इच्छा के प्रयोग के लिए अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए।

इंसर्ट का उपयोग भ्रूण नमूने की 2. प्रसंस्करण

नोट: विभिन्न ऊष्मायन कदम के माध्यम से भ्रूण के प्रसंस्करण के लिए microtubes या बहु अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर गलती से समाधान के आदान-प्रदान के दौरान उन्हें aspirating द्वारा भ्रूण के महत्वपूर्ण मात्रा में खोने का जोखिम भालू। इस नुकसान से बचने के लिए, यह प्रक्रिया के माध्यम से भ्रूण के नमूने ले जाने के लिए (जैसे Netwell सम्मिलित करता है) के रूप में की टोकरियों का उपयोग करने के लिए सहायक हो सकता है। इन में polystyrene हैंभ्रूण प्रसंस्करण के दौरान आराम जिस पर नीचे (2A चित्रा) पर एक पॉलिएस्टर जाल, साथ serts।

  1. काश प्रक्रिया में भ्रूण प्रसंस्करण के लिए, एक 12 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 2 बी) में सम्मिलित करता इकट्ठा और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए उचित समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. एक नीले रंग की टिप का उपयोग आवेषण में भ्रूण पिपेट। सभी भ्रूण तरल में डूबे हुए हैं कि सुनिश्चित करें।
  3. ऊष्मायन समय जगह पर अगले कदम के लिए समाधान के साथ भरा जाता है, जो एक और 12 अच्छी तरह से थाली में भ्रूण युक्त सम्मिलित करता है जब।
    1. (चित्रा -2) और (चित्रा 2 डी) के लिए एक समाधान से एक समय में 12 नमूनों को हस्तांतरण करने के लिए वाहक और हैंडल का प्रयोग करें।
      नोट:, आवश्यक मात्रा को कम धुंधला प्रतिक्रियाओं (6.2 कदम) के लिए पूर्व संकरण / संकरण कदम (4.1 कदम देखें) और 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 2.0 मिलीलीटर microtubes का उपयोग करें। संकरण और धुंधला प्रतिक्रियाओं 100 के संस्करणों में प्रदर्शन कर रहे हैं1, एल के साथ क्रमश: 400 μl।

संकरण के लिए भ्रूण की 3. तैयारी

  1. , Dechorionate लीजिए, ठीक है, और मानक प्रक्रियाओं 14,18 का उपयोग भ्रूण devitellinize। तैयार भ्रूण नियमित रूप से -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में जमा हो जाती है।
  2. स्थानांतरण भ्रूण आरटी के लिए स्वस्थानी संकरण में के लिए इस्तेमाल किया है और अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर मेथनॉल से भरा एक 12 अच्छी तरह से थाली के सम्मिलित में वितरित किया जाना है।
  3. आरटी पर एक कम मेथनॉल श्रृंखला के माध्यम से भ्रूण rehydrate। (मैं) 1x पीबीएस में 1x पीबीएस (द्वितीय) 50% मेथनॉल में 75% मेथनॉल, बीच -20 (iii) 1x पीबीएस में 25% मेथनॉल, 0.1% बीच 20 (चतुर्थ 0.1%: 3 मिनट में के लिए भ्रूण हर बार सेते ) 1x पीबीएस, 0.1% बीच 20 (v) पीबीएस 1x, 0.1% बीच 20।
  4. आरटी पर 20 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde में भ्रूण पूर्व तय कर लो।
  5. आरटी पर 1x पीबीएस में 3 मिनट, 0.1% बीच-20 के लिए 4 washes के द्वारा लगानेवाला निकालें। इस बीच पिघलना और proteinase कश्मीर और ग्लाइसिन काम कर समाधान तैयार करते हैं।
    6. नोट: proteinase कश्मीर उपचार भ्रूण निर्धारण की ताकत को संतुलित है। पूर्व निर्धारण कदम (3.4) को छोड़ा जाता है, तो उदाहरण के लिए, नरम proteinase कश्मीर उपचार लागू किया जा सकता है।
  6. 0.1% बीच 20 आरटी पर 2 मिलीग्राम / 1x पीबीएस में मिलीलीटर ग्लाइसिन में दो 1 मिनट rinses द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो।
  7. आरटी पर 20 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde में भ्रूण पोस्ट-ठीक।
  8. बाद में, आरटी पर 1X पीबीएस में 3 मिनट, 0.1% बीच-20 के लिए धोने से चार बार paraformaldehyde लगानेवाला हटा दें।
  9. स्थानांतरण के बाद तय भ्रूण पूर्व संकरण करने के लिए बफर। पूर्व संकरण बफर में स्टोर भ्रूण -20 डिग्री सेल्सियस पर या सीधे जांच के संकरण के साथ आगे बढ़ना।

जांच के 4. संकरण

  1. स्थानांतरण भ्रूण आरटी के लिए पूर्व संकरण बफर में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। 2.0 मिलीलीटर microtub में पूर्व संकरण बफर में भ्रूण बांटोतों।
  2. कम से कम 30 मिनट के लिए, पूर्व संकरण बफर में 65 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण नमूने पूर्व संकरण।
    नोट: पूर्व संकरण और संकरण के लिए एक waterbath प्रयोग किया जाता है कदम। पूर्व संकरण के दौरान तीन antisense शाही सेना जांच, प्रत्येक एक अलग जीन प्रतिलेख के लिए विशिष्ट है और एक अलग hapten के साथ लेबल तक के संयोजन से जांच मिश्रण तैयार करने के लिए समय नहीं है।
  3. जांच के मिश्रण प्राप्त करने के लिए, 100 μl संकरण बफर (50% / खंड खंड विआयनीकृत formamide, 5x एसएससी, 50 माइक्रोग्राम / एमएल में प्रत्येक वांछित मूल hapten लेबल antisense शाही सेना जांच के लिए (आमतौर पर 1 μl μl से 6 के बीच) एक साथ उचित मात्रा में जोड़ने हेपरिन सोडियम नमक, 0.1% / खंड खंड बीच -20, 5 मिलीग्राम / एमएल torula आरएनए, 5% wt / खंड dextran सल्फेट)।
    नोट: dextran सल्फेट के अलावा वैकल्पिक है।
  4. 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक में antisense शाही सेना जांच मिश्रण denature। इसके बाद 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सीधे विकृत जांच मिश्रण हस्तांतरण।
  5. पूर्व संकरण के सबसे निकालेंभ्रूण के नमूनों से बफर और विकृत जांच मिश्रण जोड़ें।
  6. भ्रूण के नमूने 65 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हे / एन की जांच के लिए संकरण करते हैं।
    नोट: 55 डिग्री सेल्सियस और 65 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान लेकर नियमित रूप से संकरण, पूर्व और बाद के संकरण कदम के लिए उपयोग किया जाता है। 65 डिग्री सेल्सियस पर संकरण सबसे कड़े शर्तों प्रदान करता है और कम तापमान का उपयोग करते समय पृष्ठभूमि समस्याओं के मामले में सिफारिश की है। कोई पृष्ठभूमि समस्याओं, बढ़ाया सिग्नल की शक्ति और बेहतर भ्रूण अखंडता का लाभ प्रदान करता है जो 55 डिग्री सेल्सियस पर संकरण की सिफारिश की है, अगर वहाँ रहे हैं।
  7. अगली सुबह, पहले सुनिश्चित करें कि वे समय में सही तापमान पर गरम कर रहे हैं कि बनाने के लिए, 65 डिग्री सेल्सियस के लिए तंगी धोने समाधान हस्तांतरण।
  8. 2 मिलीलीटर पूर्व गर्म संकरण धोने बफर युक्त एक 12 अच्छी तरह से थाली के सम्मिलित में 2.0 मिलीलीटर microtubes से भ्रूण के साथ स्थानांतरण संकरण जांच मिश्रण (2 × एसएससी में 50% formamide, 0.1% बीच 20)। उन्हें युक्त 12 अच्छी तरह से थाली प्लेसएक ओवन में Bryo नमूने और 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. 2 मिलीलीटर नया संकरण धोने बफर करने के लिए स्थानांतरण भ्रूण के नमूने और 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। एक बार फिर इस चरण को दोहराएँ।
  10. 2 × एसएससी में एक बार, 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट washes के द्वारा अतिरिक्त जांच निकालने, 0.1% बीच 20 और 0.2 × एसएससी में तीन बार, 0.1% बीच 20।
  11. पीबीएस, बीच -20 आरटी पर 0.1% 1x करने के लिए भ्रूण नमूने स्थानांतरण।
  12. आरटी पर कम से कम 30 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध (1x पीबीएस, 0.1% बीच 20 में 8% भेड़ सीरम) में भ्रूण सेते हैं।

Hapten लेबल जांच की 5. एंटीबॉडी का पता लगाने

नोट: सभी तीन अलग लेबल जांच का एक साथ संकरण के विपरीत, हर जांच एंटीबॉडी ऊष्मायन और धुंधला के अलग-अलग दौर में एक के बाद एक का पता चला है। इसलिए, प्रत्येक का पता लगाने के दौर में केवल एक एंटीबॉडी प्रयोग किया जाता है (विरोधी digoxigenin-एपी या विरोधी fluorescein-एपी या विरोधी बायोटिन एपी या तो)।

  1. कदम के बीच चुनें5.1.1 5.1.3 और पता लगाया जा रहा है कि hapten-लेबल के अनुसार उचित एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी के साथ आगे बढ़ने के लिए।
    नोट: अलग लेबल जांच के अनुक्रमिक का पता लगाने के लिए, एक और विरोधी hapten एंटीबॉडी प्रत्येक पता लगाने के चक्र में लागू किया जाता है।
    1. बफर अवरुद्ध में 4,000: एक fluorescein-लेबल जांच का पता लगाने को कमजोर के लिए विरोधी fluorescein-एपी 1 conjugates।
    2. बफर अवरुद्ध में 4,000: एक digoxigenin लेबल जांच का पता लगाने को कमजोर के लिए विरोधी digoxigenin-एपी 1 conjugates।
    3. बफर अवरुद्ध में 4,000 कमजोर पड़ने: एक बायोटिन लेबल जांच का पता लगाने के लिए एक 1 पर एक विरोधी बायोटिन एपी संयुग्म समाधान तैयार है।
  2. आरटी पर 3 घंटा 4 के लिए चयनित विरोधी hapten-एपी समाधान में भ्रूण सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक साथ सभी तीन एंटीबॉडी लागू न करें।
  3. अनबाउंड एंटीबॉडी को दूर करने के लिए 1x पीबीएस, आरटी पर 0.1% बीच 20 बार 4 के लिए 15 मिनट के साथ भ्रूण धो लें।
  4. बफर सिस्टम को बदलने के लिए थाटीएनटी में आरटी पर ज दो बार 15 मिनट (8.0 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 0.1 एम NaCl, 0.1% बीच 20)।

6. alkaline फॉस्फेट वर्णजनीय धुंधला

  1. एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए बाद में (देखें तालिका 1) 6.1.4 करने के लिए कदम 6.1.1 के बीच चयन और इच्छित रंग संकेत प्राप्त करने के लिए alkaline फॉस्फेट वर्णजनीय धुंधला प्रतिक्रियाओं में से एक के साथ आगे बढ़ना। पता लगाने के प्रत्येक दौर के लिए एक अलग वर्णजनीय सब्सट्रेट प्रतिक्रिया एक और रंग में प्रत्येक प्रतिलिपि पैटर्न को उजागर करने के लिए लागू किया जाता है।
    1. फास्ट लाल धुंधला
      1. TT8.2 में 15 मिनट (0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 8.2, 0.1% बीच 20) के लिए भ्रूण दो बार धोएं।
      2. भ्रूण धोने जबकि, फास्ट लाल टी.आर. / NAMP alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट टेबलेट सेट से फास्ट लाल धुंधला समाधान तैयार करते हैं।
      3. आसुत जल 1 मिलीलीटर में सेट गोली से एक बफर गोली भंग और 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 8.2 प्राप्त करने के लिए vortexing द्वारा मिश्रण।
      4. तैयार टी में एक फास्ट लाल टी.आर. / NAMP गोली गिराआरआईएस बफर और फास्ट लाल धुंधला समाधान प्राप्त करने के लिए vortexing द्वारा भंग।
      5. 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गैर-भंग कणों से साफ फास्ट लाल धुंधला समाधान।
    2. फास्ट ब्लू धुंधला
      1. ताजा SB8.2 धुंधला बफर में 15 मिनट के लिए भ्रूण दो बार धो (0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 8.2, 0.1 एम NaCl, 0.05 एम 2 MgCl, 0.1% बीच 20)।
      2. भ्रूण धोने जबकि, 50 मिलीग्राम / (DMF में) मिलीलीटर फास्ट ब्लू बी बी और (DMSO में) 50 मिलीग्राम / एमएल naphthol फॉस्फेट शेयर समाधान से फास्ट ब्लू धुंधला समाधान तैयार है।
      3. हौसले SB8.2 में 0.5 मिलीग्राम / एमएल में एक तेजी से ब्लू बी बी समाधान तैयार है।
      4. हौसले SB8.2 में 0.5 मिलीग्राम / एमएल पर एक अलग naphthol फॉस्फेट समाधान तैयार है।
      5. एक भंवर के साथ लगातार मिश्रण के तहत तेजी से ब्लू बी बी समाधान में तैयार naphthol फॉस्फेट समाधान जोड़ने dropwise। जिसके परिणामस्वरूप अंतिम काम एकाग्रता दोनों सब्सट्रेट घटकों के लिए मिलीलीटर 0.25 मिलीग्राम / है।
        नोट: अलग फास्ट ब्लू / naphthol phospनफरत संयोजन अलग रंग रंग (देखें तालिका 1) में परिणाम।
    3. BCIP / एनबीटी धुंधला
      1. ताजा SB9.5 धुंधला बफर में 15 मिनट के लिए भ्रूण दो बार धो (0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 9.5, 0.1 एम NaCl, 0.05 एम 2 MgCl, 0.1% बीच 20)।
      2. एक purpleblue वर्णजनीय संकेत के लिए, हौसले से 1 μl levamisole, 3.5 μl BCIP और SB9.5 धुंधला बफर के प्रति मिलीलीटर 4.5 μl एनबीटी जोड़कर BCIP / एनबीटी धुंधला समाधान तैयार है और अच्छी तरह मिला लें।
    4. INT धुंधला
      1. ताजा SB9.5 धुंधला बफर में 15 मिनट के लिए भ्रूण दो बार धोएं।
      2. एक yellowbrown वर्णजनीय संकेत के लिए, हौसले से 1 μl levamisole, 5 μl मैजेंटा-फॉसफोरस और SB9.5 धुंधला बफर के प्रति मिलीलीटर 5 μl INT जोड़कर INT धुंधला समाधान तैयार है और अच्छी तरह मिला लें।
        नोट: वैकल्पिक 7.5 μl / एमएल BCIP / int तैयार करने के लिए उपयोग धुंधला समाधान का उपयोग करें।
  2. धुंधला प्रतिक्रिया हस्तांतरण भ्रूण नमूने लिए24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए। अंधेरे में चुना धुंधला समाधान के 400 μl में प्रत्येक नमूना सेते हैं।
  3. एक stereomicroscope के तहत विकास का संकेत कभी-कभी की निगरानी करें। वांछित सिग्नल की शक्ति प्राप्त है और महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि संकेत मनाया जाता है से पहले किया जाता है जब धुंधला प्रतिक्रिया बंद करो।
  4. , वर्णजनीय प्रतिक्रिया को रोकने के प्रति अच्छी तरह 2 मिलीलीटर टीएनटी युक्त एक 12 अच्छी तरह से थाली के सम्मिलित में सना हुआ भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए। टीएनटी में दाग भ्रूण दो बार कुल्ला।
  5. 1 × पीबीएस में 10 मिनट के लिए भ्रूण दो बार धोएं, आरटी पर 0.1% बीच 20 अवशिष्ट सब्सट्रेट दूर करने के लिए।

7. एंटीबॉडी हटाने / क्षारीय फॉस्फेट निष्क्रियता

  1. एंटीबॉडी निकालें और आरटी पर 10 मिनट के लिए कम पीएच स्थान पर समाधान (0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल पीएच 2.2, 0.1% बीच 20) के 2 मिलीलीटर में ऊष्मायन द्वारा alkaline फॉस्फेट निष्क्रिय।
  2. आरटी पर 1 × पीबीएस के 2 मिलीलीटर, 0.1% बीच 20 से 1 मिनट के लिए कुल्ला।
  3. 1 × पीबीएस में 3 मिनट के लिए 3 बार धोएं, 0.1% बीच 20 आरटी पर।

8. दूसरे का पता लगाने दौर

  1. एक दूसरी प्रतिलिपि के वितरण पैटर्न का पता लगाने के लिए दूसरा hapten-लेबल के खिलाफ लक्षित एंटीबॉडी एपी conjugates का उपयोग कर hapten लेबल जांच (स्टेप 5.1-5.4) के एंटीबॉडी का पता लगाने के साथ आगे बढ़ना।
  2. Alkaline फॉस्फेट वर्णजनीय धुंधला (स्टेप 6.1-6.5) (उपलब्ध रंगों 1 टेबल देखें) पहले पता लगाने के दौर में इस्तेमाल करने के लिए एक विषम रंग का उत्पादन एक सब्सट्रेट संयोजन को लागू प्रदर्शन करते हैं।
  3. 7.3 करने के लिए कदम 7.1 में वर्णित के रूप में दूसरी एंटीबॉडी एपी संयुग्म निकालें।

9. तीसरा जांच दौर

  1. एक तिहाई प्रतिलेख के वितरण पैटर्न का पता लगाने के क्रम में, एंटीबॉडी एपी तीसरे hapten-लेबल के लिए विशिष्ट conjugates का उपयोग कर hapten लेबल जांच के एंटीबॉडी का पता लगाने (स्टेप 5.1-5.4) के साथ आगे बढ़ना है।
  2. Alkaline फॉस्फेट वर्णजनीय धुंधला (स्टेप 6.1-6.5) एपी नहीं था कि एक सब्सट्रेट संयोजन को लागू प्रदर्शन करनापिछले पता लगाने के दौर में plied। एक रंग में पिछले दो का पता लगाने के दौर के उन लोगों से अलग करने के लिए आसान वेग का उत्पादन एक वर्णजनीय प्रतिक्रिया चुनें (रंग पसंद के लिए 1 टेबल देखें)।

10 बढ़ते और इमेजिंग

  1. पीबीएस में 30% ग्लिसरॉल करने के लिए ठीक से सना हुआ भ्रूण स्थानांतरण और भ्रूण पूरी तरह से ग्लिसरॉल समाधान में भिगो कर रहे हैं जब तक सेते हैं। वे नीचे सिंक जब वे अच्छी तरह से equilibrated कर रहे हैं।
  2. एच 2 ओ में 70% ग्लिसरॉल के लिए स्थानांतरण भ्रूण और आरटी पर संतुलित करना। दाग भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% ग्लिसरॉल में संग्रहित किया जा सकता है।
  3. बढ़ते के लिए, पिपेट एक वस्तु स्लाइड पर और स्लाइड (चित्रा 3) से चिपके स्पेसर को छूने के बिना एक 70% ग्लिसरॉल छोटी बूंद में भ्रूण दाग। कवर पर्ची लागू करें।
  4. देखें एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण मुहिम शुरू की। भ्रूण वांछित उन्मुखीकरण के लिए बारी बारी से इतना है कि, लागू कवर पर्ची ले जाएँ।
  5. ठीक से निरीक्षणविभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट प्रकाशिकी के साथ एक यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत उच्च संकल्प (20X, 40X उद्देश्यों) पर उन्मुख भ्रूण।
  6. एक डिजिटल कैमरा रंग के साथ छवियों पर कब्जा है और डिजिटल भंडारण उपकरण पर बचाने के लिए।

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल अलग अलग रंग में कई प्रतिलेख पैटर्न के एक साथ दृश्य के लिए अनुमति देता है। एम सी-काश सीधे ही भ्रूण में विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना करने के लिए लाभ प्रदान करता है। एक उदाहरण के रूप में, खाली spiracles की अभिव्यक्ति पैटर्न (ईएमएस) 19, Fushi तराजू (एफटीजेड) 20 और मैला बनती 1 (slp1) 21 सीधे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर निषिक्त चरण भ्रूण में की तुलना में और रंग रंग की एक किस्म में कल्पना कर रहे हैं (चित्रा 4) ।

विभिन्न एपी सब्सट्रेट संयोजन रंग अवक्षेप (तालिका 1) विषम के एक पैनल प्राप्त करने के लिए उपलब्ध हैं। फास्ट लाल और BCIP / एनबीटी द्वारा उत्पादित बैंगनी वेग द्वारा उत्पादित लाल रंग वेग आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और इसलिए सबसे आम इस्तेमाल कर रहे हैंदो रंग प्रयोगों में Ly (चित्रा 4 क)। फास्ट लाल रंग टेप की आंशिक सह वितरण के मामले में प्रच्छन्न है इतना है कि हालांकि, BCIP / एनबीटी दाग ​​जल्दी से, बल्कि एक काले रंग में बदल सकते हैं। इसलिए, फास्ट ब्लू के आवेदन NAMP, NAGP और NABP, क्रमशः (तालिका 1) के साथ संयोजन में, नीले, हरे और बैंगनी उत्पादों उत्पन्न करता है जो लाभ के लिए किया जा सकता है। NAMP के साथ फास्ट ब्लू के संयोजन ईएमएस और क्रमश: लाल और नीले रंग में कल्पना की slp1 अभिव्यक्ति साइटों (चित्रा 4 बी) के लिए यहां के रूप में दिखाया आसन्न या अतिव्यापी अभिव्यक्ति डोमेन में फास्ट लाल उत्पाद से आसानी से साफ़ है कि एक हल्के नीले रंग देता है। हरी ईएमएस डोमेन स्पष्ट रूप से लाल slp1 अभिव्यक्ति साइट (चित्रा 4C) से विशिष्ट है कि इतनी तेजी से ब्लू NAGP संयोजन, फास्ट लाल दाग के लिए एक समान मजबूत विपरीत प्रदान करता है। हालांकि, ईएमएस और slp1 अभिव्यक्ति साइटों डी कर रहे हैं, तोफास्ट ब्लू NABP और फास्ट लाल द्वारा tected, क्रमशः, जिसके परिणामस्वरूप बैंगनी और लाल रंग अवक्षेप (चित्रा 4D) कम प्रत्यक्ष कर रहे हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख लाल और हरे रंग, क्रमशः (चित्रा 4D) में slp1 और एफटीजेड अभिव्यक्ति के रूप में दिखाया, फास्ट लाल और फास्ट ब्लू NAGP भेद करने के लिए आसान कर रहे हैं।

Int के साथ संयोजन में MagentaPhos एफटीजेड की कमानी अभिव्यक्ति (चित्रा 4C, ई) प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो एक पीले रंग की तलछट, पैदा करता है। पीले रंग का वेग तेज ब्लू NAMP और क्रमशः (चित्रा 4E) पत्रिका / पूर्णांक, साथ slp1 और एफटीजेड का पता लगाने के द्वारा उदाहरण के रूप में नीले रंग का substrates के लिए अच्छा विपरीत उत्पन्न करता है। हालांकि, पीला वेग फास्ट लाल उत्पाद से कम आसान नमूदार है। ईएमएस के पीले दाग अभिव्यक्ति डोमेन शायद ही disti किया जा सकता है लाल (चित्रा 4F) में दिखाया गया slp1 का व्याख्यान चबूतरे अभिव्यक्ति से nguished। इसलिए, रंग substrates के संयोजन ध्यान से एक प्रयोग के लिए चुना जाना है।

आकृति 1
चित्रा एम सी इच्छा 1. फ़्लोचार्ट। तीन अद्वितीय प्रतिलेख पैटर्न की बहुरंगी दृश्य के लिए, प्रत्येक का पता लगाने के चक्र में विभिन्न एंटीबॉडी एपी conjugates और रंग सब्सट्रेट संयोजनों के बीच चुनें। लघुरूप: एपी, alkaline फॉस्फेट; जैव, बायोटिन; डीआईजी, digoxigenin; FLUO, fluorescein। अन्य संक्षिप्त रूपों महापुरूष 4 और 1 टेबल चित्रा के लिए देखते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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भ्रूण वाहक के रूप में चित्रा 2 इंसर्ट। (ए) 15 मिमी व्यास और 74 माइक्रोन जाल आकार की पॉलिएस्टर झिल्ली के साथ नीचे फिट इंसर्ट ड्रोसोफिला भ्रूण वाहक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। (बी) सम्मिलित करता विभिन्न समाधान के लिए जलाशय ट्रे के रूप में कार्य है, जो 12 अच्छी तरह प्लेटें, में इकट्ठा कर रहे हैं। (सी) उपलब्ध वाहक और संभालती 12 सम्मिलित करता है / भ्रूण नमूने एक साथ। (डी) के प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
दाग भ्रूण की चित्रा 3. बढ़ते। भ्रूण spacers के रूप में जो कार्य coverslips के दो ढेर के बीच 70% ग्लिसरॉल की एक बूंद में बढ़ रहे हैं। एप्लिकेशन का कोमल चलतीझूठ बोला बड़े coverslip के अवलोकन और फोटोग्राफी के लिए वांछित अभिविन्यास में घुड़सवार भ्रूण बारी बारी से करने में मदद करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4। ड्रोसोफिला भ्रूण में mRNA टेप की बहुरंगा दृश्य। ड्रोसोफिला भ्रूण में एम सी-काश प्रयोगों के उदाहरण पार्श्व विचारों से दिखाए जाते हैं। खाली spiracles की mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न (ईएमएस), Fushi तराजू (एफटीजेड) और मैला बनती 1 (slp1) प्रत्येक पैनल पर संकेत कर रहे हैं, जो विभिन्न एपी रंग सब्सट्रेट संयोजन, द्वारा कल्पना कर रहे हैं। टेप (ए) एफटीजेड FLUO और ईएमएस डीआईजी (द्वारा पाया गया ईएमएस जैव, और एफटीजेड डीआईजी, (सी) ईएमएस जैव, fluo slp1, और एफटीजेड डीआईजी (डी) एफटीजेड जैव, fluo slp1, और ईएमएस डीआईजी (ई) slp1 FLUO, ईएमएस डीआईजी slp1, और एफटीजेड जैव, (एफ) एफटीजेड जैव, fluo slp1, और ईएमएस डीआईजी जांच लेबल। hapten लेबल जांच immunohistochemically सूचीबद्ध आदेश में एक के बाद एक पाया गया। लघुरूप: अमेरिकन प्लान फास्ट ब्लू; एफआर, फास्ट लाल गोली। अन्य संक्षिप्त रूपों महापुरूष 1 और 1 टेबल चित्रा के लिए देखते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सब्सट्रेट संयोजन 1 मिलीलीटर एपी बफर के लिए जोड़ें Concentration के [माइक्रोग्राम / एमएल] एपी बफर रंग सिग्नल संवेदनशीलता
BCIP एनबीटी 3.5 μl 4.5 μl 175 337.5 SB9.5 बैंगनी +++
पत्रिका int 5 μl 5 μl 250 250 SB9.5 पीला +
BCIP / int शेयर समाधान 7.5 μl 250 250 SB9.5 पीला +
फास्ट ब्लू NAMP 5 μl 5 μl 250 250 SB8.2 नीला ++
फास्ट ब्लू NABP 20 μl 10 μl 1,000 500 SB8.2 बैंगनी ++
फास्ट ब्लू NAGP 10 μl 10 μl 500 500 TT8.2 ग्रीन +
फास्ट लाल NAMP 1 गोली 1,000 400 TT8.2 लाल ++

तालिका 1 सब्सट्रेट संयोजन लघुरूप: +++, मजबूत;। ++, मध्यम; +, कमजोर एनबीटी, 4-नाइट्रो-नीली tetrazolium क्लोराइड; BCIP, 5-ब्रोमो-4-क्लोरो 3 indolyl फॉस्फेट; पूर्णांक, 2- (4-iodophenyl) -3 (4-nitrophenyl) -5-फिनाइल-tetrazolium क्लोराइड; पत्रिका, मैजेंटा-फॉसफोरस, 5-ब्रोमो-6-क्लोरो 3 indolyl फॉस्फेट, NAMP, naphthol-एएस-एमएक्स फॉस्फेट; NABP, naphthol-एएस-बीआई-फॉस्फेट; NAGP, naphthol-एएस-जीआर-फॉस्फेट; SB9.5, पीएच 9.5 से धुंधला बफर; SB8.2, पीएच 8.2 से धुंधला बफर; TT8.2, पीएच 8.2 से Tris-बीच बफर।

Discussion

Radioactively लेबल न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ सीटू संकरण (ISH) में अक्सर ऊतक वर्गों पर शाही सेना के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए किया जाता है। रेडियोधर्मी ISH विधि, हालांकि, कम संवेदनशील समय लगता है, है, और पूरे आरोह में पूरा प्रतिलेख वितरण पैटर्न की सराहना की अनुमति नहीं है। इसके विपरीत, यहाँ बताया एम सी-काश विधि बरकरार भ्रूण के भीतर विषम रंगों में कई जीन अभिव्यक्ति डोमेन की सीधी तुलना परमिट। एम सी-काश ऊतकीय संदर्भ तुरंत स्पष्ट और मानक brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा बस कल्पना की कि लाभ है। इस संभावना को उच्च सटीकता के साथ एक दूसरे के लिए भौगोलिक विवरण के अनुसार जीन अभिव्यक्ति डोमेन संबंधित हैं और एक तेज और विश्वसनीय तरीके से अद्वितीय और अतिव्यापी अभिव्यक्ति साइटों को परिभाषित करने के लिए प्रदान करता है। दूसरी ओर, मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट ISH (मछली) संवेदनशीलता और संकल्प के संबंध में अधिक शक्तिशाली है और बेहतर है, तो सेलुलर या यहां तक ​​कि उप सेलुलर फिर से इस्तेमाल किया जाता हैmRNA पता लगाने के समाधान की आवश्यकता है।

एम सी इच्छा से मैप किया गया है कि टेप की व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए लगभग किसी भी प्रतिलिपि भ्रूण में ही नहीं बल्कि लार्वा और वयस्क ऊतकों में और ड्रोसोफिला के अलावा अन्य प्रजातियों में न केवल विश्लेषण किया जा सकता है कि पता चलता है। दरअसल, ड्रोसोफिला के लिए यहाँ विस्तृत वर्णित प्रक्रिया, zebrafish भ्रूण 11,16,22 के साथ इसी तरह कुशल काम करता है। इसके अलावा, एम सी-काश विधि अकशेरुकी और कशेरुकी भ्रूण और ऊतक नमूना की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Hapten-लेबल और जांच सांद्रता

हम नियमित रूप से शाही सेना जांच के hapten लेबल के रूप में fluorescein, digoxigenin, और बायोटिन का उपयोग करें। इसके अलावा, Dinitrophenol लेबल जांच लागू किया जा सकता है, zebrafish इच्छा प्रयोगों 23-25 ​​में पेश किया गया है। कि fluorescein सबसे अच्छा च प्रयोग किया जाता है, ताकि Fluorescein लेबल जांच, अन्य hapten-लेबलों की तुलना में एक कम संवेदनशीलता प्रदर्शितप्रचुर मात्रा में टेप की या पता लगाने। प्रत्येक नव लिखित जांच पहले अपने प्रदर्शन के रूप में सब्सट्रेट BCIP / एनबीटी या फास्ट लाल का उपयोग कर सकते हैं या तो मूल्यांकन किया जाता है, जहां एक भी इच्छा प्रयोग में परीक्षण किया है। पृष्ठभूमि विकास के बिना एक मजबूत संकेत कुछ घंटे के लिए मिनट के भीतर हासिल की है जब एक जांच एकाग्रता इष्टतम के रूप में माना जाता है।

ब्याज की अभिव्यक्ति डोमेन एम सी इच्छा से अपनी पूरी हद में पाया गया है कि यह सुनिश्चित करना है, यह सबसे संवेदनशील सब्सट्रेट संयोजन, BCIP / एनबीटी का उपयोग कर एकल-लेबल इच्छा प्रयोगों द्वारा प्रत्येक प्रतिलिपि पैटर्न कल्पना करने के लिए आवश्यक है। यह कमजोर अभिव्यक्ति डोमेन बहु लक्ष्य प्रयोग में अनदेखी नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करता है। अन्य सब्सट्रेट संयोजनों की कम संवेदनशीलता की भरपाई के लिए यह मानक BCIP / एनबीटी धुंधला की तुलना में जांच सांद्रता (तीन गुना करने के लिए) दोगुना करने के लिए आवश्यक है।

कम पीएच निष्क्रियता

कम पीएच निष्क्रियता कदम के लिए नेतृत्व कर सकते हैंदूसरे और तीसरे धुंधला दौर में कम संकेत का पता लगाने में जिसके परिणामस्वरूप antisense hapten लेबल शाही सेना जांच / भावना mRNA के संकर के आंशिक विघटन। संवेदनशीलता में नुकसान को कम करने के लिए, निष्क्रियता कदम के रूप में संभव के रूप में कम कर रहे हैं। हम कम पीएच में एक 10 मिनट ऊष्मायन समय एपी गतिविधि के उन्मूलन के लिए पर्याप्त है कि अनुभव किया। बड़ी मात्रा में बाद में त्वरित washes अनबाउंड एंटीबॉडी-एपी conjugates के तेजी से कमजोर पड़ने सुनिश्चित करने और haptenized जांच करने के लिए फिर से बाध्यकारी रोका जा सके। वैकल्पिक प्रक्रियाओं paraformaldehyde निर्धारण और गर्मी निष्क्रियता शामिल हैं। हालांकि, रंग अवक्षेप के कुछ स्थिर गर्मी नहीं कर रहे हैं और paraformaldehyde निर्धारण एपी की पूरी निष्क्रियता के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। पहली बार लागू एंटीबॉडी एपी रूप साधना का अधूरा निष्क्रियता के बाद पता लगाने के दौर से पता लगाया जा करने के लिए दूसरा mRNA प्रजातियों के साथ अभिव्यक्ति में झूठी सकारात्मक ओवरलैप करने के लिए अग्रणी में mRNA पैटर्न के दृश्य फिर से बढ़ सकता है। इसलिए, एक नियंत्रण प्रयोग वीं मेंई भ्रूण पहली बार लागू एंटीबॉडी एपी रूप साधना की निष्क्रियता के बाद दो भागों में विभाजित कर रहे हैं। दूसरी एंटीबॉडी एपी संयुग्म नियंत्रण अंश से छोड़ा जाता है और दूसरे रंग की प्रतिक्रिया में एक संकेत का उत्पादन नहीं करना चाहिए। दूसरे रंग की प्रतिक्रिया पहले एक करने के लिए इसी एक संकेत वितरण पैटर्न उत्पन्न हालांकि, अगर है, तो निष्क्रियता प्रक्रिया कुशल नहीं था। इस मामले में, कम पीएच स्थान पर समाधान में ऊष्मायन समय अगले प्रयोग के लिए लंबे समय तक किया जाना चाहिए।

एपी सब्सट्रेट आवेदन के आदेश

संवेदनशीलता का पता लगाने के प्रत्येक बाद के दौर के साथ चला जाता है, यह पूर्व के अधिक प्रचुर मात्रा में टेप करने के लिए कम प्रचुर मात्रा में mRNAs का पता लगाने की सलाह दी जाती है। फास्ट रंजक अधिमानतः मजबूत व्यक्त प्रतिलेख का पता लगाने के लिए पहले धुंधला दौर में लागू किया जाता है, ताकि इसके अलावा, फास्ट लाल और फास्ट ब्लू सब्सट्रेट संयोजन, काफी purpleblue BCIP / एनबीटी दाग ​​से कम संवेदनशील होते हैं। यह भी जबाद में BCIP / एनबीटी धुंधला नजर रखी और purpleblue संकेत हल्का फास्ट रंगों के संबंध में भी अंधेरा हो जाता है से पहले समय में बंद कर दिया जा सकता है कि लाभ के रूप में। इस प्रकार एक मानक दो रंग प्रयोग में, पहले मजबूत व्यक्त mRNA फास्ट लाल ने पता लगाया है और दूसरा एक कमजोर BCIP / एनबीटी से। लेकिन कुछ समय के बाद फैलाना हो जाते हैं कि अवक्षेप उत्पादन जो पीले INT सब्सट्रेट संयोजन लागू किया जा सकता है तेजी से रंगों के लिए एक विकल्प के रूप में। इसलिए BCIP / int विशेष रूप से पिछले धुंधला दौर में लागू किया जाता है। नतीजतन एक तीन रंग प्रयोग में हम अक्सर पहले फास्ट लाल, दूसरी BCIP / एनबीटी (या फास्ट ब्लू) और तीसरे एक INT सब्सट्रेट संयोजन का उपयोग करें। यह INT आवेदन करते समय जितनी जल्दी हो सके दाग भ्रूण तस्वीर करने के लिए सलाह दी जाती है कि ध्यान दें।

AZO रंगों के फ्लोरोसेंट का पता लगाने

यह एक काले रंग के वेग एक लाइटर एक ग्रहण किया जाता है जब ओवरलैपिंग अभिव्यक्ति पैटर्न पहचान करने के लिए कभी कभी मुश्किल हो सकता है। एफया उदाहरण के लिए, एक जोरदार विकसित BCIP / एनबीटी वेग हल्का फास्ट डाई संकेतों मुखौटा कर सकते हैं। इस समस्या के आसपास पाने के लिए एक तरह से प्रत्येक धुंधला करने के बाद तुरंत छवियों पर कब्जा करने और अगले पता लगाने के दौर से पहले लागू रंग वेग को दूर करने के लिए है। इस मामले में, शराब में घुलनशील AZO डाई (फास्ट लाल) और int अवक्षेप क्रमश: पहले और दूसरे का पता लगाने के दौर के बाद इथेनॉल washes के द्वारा हटा दिया जाता है, और BCIP / एनबीटी धुंधला पिछले एपी सब्सट्रेट 26 के रूप में लागू किया जाता है। एक और संभावना AZO रंगों के फ्लोरोसेंट गुणों का लाभ ले रहा है। फास्ट ब्लू दूर लाल फिल्टर 28,29 के साथ मनाया जा सकता है, जबकि फास्ट लाल, 27 सेट rhodamine फिल्टर का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। यह भी घने हो जाते हैं और AZO डाई का फ्लोरोसेंट संकेत नहीं बुझ करता है, ताकि तुलना या वर्णजनीय और फ्लोरोसेंट छवियों के ओवरले, समय में बंद कर दिया जाना गया है सह distribution.Using इस दृष्टिकोण, BCIP / एनबीटी संकेत विकास की साइट प्रकट कर सकते हैं प्रतिक्रिया उत्पाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water Thermo Scientific R0603
T7 RNA Polymerase  Thermo Scientific EP0111
T3 RNA Polymerase  Thermo Scientific EP0101
SP6 RNA Polymerase  Thermo Scientific EP0131
RiboLock RNase Inhibitor  Thermo Scientific EO0381
DNase I, RNase-free  Thermo Scientific EN0521
NTP Set Thermo Scientific R0481
Digoxigenin-11-UTP Roche 11209256910
Fluorescein-12-UTP Roche 11427857910
Biotin-16-UTP Roche 11388908910
Ammonium acetate Applichem A2936
Ethanol, absolute  Merck 100983
di-Sodium hydrogen phosphate Scharlau SO0339
Sodium dihydrogen phosphate Scharlau SO0331
Tween-20 Sigma P1379
Paraformaldehyde Sigma P6148
Methanol Sigma 32213
Proteinase K Thermo Scientific EO0491
Glycine Sigma G7126
Hydrochloric acid  Merck 100317
tri-Sodium citrate Scharlau SO0200
deionized formamide Applichem A2156
RNA type VI from torula yeast Sigma R6625
Heparin sodium salt Applichem A3004
Dextran sulfate sodium salt Sigma D6001
Sheep serum Sigma S2263
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments  Roche 11426303001
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments Roche 11093274910
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments Roche 11426303001
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody Vector laboratories MB-3100
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane Scharlau TR04241000
Magnesium chloride Scharlau MA0036
Sodium chloride Scharlau SO0227
Levamisole Sigma L9756
N,N-Dimethylformamide Sigma D4551
Dimethylsulfoxide Applichem A3006
Fast Red tablet set Sigma F4648
Fast Blue BB salt Sigma F3378
Naphthol-AS-MX-phosphate Sigma N5000
Naphthol-AS-GR-phosphate Sigma N3625
Naphthol-AS-BI-phosphate Sigma N2250
Magenta-Phos Biosynth B7550
INT Sigma I8377
NBT Applichem A1243
BCIP Applichem A1117
INT/BCIP solution Roche 11681460001
Glycerol 86-88% Scharlau GL0023
Universal incubator Memmert BE400
Waterbath Memmert WB14
Heat block Grant QBT2
Netwell  inserts 15 mm Corning 3477
Netwell carrier kit 15 mm Corning 3520
12-well cell culture plate Corning 3513
24-well plate Sarstedt 83.3922
1.5 ml microtube Sarstedt 72.690.001
2.0 ml microtube Sarstedt 72.691

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विकास जीवविज्ञान अंक 107 Digoxigenin बायोटिन fluorescein AZO डाई फास्ट ब्लू फास्ट लाल पूर्णांक alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट इच्छा फल मक्खी
मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय साबुत माउंट<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण में जीन एक्सप्रेशन डोमेन की तुलना के लिए<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण
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Hauptmann, G., Söll, I.,… More

Hauptmann, G., Söll, I., Krautz, R., Theopold, U. Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (107), e53830, doi:10.3791/53830 (2016).

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