Summary
我々は、色の沈殿物を対照することによって三つの異なるmRNAの分布パターンの同時および特定の検出を可能にする、完全なショウジョウバエの胚におけるマルチターゲット発色性ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）の手順を説明します。
Abstract
胚発生および器官形成の間に活性な遺伝子調節ネットワークを解析するためには、正確に異なる遺伝子をその場で互いに空間的関係で表現する方法を定義することが不可欠です。マルチターゲット発色ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）は、同じサンプル試料の色の対比で異なるmRNA種の独特の視覚化を可能にするように大きく、遺伝子発現パターンの瞬間比較を容易に 。これにより、高精度な地形的相互に遺伝子発現ドメインを関連付けるために、固有の重複発現部位を定義する可能性を提供します。提示されたプロトコルでは、我々は、 ショウジョウバエ胚における種々の遺伝子のmRNA発現パターンを比較するためにMC-WISH手順を説明します。 3 RNAプローブを、それぞれ別の遺伝子に特異的な、異なるハプテンによって標識まで、同時に胚サンプルにハイブリダイズされ、その後、アルカリによって検出NEフォスファターゼ基づく比色免疫組織化学。説明する手順は、 ショウジョウバエのためにここで詳述するが、ゼブラフィッシュ胚と同様に動作します。
Introduction
in situハイブリダイゼーション（ISH）は、細胞、組織および生物体1内の形態学的な文脈におけるRNA転写物の検出及び局在化のための標準的な方法です。 ISH法によって生成された信号は、一般的に、放射性、蛍光および発色検出システムによって可視化されます。近年、蛍光ISH（FISH）2の重要な技術的進歩は、単一分子3,4 .Whileまでの検出および定量RNA発現の単一細胞およびサブ細胞レベルでの及びRNAの可視化を可能にする、劇的に改善された感度と分解能が得られました洗練された単一分子FISH法は、より専門的な用途に使用され、発色ISHは、研究および臨床診断においてインサイチュ検出方法においてルーチンRNAとして普及しています。発色検出用の酵素の沈殿反応が部位に対照的な色に見える製品を生成した、使用されていますハイブリダイゼーション5。これは、RNAの可視化ルーチン組織学的染色および形態学的状況に組み合わせることができる利点は、標準的な明視野顕微鏡により直ちに明らかです。また、適用される色基質の多数は、永久的な試料調製が5を得ることができるように、有機および/ または水性マウント媒体中で安定な析出物を生じます。
ショウジョウバエでは、初期ISHプロトコルを切片材 6上の転写産物を検出するための放射性同位体で標識したプローブを適用しました。それは、組織切片からの全胚または臓器系の完全な転写パターンを再構築することは困難であるが、非放射性標識プローブを用いた発色ISH法の適用は、全マウント7にRNAの分布を検出するグローバルすることができます。発色性ISHの多くのバリエーションが存在するが、典型的にin situハイブリダイゼーション （WISH）プロトコルHYB でホールマウントridizedハプテン標識プローブは、レポーター酵素に結合した抗ハプテン抗体によって検出されたmRNA転写物は、沈殿色原体によって可視化されます。
レポーターによって生成異なる色の沈殿物のパレットは、アルカリホスファターゼ（AP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）、およびβ-ガラクトシダーゼ（GAL）1における複数のターゲットの特徴的な検出と同じサンプル8-14を可能にする酵素。しかしながら、POD酵素活性は、限られた時間の間持続し、追加（チラミド）シグナル増幅なしで15以下豊富な転写物の検出は、これらの酵素に挑戦することができるようにGAL比色反応は、幾分敏感です。対照的に、APの永続的な活性が長く持続する基質代謝回転と高い信号対雑音比を可能にします。そのため、異なる色の基質とAPレポーター酵素を用いて順次検出が効果的に成功を収めており、単一胚における最大3つの異なる転写産物の特徴的な検出10-12,16。
このマルチターゲット発色WISH（MC-WISH）方式（ 図1）14のために、標識アンチセンスRNAプローブを、 インビトロ転写によって生成され、利用可能なハプテンラベルの1つでマーク。胚は、ホルムアルデヒド固定し、メタノール処理およびプロテイナーゼK消化することによって透過されます。胚のハイブリダイゼーションは同時に異なる遺伝子にそれぞれ特異的な3つまでの異なる標識アンチセンスRNAプローブを用いて行われます。ストリンジェンシー洗浄により未結合のプローブを除去した後、各ハプテン標識は、検出の別々のラウンドで可視化されます。単一の検出ラウンドは、ローカライズされた安定した色の沈殿物を生成し、AP-基板を適用することにより、APとRNAの可視化に結合した抗ハプテン抗体と胚のインキュベーションで構成されています。抗体検出および染色した後、適用される抗体-AP conjuゲートは、低pH洗浄によって除去されます。多色実験では、検出の各ラウンドは、異なるハプテン標識を標的とする抗体を使用し、各転写パターンが異なる色の基板（ 表1）によって可視化されます。胚はグリセロールで取り付けられ、微分干渉コントラスト（DIC）光学系を用いた高解像度複合顕微鏡で撮像されます。
Protocol
in vitro転写により RNAプローブの1ラベリング
- RNaseフリーの条件下で1.5ミリリットルマイクロチューブ内のin vitro転写反応を組み立て：10.5μlのDEPC処理H 2 O、4.0μlの5×転写バッファー、1.0μlのDEPC処理H 2 O（1μgの）直線化、精製された鋳型DNA、 1.3μlのNTPミックス、0.7μlのハプテン標識UTP、0.5μlのRiboLockのRNA阻害剤、2.0μlのRNAポリメラーゼ。
注：最終反応体積は20μlです。 - テンプレートのプロモーター配列の使用T7に応じて、 インビトロ転写のためにT3またはSP6 RNAポリメラーゼ（17を参照する参照）。
- RNAプローブのラベルとしてジゴキシゲニン-11-UTP、ビオチン-16-UTP、またはフルオレセイン12-UTPを選択します。詳細については、 議論にハプテン-ラベルとプローブ濃度の説明を参照してください。
- 転写反応を混合し、すぐにスピンダウン。
- 転記してみましょう37℃で3時間。
- 私は、鋳型DNAを除去するための転写反応に1μlのRNaseフリーのDNaseを追加よく混ぜ、37℃で15分間インキュベートします。
- DEPC処理H 2 Oを200μlにサンプルボリュームを調整します。
- 標識RNAプローブを沈殿させ、100μlの（0.5体積）7.5 M酢酸アンモニウム及び600μlの（3体積）エタノールを追加します。 RTで30分間インキュベートします。
- これが組み込まれていないヌクレオチドの不要な析出につながる可能性として、氷冷エタノールを使用しないでください。
- 20℃で30分間、最大速度（20,800 XG）で温度制御された遠心分離機で転写されたRNAをスピンダウン。慎重に上清を吸引。
- 20℃で10分間、20,800×gで70％RTでエタノール、遠心分離で得られたペレットを洗浄します。
- 上清を除去し、誤って緩いペレットを吸引しないように注意してください。室温で数分間開いた蓋をマイクロチューブにペレット空気が乾燥してみましょう。
- ディスDEPC処理H 2 O100μl中得られたペレットを解決
- -20℃で300μlのプレハイブリダイゼーション緩衝液を加える（50％体積/体積の脱イオンホルムアミド、5×SSC、50μg/ mlのヘパリンナトリウム塩、0.1％体積/体積のTween-20を、5 mg / mlのトルラRNA）とストア。プローブは、長期的には、-20℃で保存することができます。
注意：新たに転写されたプローブの最初のテストをご希望の実験のための最終濃度を得るために、100μlのハイブリダイゼーション緩衝液で3μlのハプテン標識RNAプローブを希釈します。
インサートの使い方胚試料の2処理
注：異なるインキュベーション工程を通じて胚を処理するためのマイクロチューブまたはマルチウェルプレートを使用すると、誤って溶液の交換中に、それらを吸引することにより、胚のかなりの量を失うリスクを負います。この損失を避けるために、手順を介して、胚サンプルを搬送するための（例えば、Netwellインサートなど）バスケットを使用することが有用であり得ます。これらは中ポリスチレン胚は、処理中に休まれた下部（ 図2A）でのポリエステルメッシュ、とserts。
- WISHの手順で胚を処理するために、12ウェルプレート（ 図2B）に挿入を組み立て、各ウェルに適切な溶液2mlを追加します。
- ブルーチップを用いてインサートに胚をピペット。すべての胚を液体に浸されていることを確認します。
- インキュベーション時間は、場所に次の工程のための溶液が充填されている別の12ウェルプレート中の胚を含むインサートである場合。
- 別の解決策（ 図2D）から一度に12サンプルまで転送するために、キャリアとハンドル（ 図2C）を使用します。
注：必要なボリュームを減らす染色反応（ステップ6.2）のためのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション段階（ステップ4.1を参照）、24ウェルプレートのために2.0ミリリットルのマイクロチューブを使用します。ハイブリダイゼーションおよび染色反応は100のボリュームで実行されています1; lであり、それぞれ400μlを、。
- 別の解決策（ 図2D）から一度に12サンプルまで転送するために、キャリアとハンドル（ 図2C）を使用します。
ハイブリダイゼーションのための胚の調製
- 、dechorionate、収集修正し、標準的な手順14,18を使用して胚をdevitellinize。準備された胚を日常-20℃でメタノール中に保存されます。
- 移植胚を室温にin situハイブリダイゼーションのために使用し、ウェルあたり2 mlのメタノールを充填した12ウェルプレートのインサート内に分配されます。
- RTで減少メタノールシリーズを通して胚を再水和。 （I）1×PBS中の75％メタノール1×PBSにおける（ii）の50％メタノール、0.1％Tween-20を含む1×PBS中の（iii）の25％メタノール、0.1％のTween-20（IV：で胚を3分毎にインキュベート）PBS、0.1％のTween-20（v）の1×PBS、0.1％のTween-20を1倍。
- RTで20分間、1×PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で胚を予め固定します。
- 室温で1×PBS中で3分間、0.1％のTween-20を4回洗浄した固定液を除去します。一方、解凍し、プロテイナーゼKおよびグリシンワーキング溶液を調製。
- 0.1％Tween-20を室温で2ミリグラム/ 1×PBS中mlのグリシン、中2 1分リンスして反応を停止します。
- 室温で20分間、1×PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で胚をポスト修正。
- その後、1×PBS、0.1％Tween-20を室温で3分間、4回洗浄することによりパラホルムアルデヒド固定液を除去します。
- プレハイブリダイゼーション緩衝液に後固定した胚を転送します。直接ストア-20℃でのプレハイブリダイゼーション緩衝液中の胚または、プローブのハイブリダイゼーションを進めます。
プローブのハイブリダイゼーション4.
- 移植胚をRTにプレハイブリダイゼーション緩衝液中で-20℃で保存しました。 2.0ミリリットルmicrotubにプレハイブリダイゼーション緩衝液中の胚を配布エス。
- 最小で30分間、プレハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃で胚サンプルを事前にハイブリダイズします。
注意：プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションのために水浴を使用する手順。プレハイブリダイゼーションの間に三アンチセンスRNAプローブと異なる遺伝子転写産物に対する各特定を組み合わせ、異なるハプテンで標識することによりプローブミックスを準備する時間があります。 - プローブミックスを得るために、100μlのハイブリダイゼーション緩衝液（50％容量/容量脱イオン化ホルムアミド、5×SSC、50μg/ mlの中に一緒に所望の各元ハプテン標識アンチセンスRNAプローブの（通常6μlに1μlの間の）適切な量を追加しますヘパリンナトリウム塩、0.1％体積/体積のTween-20を、5 mg / mlのトルラRNA、5％重量/容積デキストランサルフェート）。
注意：硫酸デキストランの添加は任意です。 - 5分間80℃のヒートブロック中でアンチセンスRNAプローブミックスを変性させます。その後65℃に直接変性したプローブミックスを転送します。
- プレハイブリダイゼーションの大部分を除去胚サンプルからバッファリングし、変性プローブミックスを追加します。
- 胚サンプルは65℃でミックスO / Nをプローブにハイブリダイズしてみましょう。
注：55℃、65℃の間の温度範囲は、日常的に、ハイブリダイゼーション、前後のハイブリダイゼーション工程のために使用されています。 65℃でのハイブリダイゼーションは、最も厳しい条件を提供し、より低い温度を使用するときに、背景の問題の場合に推奨されます。バックグラウンドの問題がない場合は、55℃でハイブリダイゼーションを強化信号強度および改善された胚の完全性の利点を提供する、推奨されます。 - 次の朝、最初に彼らが時間内に正確な温度に加熱されることを確認するために、65℃にストリンジェンシーの洗浄溶液を移します。
- 予め温めておいた2 mlを含有する12ウェルプレートのインサートに2.0ミリリットルのマイクロチューブから胚とのハイブリダイゼーションプローブミックスを転送ハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（2×SSC、0.1％のTween-20で50％ホルムアミド）。 EMを含む12ウェルプレートを置きオーブンでbryoサンプルと65℃で20分間インキュベートします。
- 2 mlの新たなハイブリダイゼーション洗浄バッファーに転送胚試料および65℃で20分間インキュベートします。もう一度この手順を繰り返します。
- 一度、2×SSC、0.2×SSC、0.1％のTween-20中の0.1％Tween-20を3回で、65℃で20分間の洗浄によって過剰のプローブを削除します。
- PBS、0.1％Tween-20を室温で1倍する胚サンプルを転送します。
- 室温で少なくとも30分間ブロッキング緩衝液（1×PBS、0.1％のTween-20で8％のヒツジ血清）で胚を培養します。
ハプテン標識プローブの5抗体の検出
注：すべての3つの異なって標識されたプローブの同時ハイブリダイゼーションとは対照的に、各プローブは、抗体インキュベーションおよび染色の別個のラウンドで次々と検出されます。したがって、各検出ラウンドで唯一つの抗体が使用される（抗ジゴキシゲニンAPまたは抗フルオレセイン-APまたは抗ビオチンAPのいずれか）。
- STEPの間で選択します5.1.3に5.1.1と検出されるべきハプテンラベルに応じて適切な抗体希釈を準備を進めます。
注：異なる標識プローブの連続的検出のために、別の抗ハプテン抗体は、各検出周期において適用されます。- ブロッキング緩衝液で4000：フルオレセイン標識プローブの検出のために抗フルオレセイン-APコンジュゲート1を希釈します。
- ブロッキング緩衝液中に4000：ジゴキシゲニン標識プローブの検出のために抗ジゴキシゲニンAPは1コンジュゲート希釈します。
- ブロッキング緩衝液で4000倍に希釈したビオチン標識プローブの検出のために1で抗ビオチン-APコンジュゲート溶液を調製。
- 室温で3〜4時間のために選択された抗ハプテン-AP溶液中で胚をインキュベートします。また、4℃でO / Nインキュベートします。同時にすべての3つの抗体を適用しないでください。
- 非結合抗体を除去するために室温で4時間15分間、1×PBS、0.1％のTween-20で胚を洗浄します。
- 緩衝系を変更することでしたTNTでのRTでのH 2回15分（8.0 0.1 Mトリス-HCl、0.1 MのNaCl、0.1％のTween-20）。
6.アルカリホスファターゼ発色染色
- 抗体検出に続いて（ 表1参照 ）6.1.4にステップ6.1.1のいずれかを選択し、所望の色信号を得るためにアルカリフォスファターゼ発色性染色反応の一つに進みます。検出の各ラウンドの異なる発色基質の反応は、他の色の各転写パターンを強調するために適用されます。
- ファストレッド染色
- TT8.2で15分（0.1 Mトリス塩酸pH8.2の、0.1％のTween-20）のための胚を2回洗浄します。
- 胚を洗浄しながら、ファストレッドTR / NAMPアルカリホスファターゼ基質錠セットからファストレッド染色液を準備します。
- 1ミリリットルの蒸留水に設定タブレットからバッファタブレットを溶解し、0.1Mトリス塩酸pHが8.2を取得するためにボルテックスして混合します。
- 準備されたTにファストレッドTR / NAMPタブレットをドロップRISファストレッド染色溶液を得るためにボルテックスすることによって緩衝液に溶解します。
- 0.2μmのシリンジフィルターを通して非溶解粒子からのクリアファストレッド染色液。
- ファーストブルー染色
- 洗浄液を新鮮SB8.2染色緩衝液（0.1 Mトリス-HCl pHを8.2、0.1 MのNaCl、0.05 MのMgCl 2、0.1％のTween-20）で15分間2回胚。
- 胚を洗浄しながら、50mgの（DMF中）/ mlのファーストブルーBBおよび50 mg / mlのナフトールリン酸（DMSO中）のストック溶液からのファーストブルー染色液を調製。
- たてSB8.2では0.5mg / mlのファーストブルーBB溶液を調製。
- たてSB8.2で0.5 mg / mlので別々ナフトールリン酸溶液を調製。
- ボルテックスで一定の混合下でファーストブルーBB溶液に準備されたナフトールリン酸溶液を添加滴下。得られた最終の使用濃度は、両方の基板コンポーネントの0.25 mg / mlです。
注：別のファーストブルー/ナフトールphosp憎悪の組合せ（表1を参照）は、異なる色合いをもたらします。
- BCIP / NBT染色
- 洗浄液を新鮮SB9.5染色緩衝液（0.1 Mトリス-HCl pHを9.5、0.1 MのNaCl、0.05 MのMgCl 2、0.1％のTween-20）で15分間2回胚。
- purpleblue発色性信号のために、新たに1μlのレバミゾール、3.5μlのBCIPとSB9.5の染色緩衝液1ml当たり4.5μlのNBTを追加することにより、BCIP / NBT染色液を調製し、よく混ぜます。
- INT染色
- 新鮮SB9.5の染色緩衝液中で15分間胚を2回洗浄します。
- yellowbrown発色性信号のために、新たに1μlのレバミゾール、5μlのマゼンタ・フォスとSB9.5の染色緩衝液1ml当たり5μlのINTを追加することによって、INT染色液を調製し、よく混ぜます。
注：または7.5μL/ mlのBCIP / INTすぐに使用染色液を使用しています。
- ファストレッド染色
- 染色反応転送胚サンプルについて24ウェルプレートに。暗闇の中で選択した染色溶液400μlの各サンプルをインキュベートします。
- 実体顕微鏡下で開発を通知時折監視します。所望の信号強度が得られ、有意なバックグラウンドシグナルが観察される前に、染色反応を停止します。
- 発色反応を停止するには、転送は、ウェル当たり2ミリリットルのTNTを含む12ウェルプレートのインサートに胚を染色しました。 TNTで染色された胚を2回洗浄します。
- 残留基板を除去するために、胚を室温で1×PBS、0.1％のTween-20で10分間、2回洗浄します。
7.抗体の取り外し/アルカリホスファターゼの不活化
- RTで10分間（グリシン-HCl pHを2.2、0.1％Tween-20を0.1 M）の抗体を除去し、低pHの停止溶液2ml中でインキュベートすることによりアルカリホスファターゼを不活性化します。
- RTで1×2mlのPBS、0.1％のTween-20で1分間すすぎます。
- 1×PBS中で3分間3回洗浄し、0.1％Tween-20をRTで。
8.第二の検出ラウンド
- 第二の転写物の分布パターンを検出するために第二のハプテン標識を標的とする抗体-APコンジュゲートを使用してハプテン標識プローブ（ステップ5.4から5.1）の抗体検出を進めます。
- アルカリフォスファターゼ発色性染色（ステップ6.5から6.1）（利用可能な色は 、表1を参照）、第1の検出ラウンドで使用されるものに対照的な色を生成する基質の組み合わせを適用することを実行します。
- 7.3にステップ7.1で説明したように、第2の抗体-APコンジュゲートを除去します。
9.第3検出ラウンド
- 第三の転写物の分布パターンを検出するために、第三のハプテン標識に特異的な抗体-APコンジュゲートを用いてハプテン標識プローブ（5.4 STEP 5.1）の抗体検出を進めます。
- アルカリフォスファターゼ発色性染色（ステップ6.5から6.1）APなかった基質の組み合わせを適用することを実行します前回の検出ラウンドでプライ。色は前の2つの検出ラウンドのものと区別することは容易に沈殿生成発色反応を選択してください（色の選択については表1を参照）。
10.取付け・イメージング
- PBS中の30％グリセロールに適切に染色された胚を移し、胚が完全にグリセロール溶液に浸漬されるまでインキュベートします。彼らは底に沈むとき、彼らは十分に平衡化されています。
- 移植胚のH 2 O中の 70％グリセロールにし、室温で平衡化しましょう。染色された胚を、4℃で70％グリセロール中に保存することができます。
- 取り付けのために、ピペットは、オブジェクトのスライドに、スライド（ 図3）に接着スペーサを触れることなく、70％のグリセロール液滴で胚を染色しました。カバースリップを適用します。
- ビューは、解剖顕微鏡下で胚をマウントしました。胚が所望の方向に回転するように、適用されるカバースリップを移動します。
- 正しく観察微分干渉コントラスト光学系を有する化合物の顕微鏡下での高解像度（20X、40X対物レンズ）で配向胚。
- デジタルカラーカメラで画像をキャプチャし、デジタルストレージデバイスに保存します。
Representative Results
記載されているプロトコルは、異なる色で複数の転写パターンの同時可視化を可能にします。 MC-WISHは直接、同じ胚における異なる遺伝子の発現パターンを比較する利点を提供します。一例として、 空気門の発現パターン（EMS）19、 フシtarazu（FTZ）20とずさんなペアの 1（SLP1）21を直接 キイロショウジョウバエの胚盤葉期胚に比べ、色の色合いの様々な可視化されている（ 図4） 。
異なるAP基質の組み合わせは、対照的な色の沈殿物（ 表1）のパネルを得るために利用可能です。ファストレッドおよびBCIP / NBTによって生成紫色の沈殿によって生成される赤色の沈殿を容易に区別することができるので、最も一般的に使用され二色実験におけるLY（ 図4A）。ファストレッド色が転写物の部分的な同時分布の場合には偽装されるように、しかし、BCIP / NBT染色はすぐにではなく、暗い色になることができます。したがって、ファストブルーの適用はそれぞれ、NAMP、NAGPとNABPと組み合わせて、青色、緑色、紫色の製品を生成する、有利である （表1）であることができます。 NAMPでのファーストブルーの組み合わせは 、EMSとそれぞれ赤と青で可視化SLP1発現部位（ 図4B）のために、ここで示すように、隣接または重複表現ドメインにおけるファストレッド製品から容易に識別可能であるライトブルーの色を提供します。緑のEMSドメインが明らかに赤SLP1の発現部位（ 図4C）から独特であるように、ファーストブルーNAGPの組み合わせは、ファストレッド染色に似た強いコントラストを提供します。しかし、EMSとSLP1発現部位が解除された場合ファーストブルーNABPとファストレッドによりtected、それぞれ、結果として紫と赤の色の析出物が（ 図4D）以下に識別可能です。前述したようにSLP1と赤と緑でFTZ式で示されるように、ファストレッドとファーストブルーNAGPはそれぞれ、（ 図4D）を区別するのは簡単です。
INTとの組み合わせでMagentaPhosはFTZ（ 図 4C、E）の分節式を明らかにするために使用された黄色の沈殿物を生成します。それぞれファーストブルーNAMPとMAG / INT、（ 図 4E）とSLP1とFTZの検出によって例示されるような黄色の沈殿物が青色の基材への良好なコントラストを生成します。しかし、黄色の沈殿物がファストレッド製品からあまり容易に識別可能です。 EMSの黄色に染色された発現領域はほとんどdistiすることができます赤（ 図 4F）に示すSLP1の吻側式からnguished。したがって、色基質の組み合わせは、各実験のために慎重に選択しなければなりません。
MC-WISHの図1のフローチャート。3つのユニークな転写パターンの色とりどりの可視化のために、異なる抗体-APコンジュゲートと各検出サイクルの色基質の組み合わせのどちらかを選択します。略語：AP、アルカリホスファターゼ; BIO、ビオチン; DIG、ジゴキシゲニン。 FLUO、フルオレセイン。他の略語は伝説4と表図 1を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
S / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg "/>
胚担体として図2のインサート。（A）15 mmの直径および74ミクロンのメッシュサイズのポリエステル膜と底部に取り付けられたインサートは、 ショウジョウバエ胚担体として使用されます。 （B）インサートを種々の溶液のための貯蔵トレーとして機能する12ウェルプレート内に組み立てられます。 （C）利用可能なキャリアとハンドルを同時に（D）12インサート/胚サンプルの処理が可能になります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
染色された胚の図3のマウント。胚は、スペーサとして機能するカバーガラス、の2つのスタック間で70％グリセロールの低下に取り付けられます。アプリのジェントル移動嘘をついた大型カバーガラスは、観察や写真撮影のために所望の向きに取り付けられた胚を回転させるのに役立ちます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4。 ショウジョウバエの 胚における mRNA転写物の多色の可視化 。 ショウジョウバエの胚におけるMC-WISH実験の例は、横方向のビューから表示されます。 空気門 （EMS）のmRNAの発現パターン、 フシtarazu（FTZ）とずさんなペア1（SLP1） は各パネルに表示されている別のAPの色の基質の組み合わせによって可視化されます。転写物は、（A）FTZ FLUO および EMS DIG、（によって検出しました
| 基板の組み合わせ | 1ミリリットルAPのバッファに追加 | Concentraン[/ mlの] | APバッファ | 色 | 信号感度 |
| BCIP NBT | 3.5μlの4.5μL | 175 337.5 | SB9.5 | パープル | +++ |
| MAGのINT | 5μlの5μL | 250 250 | SB9.5 | 黄 | + |
| BCIP / INT原液 | 7.5μL | 250 250 | SB9.5 | 黄 | + |
| ファーストブルーNAMP | 5μlの5μL | 250 250 | SB8.2 | ブルー | ++ |
| ファーストブルーNABP | 20μlの10μlの | 千500 | SB8.2 | バイオレット | ++ |
| ファーストブルーNAGP | 10μlの10μlの | 500 500 | TT8.2 | 緑色 | + |
| ファストレッドNAMP | 1錠 | 千400 | TT8.2 | 赤 | ++ |
表1 基質の組み合わせ略語：+++、強いです;。 ++、媒体と、 +、弱いNBT、4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド; BCIP、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - ホスフェート。 INT、2-（4-ヨードフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-フェニルテトラゾリウムクロリド。 MAG、マゼンタフォス、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル - ホスフェート、NAMP、ナフトールAS-MXリン酸; NABP、ナフトールAS-BIリン酸; NAGP、ナフトールAS-GR-リン酸塩; SB9.5、pHは9.5で染色緩衝液; SB8.2、pHは8.2で染色緩衝液; TT8.2、pHは8.2でトリス - トゥイーンバッファー。
Discussion
放射性標識された核酸プローブとのインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）は、しばしば、組織切片上でRNAの局在を検出するために使用されます。放射性ISH法は、しかし、それほど敏感で時間がかかり、全体マウントで完全な転写物の分布パターンの感謝を許可していません。対照的に、本明細書に記載のMC-WISH法は、無傷の胚内での色の対比において、複数の遺伝子発現ドメインの直接比較を可能にします。 MC-WISHは、組織学的コンテキストが直ちに明らかと標準明視野顕微鏡によって簡単に可視化するという利点を有します。これは、可能性が高い精度で互いに地形的遺伝子発現ドメインに関連し、高速で信頼性の高い方法で、ユニークで重複発現部位を定義するために提供します。一方、多重化された蛍光ISH（FISH）は、感度、解像度に関して、より強力であり、細胞の、あるいはサブセルラー再あれば好ましく、使用されていますmRNA検出の溶液が必要です。
MC-WISHによってマップされた転写物の広いスペクトルは、実質的に任意の転写物が胚でなく、幼虫および成体組織およびショウジョウバエ以外の種だけでなく分析することができることを示唆しています。実際、 ショウジョウバエのためにここで詳述説明する手順は、ゼブラフィッシュ胚11,16,22と同様に効率的に動作します。また、MC-WISH法は無脊椎動物および脊椎動物胚および組織標本の多種多様に適用できます。
ハプテン - ラベルとプローブ濃度
私たちは日常的にRNAプローブのハプテン標識としてフルオレセイン、ジゴキシゲニン、及びビオチンを使用しています。また、ジニトロフェノールで標識されたプローブは、ゼブラフィッシュWISH実験23-25 に導入された、適用されてもよいです。フルオレセインは、最高の中古Fとなるように、フルオレセイン標識プローブは、他のハプテンのラベルと比較してより低い感度を表示または豊富な転写産物の検出。各新たに転写されたプローブは、最初にその性能を基質としてBCIP / NBTまたはファストレッドを使用していずれかで評価された単一のWISH実験で試験されています。プローブ濃度は、バックグラウンドの発生なしに強いシグナルを数時間に分以内に達成されたときに最適と考えられています。
興味の発現ドメインはMC-WISHによってその全範囲で検出されていることを確認するために、それは最も敏感な基質の組み合わせ、BCIP / NBTを使用して、単一ラベルWISH実験により各転写パターンを可視化することが不可欠です。これは、弱い発現ドメインは、マルチターゲット実験では見落とされていないことを保証します。他の基質の組み合わせの低い感度を補償することは、標準的なBCIP / NBT染色と比較して、プローブ濃度（三倍に）倍を使用することが不可欠です。
低pH不活性化
低pH不活性化工程は、につながることができます第二および第三の染色ラウンドで減少し、信号検出結果としてアンチセンスハプテン標識RNAプローブ/センスのmRNAハイブリッドの部分的な崩壊。感度の損失を最小限に抑えるために、不活性化ステップは、可能な限り短いです。我々は、低pHでの10分間のインキュベーション時間は、AP活性を排除するのに十分であることを経験しました。大量の後続の迅速な洗浄は、未結合の抗体-APコンジュゲートの急速な希釈を確保し、ハプテン化プローブに再結合するのを防ぎます。代替手順は、パラホルムアルデヒド固定し、熱不活性化が含まれます。しかし、色の沈殿物の一部は、安定したパラホルムアルデヒド固定がAPの完全な不活性化のために十分ではないかもしれない加熱されません。第1の印加抗体-APコンジュゲートの不完全な不活性化は、検出される第2のmRNA種との表現で偽陽性の重複につながるラウンド以下の検出におけるmRNAパターンの再可視化につながることができます。したがって、対照実験番目でE胚が最初に適用抗体-APコンジュゲートの不活性化した後、2つの画分に分割されます。二次抗体-APコンジュゲートは、制御画分から省略され、第二の色反応の信号を生成してはなりません。第二の色反応を最初に対応する信号分布パターンを生成する場合は、その後不活性化手順は効率的ではなかったです。この場合には、低pHの停止溶液中でのインキュベーション時間は、次の実験のために延長されるべきです。
AP基質アプリケーションの注文
感度は検出の後続の各ラウンドで降下するので、前より豊富転写物にあまり豊富でmRNAを検出することをお勧めします。ファスト染料が好ましく、より強い表現転写物の検出のための第一の染色ラウンドで適用されるように、また、ファストレッドとファーストブルー基板の組み合わせは、かなりpurpleblue BCIP / NBT染色よりも感度が低いです。これも時間その後のBCIP / NBT染色を監視しpurpleblue信号が軽く高速染料に関連して、あまりにも暗くなるまでの時間で停止させることができる利点など。したがって、標準的な2色の実験では、最初に強く発現されたmRNAは、ファストレッドによって検出され、第二BCIP / NBTずつ弱いです。しかし、しばらくして拡散するようになる沈殿物を生成した黄色INT基質の組み合わせを適用することができるファースト染料の代替として。したがって、BCIP / INTはもっぱら最後の染色ラウンドで適用されます。その結果、三色の実験では、我々は、多くの場合、最初のファストレッド、二BCIP / NBT（またはファーストブルー）と第3のINT基板を組み合わせて使用します。それはINTを適用するとき、できるだけ早くステンド胚を撮影することをお勧めであることに注意してください。
アゾ染料の蛍光検出
これは、暗い色の沈殿物が軽いものをシャドウイングされたときに発現パターンの重複を認識することが困難な場合があることができます。 Fまたは、例えば、強く開発BCIP / NBT沈殿物を軽量化、高速色素信号をマスクすることができます。この問題を回避する1つの方法は、各染色後すぐに画像をキャプチャし、次の検出のラウンドの前に適用された色の沈殿物を除去することです。この場合、アルコール可溶性アゾ染料（ファストレッド）及びINT沈殿物は、それぞれ、第一及び第二の検出ラウンド後にエタノール洗浄により除去され、BCIP / NBT染色は最後AP-基板26として適用されます。別の可能性は、アゾ染料の蛍光特性を利用することです。ファストレッド、ローダミンフィルターを用いて可視化することができるファストブルー遠赤色フィルタ28,29を用いて観察することができるが、27を設定します 。それはあまりにも稠密になり、アゾ色素の蛍光シグナルを消光しないように、比較または発色および蛍光画像のオーバーレイは、時間で停止しなければならない共distribution.Usingこのアプローチを、BCIP / NBT信号発達の部位を明らかにすることができます反応生成物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
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