Summary
Descriviamo una procedura multi-target cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) in embrioni di Drosophila intatte che permettono il rilevamento simultaneo e specifico di tre diversi modelli di distribuzione mRNA da contrastanti precipitati di colore.
Abstract
Per analizzare reti di regolazione genica attivi durante lo sviluppo embrionale e organogenesi è essenziale definire con precisione come i diversi geni sono espressi in relazione spaziale tra loro in situ. Multi-bersaglio cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) facilita notevolmente il confronto istante di pattern di espressione genica, in quanto permette la visualizzazione distintivo di diverse specie di mRNA in colori contrastanti nello stesso campione di esempio. Ciò fornisce la possibilità di mettere in relazione i domini di espressione genica topograficamente reciprocamente con elevata precisione e definire siti espressione unica e sovrapposte. Nel protocollo presentato, si descrive una procedura MC-WISH per il confronto di modelli di espressione di mRNA di geni diversi in embrioni di Drosophila. Fino a tre sonde RNA, ciascuna specifica per un altro gene e etichettati da un aptene diverso, sono simultaneamente ibridato ai campioni embrione e successivamente rilevato da alcaline fosfatasi-based immunoistochimica colorimetrica. La procedura descritta è dettagliata qui per Drosophila, ma funziona altrettanto bene con embrioni di zebrafish.
Introduction
In ibridazione in situ (ISH) è il metodo standard per il rilevamento e la localizzazione di trascritti di RNA in un contesto morfologico, in cellule, tessuti e organismi 1. I segnali prodotti dalla procedura ISH sono comunemente visualizzati mediante sistemi di rilevamento radioattive, fluorescenti e cromogeni. Negli ultimi anni significativi progressi tecnologici in ISH fluorescente (FISH) 2 provocato notevolmente migliorata sensibilità e risoluzione, consentendo l'individuazione e la quantificazione di espressione di RNA a singola cellula e livelli sub-cellulare e la visualizzazione di RNA fino a singole molecole 3,4 .Mentre sofisticati metodi FISH singola molecola sono utilizzati per applicazioni più specializzate, ISH cromogenica è diffusa come un RNA di routine in metodo di rilevazione in situ nella ricerca e nella diagnostica clinica. Per il rilevamento cromogenico sono utilizzati reazioni enzima di precipitazione, che generano prodotti visibili in colori contrastanti nei sitidell'ibridazione 5. Questo ha il vantaggio che la visualizzazione RNA può essere combinato con macchie istologiche di routine e contesto morfologico è immediatamente evidente al microscopio campo chiaro standard. Inoltre, numerosi dei substrati colore applicate producono precipitati, che sono stabili in mezzi organici di montaggio e / o acquosi, in modo che i preparati campioni permanenti possono essere ottenuti 5.
In Drosophila, protocolli iniziali ISH applicati sonde radioisotopi marcato per il rilevamento di trascrizione su materiale sezionato 6. Anche se è difficile ricostruire da sezioni di tessuto modelli trascrizione completa di interi embrioni o sistemi di organi, l'applicazione delle procedure ISH cromogeniche con sonde non marcati radioattivamente rende possibile rilevare globalmente distribuzioni RNA in Whole-monti 7. Sebbene esistano molte variazioni di ISH cromogenico, in tipico tutto il montaggio di ibridazione in situ (WISH) protocolli hybsonde aptenici marcata ridized vengono rilevati dagli anticorpi anti-aptenici coniugate ad un enzima giornalista e trascritti di mRNA sono visualizzabili da un cromogeno precipitante.
La tavolozza di precipitati di colore diverso prodotte dal reporter enzimi fosfatasi alcalina (AP), perossidasi (POD), e beta-galattosidasi (GAL) consente il rilevamento distintivo di bersagli multipli in uno stesso campione di 8-14. Tuttavia, POD attività enzimatica dura solo per un limitato periodo di tempo e la reazione colorimetrica GAL è meno sensibile, in modo che senza ulteriore segnale (tiramide) amplificazione 15 il rilevamento di trascritti meno abbondanti può essere difficile con questi enzimi. Al contrario, l'attività duraturo di AP permette fatturato duraturo substrato ed alto rapporto segnale-rumore. Pertanto, l'individuazione sequenziale utilizzando AP giornalista enzima con i substrati di colore diverso si è dimostrata efficace nella efficace erilevamento distintivo di un massimo di tre differenti trascritti in singoli embrioni 10-12,16.
Per questo multi-target WISH cromogenico (MC-WISH) Metodo (Figura 1) 14, sonde di RNA antisenso marcate sono generate mediante trascrizione in vitro e contrassegnate con uno dei aptenici etichette disponibili. Gli embrioni sono formaldeide fisso e permeabilizzate mediante trattamento metanolo e proteinasi K digestione. Ibridazione degli embrioni avviene contemporaneamente con un massimo di tre sonde di RNA antisenso in modo diverso ogni etichetta specifiche per un gene diverso. Dopo la rimozione della sonda non legata da lavaggi stringenza ogni aptene-label è visualizzata in un giro di rilevazione separata. Un singolo round rilevamento consiste di incubazione di embrioni con un anticorpo anti-aptene accoppiato ad AP e visualizzazione RNA mediante l'applicazione di un AP-substrato che produce un precipitato di colore stabile localizzata. Dopo il rilevamento degli anticorpi e la colorazione, il applicata conju anticorpo-APcancello viene rimosso mediante lavaggio basso pH. In esperimenti multicolore, ogni turno di rilevamento impiega un anticorpo diretto contro un aptene-label differenti e ciascuno schema trascritto è visualizzata da un substrato diverso colore (Tabella 1). Gli embrioni sono montati in glicerolo e ripreso sotto un microscopio composto ad alta risoluzione usando contrasto di interferenza differenziale (DIC) ottica.
Protocol
1. Etichettatura di sonde di RNA da in vitro Trascrizione
- Montare in vitro reazione di trascrizione in una provetta 1,5 ml sotto RNase-free condizioni: 10,5 ml DEPC trattati con H 2 O, 4,0 microlitri 5x buffer di trascrizione, 1.0 ml (1 mg) linearizzato, purificato DNA stampo in DEPC trattati con H 2 O, 1.3 ml mix NTP, 0,7 microlitri aptene marcato UTP, 0,5 microlitri inibitore RiboLock RNA, 2,0 microlitri RNA polimerasi.
Nota: Il volume di reazione finale è di 20 ml. - A seconda sequenza del promotore T7 uso del modello, T3 o SP6 RNA polimerasi per la trascrizione in vitro (vedi riferimento 17).
- Selezionare digossigenina-11-UTP, biotina-16-UTP o fluoresceina-12-UTP come etichetta per la sonda di RNA. Per maggiori dettagli, vedi la discussione di hapten etichette e concentrazioni sonda in discussione.
- Mescolare reazione di trascrizione e spin down breve.
- Lasciate trascrivereper 3 ore a 37 ° C.
- Aggiungere 1 ml DNasi I RNasi-free alla reazione di trascrizione per la rimozione del DNA stampo, mescolare bene e incubare per 15 min a 37 ° C.
- Regolare con DEPC trattati con H 2 O il volume del campione di 200 l.
- Aggiungere 100 ml (0,5 vol) acetato 7.5 M di ammonio e 600 ml (3 vol) di etanolo per precipitare sonda RNA etichettati. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Non utilizzare etanolo ghiacciato, come questo può portare alla precipitazione indesiderata di nucleotidi prive di personalità giuridica.
- Centrifugare l'RNA trascritto in una centrifuga a temperatura controllata alla massima velocità (20.800 xg) per 30 minuti a 20 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante.
- Lavare il pellet risultante con etanolo al 70% a temperatura ambiente e centrifugare a 20.800 xg per 10 min a 20 ° C.
- Rimuovere il surnatante e fare attenzione a non aspirare accidentalmente il pellet sciolto. Far entrare aria pellet asciugare in provetta con coperchio aperto per pochi minuti a temperatura ambiente.
- Disrisolvere il pellet ottenuto in 100 ml di DEPC trattati con H 2 O.
- Aggiungere 300 microlitri tampone di pre-ibridazione (50% vol / vol formammide deionizzata, 5x SSC, 50 ug / ml di eparina sale di sodio, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA) e conservare a -20 ° C . Sonde possono essere a lungo termine conservati a -20 ° C.
Nota: per un primo test della sonda diluita 3 ml sonda RNA aptene marcato recentemente trascritto in 100 microlitri tampone di ibridazione per ottenere la concentrazione finale per l'esperimento WISH.
2. Trattamento dei campioni Embryo Uso Inserti
Nota: Utilizzando microtubi o piastre multi-pozzetto per l'elaborazione embrioni attraverso le varie fasi di incubazione sopporta il rischio di perdere quantità significative di embrioni accidentalmente aspirazione durante lo scambio di soluzioni. Per evitare questa perdita, può essere utile utilizzare cestelli (come inserti NetWell) per trasportare campioni embrione attraverso la procedura. Questi sono in polistireneinserti con una maglia di poliestere in basso (Figura 2A), in cui gli embrioni riposo durante la lavorazione.
- Per la lavorazione embrioni nella procedura WISH, montare gli inserti in un 12-pozzetti (Figura 2B) e aggiungere 2 ml di soluzione appropriata per ogni bene.
- Pipettare gli embrioni nei frutti con una punta di blu. Assicurarsi che tutti gli embrioni sono immersi in un liquido.
- Quando il tempo di incubazione è sopra posto inserti di embrione contenente in un'altra piastra 12 pozzetti, che viene riempito con la soluzione per il passaggio successivo.
- Utilizzare vettori e maniglie (Figura 2C) per trasferire fino a 12 campioni alla volta da una soluzione all'altra (Figura 2D).
Nota: Per ridurre i volumi richiesti, utilizzare 2,0 ml microtubi per le fasi di pre-ibridazione / ibridazione (vedi punto 4.1) e piastre da 24 pozzetti per le reazioni di colorazione (STEP 6.2). Le reazioni di ibridazione e di colorazione sono eseguite in volumi di 1001; l e 400 microlitri, rispettivamente.
- Utilizzare vettori e maniglie (Figura 2C) per trasferire fino a 12 campioni alla volta da una soluzione all'altra (Figura 2D).
3. Preparazione di embrioni per Ibridazione
- Raccogliere, dechorionate, correggere e devitellinize embrioni utilizzando le procedure standard 14,18. Gli embrioni preparate sono regolarmente archiviati in metanolo a -20 ° C.
- Embrioni di trasferimento da utilizzare per ibridazione in situ a RT e distribuire negli inserti di un 12-pozzetti riempiti con 2 ml di metanolo per pozzetto.
- Reidratare embrioni attraverso una serie di metanolo in diminuzione a temperatura ambiente. Incubare embrioni ogni volta per 3 min a: (i) 75% di metanolo in 1x PBS (ii) il 50% di metanolo in 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% di metanolo in 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% Tween-20.
- Pre-fix gli embrioni in paraformaldeide al 4% in PBS 1x per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il fissativo da 4 lavaggi per 3 min in PBS 1x, 0.1% Tween-20 a RT. Nel frattempo scongelare e preparare proteinasi K e soluzioni glicina lavoro.
- Arrestare la reazione da due 1 min risciacqui a 2 mg / ml di glicina in PBS 1x, 0,1% di Tween-20 a temperatura ambiente.
- Post-fix gli embrioni in paraformaldeide al 4% in PBS 1x per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Successivamente, rimuovere paraformaldeide fissativo lavando quattro volte per 3 minuti in 1X PBS, 0,1% di Tween-20 a RT.
- Trasferimento degli embrioni post- fisso di pre-ibridazione buffer. Conservare embrioni in buffer di pre-ibridazione a -20 ° C o direttamente procedere con l'ibridazione di sonde.
4. ibridazione di sonde
- Embrioni trasferimento conservati a -20 ° C in tampone di pre-ibridazione a RT. Distribuire embrioni in buffer di pre-ibridazione in 2,0 ml microtubes.
- Per 30 minuti al minimo, pre-embrioni ibridare i campioni a 65 ° C in tampone di pre-ibridazione.
Nota: Per la pre-ibridazione e ibridazione passi bagnomaria viene utilizzato. Durante la pre-ibridazione c'è tempo per preparare la miscela di sonde combinando fino a tre sonde di RNA antisenso, ognuno specifico per una diversa trascrizione genica e marcato con un aptene diverso. - Per ottenere la miscela di sonde, aggiungere quantità insieme appropriati (di solito tra 1 ml a 6 ml) di ciascun antisenso originale sonda RNA aptene marcato desiderato in tampone di ibridazione 100 ml (50% vol / vol formammide deionizzata, 5x SSC, 50 mg / ml eparina sale sodico, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA, 5% peso / volume destrano solfato).
Nota: L'aggiunta di destrano solfato è facoltativo. - Denaturare la miscela di sonde di RNA antisenso in un blocco di calore a 80 ° C per 5 min. Successivamente trasferire la miscela di sonde denaturato direttamente a 65 ° C.
- Eliminare la maggior parte pre-ibridazionetampone dai campioni embrione e aggiungere la miscela di sonde denaturato.
- Lasciate che i campioni embrioni ibridare per sondare mix O / N a 65 ° C.
Nota: Le temperature variano tra i 55 ° C e 65 ° C sono abitualmente utilizzati per ibridazione, pre e post-ibridazione passi. Ibridazione a 65 ° C fornisce condizioni più severe ed è consigliata in caso di problemi di fondo quando si utilizzano temperature più basse. Se non ci sono problemi di fondo, ibridazione a 55 ° C è raccomandato, che offre il vantaggio di potenza del segnale e una migliore integrità dell'embrione. - La mattina successiva, trasferire prima le soluzioni di lavaggio stringenza a 65 ° C, per assicurarsi che vengono riscaldati alla temperatura corretta in tempo.
- Trasferimento ibridazione miscela di sonde con embrioni dei microtubi 2,0 ml in inserti di un 12-pozzetti contenente 2 ml di tampone di lavaggio ibridazione pre-riscaldato (50% formammide in 2 × SSC, 0,1% di Tween-20). Posizionare la piastra a 12 pozzetti contenenti il emcampioni Bryo in un forno e incubare per 20 minuti a 65 ° C.
- Trasferire i campioni embrione a 2 ml nuovo tampone di lavaggio di ibridazione e incubare per 20 minuti a 65 ° C. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Rimuovere la sonda in eccesso di 20 min lavaggi a 65 ° C, una volta in 2 × SSC, 0,1% Tween-20 e tre volte in 0,2 × SSC, 0,1% Tween-20.
- Trasferire i campioni embrione a 1x PBS, 0,1% di Tween-20 a temperatura ambiente.
- Incubare gli embrioni in tampone bloccante (siero di pecora 8% in PBS 1x, 0.1% Tween-20) per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
5. anticorpo di rilevazione di sonde Hapten etichettati
Nota: In contrasto con l'ibridazione simultanea di tutti e tre sonde marcate in modo diverso, ogni sonda viene rilevato uno dopo l'altro in fasi distinte di incubazione anticorpi e colorazione. Pertanto, in ogni turno rilevamento viene utilizzato solo un anticorpo (o anti-digossigenina-AP o anti-fluoresceina-AP o anti-biotina-AP).
- Scegliere tra STEP5.1.1 a 5.1.3 e procedere con la preparazione della diluizione dell'anticorpo appropriato in base al aptene-etichetta che deve essere rilevato.
Nota: Per la rivelazione sequenziale delle sonde marcate in modo diverso, un'altra-aptene-anticorpo anti viene applicato in ogni ciclo di rilevamento.- Per il rilevamento di una sonda marcato con fluoresceina diluire anti-fluoresceina-AP coniuga 1: 4.000 in tampone di bloccaggio.
- Per il rilevamento di una sonda marcata con digossigenina diluire anti-digossigenina-AP coniuga 1: 4.000 in tampone di bloccaggio.
- Per il rilevamento di una sonda marcata con biotina preparare una soluzione di coniugato anti-biotina-AP a una diluizione 1: 4.000 in tampone di bloccaggio.
- Incubare embrioni nella soluzione anti-aptene-AP selezionata per 3 a 4 ore a temperatura ambiente. In alternativa, incubare O / N a 4 ° C. Non applicare tutte tre anticorpi contemporaneamente.
- Per rimuovere l'anticorpo non legato lavare gli embrioni con 1x PBS, 0,1% Tween-20 per 4 volte 15 minuti a temperatura ambiente.
- Per cambiare sistemi tampone erah due volte 15 min a RT in TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20).
6. fosfatasi alcalina Cromogenico colorazione
- Successivamente alla rilevazione degli anticorpi scegliere tra STEP 6.1.1 a 6.1.4 e procedere con una delle reazioni di colorazione cromogeni fosfatasi alcalina per ottenere il segnale di colore desiderato (vedi tabella 1). Per ogni turno di rilevazione una diversa reazione substrato cromogenico viene applicato a evidenziare ogni modello trascritto in un altro colore.
- Fast Red colorazione
- Lavare gli embrioni due volte per 15 minuti in TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% Tween-20).
- Mentre ci si lava embrioni, preparare la soluzione colorante Rosso Veloce dalla Fast Red TR / NAMP fosfatasi alcalina substrato compresse Set.
- Sciogliere una compressa tampone dalla tavoletta impostato in 1 ml di acqua distillata e mescolare vortexando per ottenere 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
- Drop un veloce tavoletta rossa TR / NAMP nel preparato Tris tampone e sciogliere con il vortex per ottenere la rapida soluzione colorante rosso.
- Soluzione limpida veloce colorazione rosso da particelle non disciolto attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron.
- Fast Blue colorazione
- Lavare due volte embrioni per 15 min in tampone fresco SB8.2 colorazione (0.1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, 0.1% Tween-20).
- Mentre ci si lava embrioni, preparare la rapida soluzione colorante blu da 50 mg / ml Fast Blue BB (in DMF) e 50 mg / ml di fosfato naftolo (in DMSO) soluzioni stock.
- Appena preparare una soluzione Fast Blue BB a 0,5 mg / ml in SB8.2.
- Appena preparare una soluzione naftolo fosfato separato a 0,5 mg / ml in SB8.2.
- Goccia a goccia aggiungere la soluzione naftolo fosfato preparato nella soluzione blu BB veloce sotto costante mescolamento con un vortice. La concentrazione finale di lavoro risultante è di 0,25 mg / ml per entrambe le componenti del substrato.
Nota: Diversi Fast Blue / naftolo phospcombinazioni di odio si traducono in diverse tonalità di colore (vedi tabella 1).
- BCIP / NBT colorazione
- Lavare due volte embrioni per 15 min in tampone fresco SB9.5 colorazione (0.1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, 0.1% Tween-20).
- Per un segnale cromogenico purpleblue, appena preparare soluzione colorante BCIP / NBT con l'aggiunta di 1 ml levamisolo, 3,5 microlitri BCIP e 4.5 ml NBT per ml di tampone colorazione SB9.5 e mescolare bene.
- INT colorazione
- Lavare gli embrioni per due volte per 15 minuti in acqua dolce tampone SB9.5 colorazione.
- Per un segnale cromogenico yellowbrown, appena preparare soluzione colorante INT con l'aggiunta di 1 ml levamisolo, 5 ml Magenta-Phos e 5 ml INT per ml di tampone colorazione SB9.5 e mescolare bene.
Nota: In alternativa, utilizzare 7,5 ml / ml BCIP / INT soluzione colorante pronto per l'uso.
- Fast Red colorazione
- Per i campioni di trasferimento dell'embrione colorazione reazionead una piastra da 24 pozzetti. Incubare ciascun campione in 400 ml di soluzione colorante scelto nel buio.
- Monitorare occasionalmente segnalare sviluppo allo stereomicroscopio. Arrestare la reazione di colorazione, quando la potenza del segnale desiderato è ottenuto e prima significativo segnale di fondo si osserva.
- Per fermare la reazione cromogena, trasferire embrioni colorati in inserti di un 12-pozzetti contenente 2 ml di TNT per pozzetto. Sciacquare gli embrioni macchiato due volte in TNT.
- Lavare gli embrioni due volte per 10 min a 1 × PBS, 0,1% di Tween-20 a RT per rimuovere substrato residua.
7. Anticorpo Rimozione / fosfatasi alcalina Inattivazione
- Rimuovere l'anticorpo e inattivare fosfatasi alcalina mediante incubazione in 2 ml di soluzione di stop pH basso (0,1 M glicina-HCl pH 2,2, 0,1% Tween-20) per 10 minuti a RT.
- Risciacquare per 1 min con 2 ml di 1 × PBS, 0,1% di Tween-20 a RT.
- Lavare 3 volte per 3 min a 1 × PBS, 0,1% di Tween-20 a RT.
8. Secondo rilevamento rotonda
- Per rilevare il modello di distribuzione di una seconda trascrizione procedere con la rilevazione di anticorpi di sonde aptenici marcati (STEP 5,1-5,4) utilizzando coniugati anticorpo-AP mirate contro il secondo aptene-label.
- Eseguire fosfatasi alcalina colorazione cromogenico (STEP 6.1 a 6.5) applicare una combinazione substrato che produce un colore contrastante a quella utilizzata nel primo turno di rilevamento (per i colori disponibili vedi Tabella 1).
- Rimuovere secondo coniugato anticorpo-AP come descritto al punto 7,1-7,3.
9. Terzo turno di rilevamento
- Per rilevare il modello di distribuzione di un terzo trascrizione, procedere con la rilevazione di anticorpi di sonde aptenici-marcato (STEP 5.1 a 5.4) mediante anticorpo-AP coniuga specifico per il terzo aptene-label.
- Eseguire fosfatasi alcalina colorazione cromogenico (STEP 6,1-6,5) l'applicazione di una combinazione di substrato che non era apmoltiplicato nei turni precedenti di rilevamento. Scegliere una reazione cromogenica che produce un colore precipitare facile da distinguere da quelli degli ultimi due turni di rilevazione (per la scelta del colore vedi tabella 1).
10. Montaggio e Imaging
- Trasferire embrioni correttamente macchiati al 30% glicerolo in PBS e incubare fino embrioni sono completamente immersi in soluzione di glicerolo. Sono ben equilibrati quando si depositano sul fondo.
- Trasferimento degli embrioni al 70% glicerolo in H 2 O e lasciare equilibrare a temperatura ambiente. Gli embrioni colorati possono essere memorizzati in 70% glicerolo a 4 ° C.
- Per il montaggio, pipetta macchiato embrioni in una gocciolina glicerolo 70% su un vetrino oggetto e senza toccare i distanziatori incollati alla slitta (figura 3). Applicare la polizza di copertura.
- Vista montato embrioni sotto un microscopio da dissezione. Spostare il vetrino applicata, in modo che gli embrioni ruotano per l'orientamento desiderato.
- Osservare correttamenteembrioni orientati ad alta risoluzione (20X, 40X obiettivi) sotto un microscopio composto con differenziali ottica Interferenza contrasto.
- Catturare immagini con una fotocamera digitale a colori e risparmiare sulle dispositivo di archiviazione digitale.
Representative Results
Il protocollo descritto permette la visualizzazione simultanea di più modelli trascritti in diversi colori. MC-WISH offre il vantaggio di confrontare direttamente i pattern di espressione di geni diversi nello stesso embrione. A titolo di esempio, i modelli di espressione di spiracoli vuote (SME) 19, Fushi tarazu (FTZ) 20 e sciatto abbinato 1 (SLP1) 21 sono direttamente confrontati in Drosophila melanogaster blastoderma embrioni stadio e visualizzati in una varietà di sfumature di colore (Figura 4) .
Diverse combinazioni di substrato AP sono disponibili per ottenere un panel di contrasto precipitati colore (Tabella 1). Il precipitato colore rosso prodotto da Fast Red e il precipitato viola prodotta da BCIP / NBT può essere facilmente distinti e sono quindi utilizzati più comunely in esperimenti di due colori (Figura 4A). Tuttavia, la macchia BCIP / NBT può rapidamente trasformarsi in un colore piuttosto scuro, in modo che il colore rosso veloce è mascherato in caso di parziale co-distribuzione dei trascritti. Pertanto, l'applicazione di Fast Blue può essere di vantaggio, che genera, prodotti verdi e viola blu in combinazione con NAMP, NAGP e NABP rispettivamente (Tabella 1). La combinazione di Fast blu con NAMP dà un colore azzurro che è facilmente distinguibile dal prodotto Red veloce nei domini di espressione adiacenti o sovrapposti come mostrato qui per ems e siti espressione SLP1 visualizzati rispettivamente in rosso e blu, (Figura 4B). La combinazione blu NAGP veloce fornisce un forte contrasto simile alla rapida macchia rossa, in modo che il dominio verde SME è chiaramente distintivo dal sito espressione SLP1 rosso (Figura 4C). Tuttavia, se lo SME e siti espressione SLP1 sono deprotetta da Fast Blue NABP e Fast Red, rispettivamente, la violetta risultante e precipitati di colore rosso sono meno discernibili (Figura 4D). Come accennato in precedenza, Fast Red e Fast Blue NAGP sono facili da distinguere come mostrato da SLP1 ed espressione FTZ in rosso e verde, rispettivamente (Figura 4D).
MagentaPhos in combinazione con INT produce un precipitato giallo, che viene utilizzato per rivelare l'espressione segmentale FTZ (figura 4C, E). Il precipitato di colore giallo genera buon contrasto ai substrati di colore blu come esemplificato dal rilevamento di SLP1 e FTZ con Fast Blue NAMP e MAG / INT, rispettivamente (figura 4E). Tuttavia, il precipitato giallo è meno facile distinguibile dal prodotto Red veloce. Il dominio espressione tinto giallo di SME può essere difficilmente distinta s nguished dall'espressione rostrale SLP1 mostrato in rosso (Figura 4F). Pertanto, la combinazione di substrati di colore deve essere scelto con cura per ogni esperimento.
Figura 1. Diagramma di flusso di MC-WISH. Per la visualizzazione multicolore di tre modelli unici di trascrizione, scegliere tra diversi coniugati anticorpo-AP e combinazioni substrato di colore in ogni ciclo di rilevamento. Abbreviazioni: AP, fosfatasi alcalina; BIO, biotina; DIG, digossigenina; FLUO, fluoresceina. Per le altre abbreviazioni vedere leggende di Figura 4 e Tabella 1. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. Inserisce come portatori di embrioni. (A) Inserisce montati sul fondo con membrane in poliestere di 15 mm di diametro e 74 micron dimensione delle maglie sono utilizzati come portatori di embrioni di Drosophila. (B) Gli inserti sono assemblati in piastre da 12 pozzetti, che funzionano come vassoi serbatoio per le varie soluzioni. (C) i vettori disponibili e maniglie consentono l'elaborazione di (D) 12 inserti / campioni embrioni contemporaneamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Montaggio embrioni macchiati. Gli embrioni sono montati in una goccia di 70% glicerolo tra due pile di lamelle, che funzionano come distanziatori. Movimento dolce delle appmentito largo coprioggetti aiuta a ruotare gli embrioni montati in l'orientamento desiderato per l'osservazione e la fotografia. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Visualizzazione multicolore di trascritti di mRNA in embrioni di Drosophila. Esempi di esperimenti MC-WISH in embrioni di Drosophila sono mostrati dalla vista laterale. I pattern di espressione di mRNA di spiracoli vuoti (SME), Fushi tarazu (FTZ) e sciatto Paired 1 (SLP1) sono visualizzati da diverse combinazioni di colori substrato AP, che sono indicati su ogni pannello. Le trascrizioni sono state rilevate da (A) FTZ FLUO e SME DIG, (
| Combinazione substrato | Aggiungi a 1 ml di tampone AP | Concentrazione [ug / ml] | Tampone AP | Colore | Sensibilità del segnale |
| BCIP NBT | 3,5 microlitri 4,5 microlitri | 175 337.5 | SB9.5 | porpora | +++ |
| MAG INT | 5 ml 5 ml | 250 250 | SB9.5 | giallo | + |
| Soluzione madre BCIP / INT | 7,5 ml | 250 250 | SB9.5 | giallo | + |
| Fast Blue NAMP | 5 ml 5 ml | 250 250 | SB8.2 | blu | ++ |
| Fast Blue NABP | 20 l 10 microlitri | 1.000 500 | SB8.2 | viola | ++ |
| Fast Blue NAGP | 10 ml 10 ml | 500 500 | TT8.2 | verde | + |
| Fast Red NAMP | 1 compressa | 1.000 400 | TT8.2 | rosso | ++ |
Tabella 1. combinazioni substrato Abbreviazioni: +++, forte;. ++, Media; +, Debole NBT, cloruro di 4-nitro-blu-tetrazolio; BCIP, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato; INT, 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-tetrazolio cloruro; MAG, Magenta-Phos, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-fosfato, NAMP, naftol-AS-MX-fosfato; NABP, Naphthol-AS-BI-fosfato; NAGP, Naphthol-AS-GR-fosfato; SB9.5, buffer di colorazione a pH 9,5; SB8.2, buffer di colorazione a pH 8,2; TT8.2, tampone Tris-Tween a pH 8.2.
Discussion
In ibridazione in situ (ISH) con sonde di acidi nucleici marcati radioattivamente viene spesso utilizzato per rilevare la localizzazione di RNA su sezioni di tessuto. Il metodo ISH radioattivo, tuttavia, è che richiede tempo, meno sensibile, e non consente apprezzamento complete distribuzioni trascrizione di interi-monti. Al contrario, il metodo MC-WISH qui descritta permette il confronto diretto di più domini di espressione genica in colori contrastanti all'interno embrioni intatti. MC-WISH ha il vantaggio che contesto istologico è immediatamente evidente e visualizzata semplicemente microscopio campo chiaro standard. Ciò fornisce la possibilità di mettere in relazione i domini di espressione genica topograficamente reciprocamente con elevata precisione e definire siti espressione unica e sovrapposte in modo veloce ed affidabile. D'altra parte, ISH fluorescente multiplato (FISH) è più potente rispetto alla sensibilità e risoluzione ed è preferibilmente utilizzato, se cellulare o addirittura ri subcellulareè necessaria una soluzione di rilevamento mRNA.
L'ampio spettro di trascrizioni che è stato mappato da MC-WISH suggerisce che praticamente qualsiasi trascrizione può essere analizzato non solo in embrione, ma anche nei tessuti larvali e adulti e in specie diverse da Drosophila. Infatti, la procedura descritta dettagliatamente qui per Drosophila, funziona in modo simile efficiente con embrioni di zebrafish 11,16,22. Inoltre, il metodo MC-WISH può essere adattato ad una grande varietà di invertebrati e vertebrati embrioni e campioni di tessuto.
Hapten-etichette e le concentrazioni di sonda
Usiamo abitualmente fluoresceina, digossigenina, e biotina come etichette aptenici di sonde di RNA. Inoltre, dinitrofenolo sonde marcate possono essere applicate, che sono stati introdotti in esperimenti WISH zebrafish 23-25. Sonde marcato con fluoresceina mostrano una sensibilità minore rispetto alle altre aptenici etichette, in modo che fluoresceina è meglio utilizzato fo il rilevamento dei trascritti abbondanti. Ogni sonda appena trascritto viene prima testato in un esperimento WISH singolo, dove la sua performance è valutata sia utilizzando BCIP / NBT o Fast Red come substrato. Una concentrazione sonda viene considerato ottimale quando un segnale forte senza sviluppo di fondo viene raggiunto entro pochi minuti per ora.
Per assicurarsi che i domini di espressione di interesse sono stati individuati in tutta la loro estensione da MC-WISH, è essenziale per visualizzare ogni modello trascritto da monomarca esperimenti WISH utilizzando la combinazione substrato più sensibile, BCIP / NBT. Questo assicura che i domini di espressione deboli non sono trascurati nell'esperimento multi-target. Per compensare la minore sensibilità delle altre combinazioni substrato è essenziale utilizzare raddoppiato (da triplicato) concentrazioni sonda rispetto allo standard BCIP / NBT colorazione.
Basso inattivazione pH
L'inattivazione passo pH basso può portare ala disintegrazione parziale delle antisenso aptenici marcata ibridi RNA sonda / senso di mRNA con conseguente rilevazione del segnale ridotta nel secondo e terzo round di colorazione. Per minimizzare la perdita di sensibilità, le fasi di inattivazione sono il più breve possibile. Abbiamo sperimentato che un tempo di incubazione 10 min a pH basso è sufficiente per l'eliminazione di AP-attività. I successivi lavaggi rapidi in grandi volumi garantiscono rapida diluizione di non legati coniugati anticorpo-AP e prevenire ri vincolante alle sonde haptenized. Procedure alternative includono paraformaldeide fissazione e l'inattivazione di calore. Tuttavia, alcuni dei precipitati a colori non sono stabili al calore e fissazione paraformaldeide potrebbe non essere sufficiente per una completa inattivazione di AP. Inattivazione incompleta della prima applicata anticorpo coniugato AP può portare a ri-visualizzazione del pattern mRNA nel seguente rilevamento turno portando a falsi positivi sovrapposizione nell'espressione con la seconda specie di mRNA da rilevare. Pertanto, in un esperimento di controllo the gli embrioni sono divisi in due frazioni dopo inattivazione della prima applicato anticorpo-AP coniugato. Il secondo anticorpo coniugato con AP viene omesso dalla frazione di controllo e non deve generare un segnale nella seconda reazione cromatica. Tuttavia, se la seconda reazione cromatica genera un modello di distribuzione segnale corrispondente alla prima, poi la procedura di inattivazione non era efficiente. In questo caso, il tempo di incubazione in soluzione di stop basso pH dovrebbe essere prolungato per il prossimo esperimento.
Ordini di applicazione substrato AP
Poiché la sensibilità gocce ogni successivo ciclo di rilevamento, è opportuno rilevare mRNA meno abbondanti prima trascritti più abbondanti. Inoltre, il Fast Red e veloci combinazioni substrato blu sono molto meno sensibili rispetto al purpleblue BCIP / NBT macchia, in modo che i coloranti veloci sono preferibilmente applicati al primo turno colorazione per il rilevamento del più forte trascrizione espresso. Anche questo hcome il vantaggio che la successiva BCIP / NBT colorazione può essere monitorato e fermato in tempo prima che il segnale diventa troppo purpleblue scura in relazione alle leggeri coloranti veloci. Così in un esperimento due colori standard, prima forte espresso mRNA viene rilevato da Fast Red e secondo il più debole da BCIP / NBT. Come alternativa ai coloranti veloci combinazioni substrato INT giallo possono essere applicate, che però produrre precipitati che diventare diffuso dopo qualche tempo. Pertanto BCIP / INT si applica esclusivamente nel turno precedente colorazione. Di conseguenza, in un esperimento a tre colori spesso usiamo primo Fast Red, secondo BCIP / NBT (o Fast Blue) e il terzo una combinazione substrato INT. Si noti che è consigliabile fotografare embrioni macchiate appena possibile quando si applica INT.
Rilevazione fluorescente di coloranti azoici
Può essere a volte difficile riconoscere pattern di espressione di sovrapposizione quando un precipitato colore più scuro è shadowing uno leggero. Fo l'esempio, un fortemente sviluppato precipitato BCIP / NBT può mascherare i segnali di tintura veloce più leggeri. Un modo per aggirare questo problema è quello di catturare le immagini subito dopo ogni colorazione e rimuovere il precipitato colore applicato prima del prossimo turno di rilevamento. In questo caso, alcool-solubile azo colorante (Fast Red) e INT precipitati vengono rimossi da lavaggi etanolo dopo la prima e la seconda rilevazione, rispettivamente, e BCIP / NBT colorazione viene applicata come ultimo AP-substrato 26. Un'altra possibilità è quella di sfruttare le proprietà fluorescenti di coloranti azoici. Fast Red può essere visualizzato utilizzando il filtro rodamina imposta 27, mentre Fast Blue può essere osservato con i filtri lontano-rosso 28,29. Confronto o sovrapposizione di immagini cromogenici e fluorescenti possono rivelare il luogo di sviluppo segnale BCIP / NBT co-distribution.Using questo approccio deve essere fermato in tempo, in modo che non diventi troppo denso e spegnere il segnale fluorescente del colorante azoico prodotto di reazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
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