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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Multi-cible chromogénique totalité montage Published: January 31, 2016 doi: 10.3791/53830
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The Wenner-Gren Institute (MBW), Stockholm University

Summary

Nous décrivons un montage entier hybridation in situ (MC-WISH) procédure chromogène multi-cible dans embryons de drosophile intactes permettant la détection simultanée et spécifique de trois modes de distribution de l'ARNm différents en comparant précipités de couleur.

Abstract

Pour analyser les réseaux de régulation des gènes actifs pendant le développement embryonnaire et l'organogenèse il est indispensable de définir avec précision la façon dont les différents gènes sont exprimés dans une relation spatiale les uns aux autres in situ. Multi-cible chromogène ensemble de montage hybridation in situ (MC-WISH) facilite grandement la comparaison instantanée de profils d'expression des gènes, car il permet la visualisation distinctif des différentes espèces d'ARNm dans des couleurs contrastantes dans le même échantillon de l'échantillon en. Ceci permet d'obtenir la possibilité de relier des domaines d'expression de gène topographiquement les uns aux autres avec une grande précision et pour définir des sites uniques qui se chevauchent et expression. Dans le protocole présenté, nous décrivons une procédure MC-WISH pour comparer les profils d'expression d'ARNm de gènes différents dans les embryons de drosophile. Jusqu'à trois sondes d'ARN, chacun spécifique d'un autre gène et marqué par un haptène différents, sont simultanément hybridée à des échantillons d'embryons et ensuite détecté par un alcaline phosphatase basée immunohistochimie colorimétrique. La procédure décrite est détaillé ici pour la drosophile, mais fonctionne aussi bien avec des embryons de poisson zèbre de.

Introduction

L'hybridation in situ (ISH) est la méthode standard pour la détection et la localisation des transcrits d'ARN dans un contexte morphologique, à l'intérieur de cellules, de tissus et d'organismes 1. Les signaux produits par la procédure de ISH sont habituellement visualisés par des systèmes de détection radioactifs, fluorescents et chromogènes. Au cours des dernières années, des progrès technologiques importants dans ISH fluorescente (FISH) 2 ont entraîné considérablement amélioré la sensibilité et la résolution, permettant la détection et la quantification d'expression de l'ARN à cellule unique et les niveaux sub-cellulaires et de l'ARN visualisation jusqu'à molécules simples 3,4 .While méthodes FISH seule molécule sophistiqués sont utilisés pour des applications plus spécialisées, ISH chromogène est très répandue comme un ARN de routine dans la méthode de détection in situ dans la recherche et le diagnostic clinique. Pour la détection chromogène réactions de précipitation de l'enzyme sont utilisés, qui génèrent des produits visibles dans des couleurs contrastantes sur les sitesde 5 l'hybridation. Ceci présente l'avantage que l'ARN visualisation peut être combinée avec la routine coloration histologique et morphologique contexte est immédiatement évident par microscopie en fond clair standard. En outre, de nombreux des substrats de couleurs appliquées produisent des précipités, qui sont stables dans des milieux de montage organiques et / ou aqueux, de sorte que les préparations d'échantillonnage permanentes peuvent être obtenus 5.

Chez la drosophile, les protocoles de ISH initiale appliquée sondes de radio-isotopes marqué pour la détection de la transcription sur le matériel en coupe 6. Bien qu'il soit difficile de reconstruire à partir de coupes de tissus modèles complets de transcription d'embryons entiers ou des systèmes d'organes, l'application des procédures de ISH chromogènes avec des sondes non marquées de manière radioactive permet d'globalement détecter les distributions d'ARN dans entières montures 7. Bien qu'il existe de nombreuses variantes de ISH chromogène, dans le typique entier monter hybridation in situ (WISH) dans les protocoles hybdes sondes d'haptène marqué ridized sont détectées par des anticorps anti-haptène conjugué à une enzyme rapporteur et transcrits d'ARNm sont visualisées par un chromogène de précipitation.

La palette de couleurs différentes de précipités produits par le reporter enzymes phosphatase alcaline (AP), la peroxydase de raifort (POD), et la bêta-galactosidase (GAL) permet la détection de cibles multiples distinctif dans un seul et même échantillon 14.8. Cependant, POD activité enzymatique ne dure que pendant une période de temps limitée et la réaction colorimétrique GAL est un peu moins sensible, de sorte que sans supplémentaire signal (tyramide) amplification 15 la détection de transcrits moins abondantes peut être difficile avec ces enzymes. En revanche, l'activité durable de AP permet de chiffre d'affaires de substrat de longue durée et rapport signal-sur-bruit. Par conséquent, la détection séquentielle utilisant AP enzyme rapporteur avec des substrats de différentes couleurs a fait ses preuves dans l'efficace etdétection distinctif de jusqu'à trois transcriptions différentes dans les embryons simples 10-12,16.

Pour ce souhait chromogène multi-cible (MC-WISH) méthode (Figure 1) 14, des sondes d'ARN antisens marquées sont générées par transcription in vitro et marqués avec un des haptène-étiquettes disponibles. Les embryons sont formaldéhyde fixées et perméabilisées par traitement à la protéinase K et du methanol digestion. L'hybridation des embryons est effectuée simultanément avec jusqu'à trois sondes ARN antisens marquées différemment chaque spécifiques d'un gène différent. Après le retrait de la sonde non liée par des lavages de stringence chaque haptène-label est visualisée dans un tour séparé de détection. Un seul tour de détection se compose d'incubation d'embryons avec un anticorps anti-haptène couplé à AP et de l'ARN visualisation par application d'un AP-substrat qui produit un précipité de couleur stable localisée. Après la détection d'anticorps et la coloration, l'Conju anticorps AP appliquéeporte est éliminé par un lavage à faible pH. Dans des expériences multicolores, chaque cycle de détection emploie un anticorps dirigé contre un haptène-marqueur différent et chaque motif de transcription est révélée par un substrat de couleur différente (tableau 1). Les embryons sont montées dans du glycerol et imagés sous un microscope composé à haute résolution en utilisant contraste interférentiel différentiel (DIC) optique.

Protocol

1. Le marquage des sondes d'ARN par transcription in vitro

  1. Assembler in vitro réaction de transcription dans un microtube de 1,5 ml sous la RNase-free conditions: 10,5 ul traitée au DEPC H 2 O, 4,0 pi de 5 x tampon de transcription, 1,0 ul (1 ug) linéarisé, un ADN matrice purifié traitée au DEPC H 2 O, 1,3 ul NTP Mix, 0,7 pi haptène marqué UTP, inhibiteur de l'ARN RiboLock 0,5 pi, 2,0 pi ARN polymérase.
    Remarque: Le volume final de la réaction est de 20 pi.
  2. Selon séquence promotrice utilisation de T7 du modèle, T3 ou SP6 ARN polymérase pour la transcription in vitro (voir référence 17).
  3. Sélectionnez la digoxigénine-11-UTP, biotine-UTP-16, ou la fluorescéine-12-UTP comme marqueur pour la sonde d'ARN. Pour plus de détails, voir la discussion sur haptène- étiquettes et les concentrations de sonde dans la discussion.
  4. Mélanger réaction de transcription et de spin bas prochainement.
  5. Laissez transcrirependant 3 heures à 37 ° C.
  6. Ajouter 1 ul DNase sans RNase-I de la réaction de transcription pour l'élimination de la matrice ADN, bien mélanger, et incuber pendant 15 min à 37 ° C.
  7. Ajuster avec traitée au DEPC H 2 O, le volume de l'échantillon de 200 ul.
  8. Ajouter 100 pi (0,5 vol) acétate 7,5 M d'ammonium et 600 pi (3 vol) éthanol pour précipiter sonde ARN marqué. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
    1. Ne pas utiliser de l'éthanol glacé, car cela pourrait conduire à une précipitation indésirable de nucléotides non constituées en société.
  9. Isoler l'ARN transcrit dans une centrifugeuse à température contrôlée à la vitesse maximale (20 800 xg) pendant 30 min à 20 ° C. Aspirer soigneusement surnageant.
  10. Laver le culot résultant avec 70% d'éthanol à la température ambiante et centrifuger à 20 800 g pendant 10 min à 20 ° C.
  11. Retirer le surnageant et faire attention de ne pas aspirer accidentellement le culot lâche. Laissez l'air de culot sec dans le microtube avec couvercle ouvert pendant quelques minutes à la température ambiante.
  12. Disrésoudre le culot obtenu dans 100 ul d'traitée au DEPC H 2 O.
  13. Ajouter 300 pi de tampon de pré-hybridation (50% vol / vol formamide déminéralisé, 5x SSC, 50 pg / ml d'héparine sel de sodium, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula ARN) et conserver à -20 ° C . Les sondes peuvent être à long terme conservés à -20 ° C.
    Remarque: Pour un premier test de la sonde diluée 3 pi sonde d'ARN haptène marqué récemment transcrits dans un tampon de 100 pi d'hybridation pour obtenir la concentration finale de l'expérience de souhaits.

2. Traitement des échantillons d'embryons aide d'inserts

Remarque: L'utilisation des microtubes ou plaques multi-puits pour le traitement des embryons à travers les différentes étapes d'incubation supporte le risque de perdre des quantités importantes d'embryons par accidentellement aspiration lors de l'échange de solutions. Pour éviter cette perte, il peut être utile d'utiliser des paniers (tels que des inserts Netwell) pour porter les échantillons d'embryons par la procédure. Ce sont en polystyrèneinserts avec une maille de polyester en bas (figure 2A), sur laquelle reposent les embryons en cours de traitement.

  1. Pour le traitement des embryons dans la procédure de WISH, assembler les inserts dans une plaque de 12 puits (figure 2B) et ajouter 2 ml de la solution appropriée à chaque puits.
  2. Introduire à la pipette les embryons dans les inserts en utilisant une pointe bleue. Assurez-vous que tous les embryons sont immergés dans un liquide.
  3. Lorsque le temps d'incubation est terminée place les inserts contenant l'embryon dans une autre plaque de 12 puits, qui est rempli de la solution pour la prochaine étape.
    1. Utilisez les transporteurs et les poignées (figure 2C) pour transférer jusqu'à 12 échantillons à la fois d'une solution à l'autre (figure 2D).
      Remarque: Pour réduire les volumes nécessaires, utiliser 2,0 ml microtubes pour les étapes de pré-hybridation / hybridation (voir l'étape 4.1) et des plaques à 24 puits pour les réactions de coloration (STEP 6.2). Les réactions d'hybridation et de coloration sont réalisées dans des volumes de 1001; l et 400 ul, respectivement.

3. Préparation d'embryons pour l'hybridation

  1. Collecter, dechorionate, fixer, et devitellinize embryons utilisant des procédures standard 14,18. Les embryons préparés sont stockés régulièrement dans le methanol à -20 ° C.
  2. Embryons de transfert pour être utilisées pour l'hybridation in situ à la température ambiante et de distribuer les inserts dans une plaque de 12 puits remplie de 2 ml de methanol par puits.
  3. Réhydrater embryons à travers une série de méthanol en diminuant à la température ambiante. Incuber les embryons à chaque fois pendant 3 min à: (i) 75% de methanol dans du 1 x PBS (ii) 50% de methanol dans du 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 (iii) 25% de methanol dans du 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 (iv ) 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 (v) 1 x PBS, 0,1% de Tween-20.
  4. Pré-fixer les embryons dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS 1X pendant 20 min à température ambiante.
  5. Retirer le fixateur par 4 lavages de 3 min dans du PBS 1x, 0,1% de Tween-20 à température ambiante. Pendant ce temps dégeler et préparer protéinase K et solutions de glycine de travail.
    6. Remarque: le traitement de la protéinase K est équilibré à la force de fixation embryon. Par exemple, si l'étape de pré-fixation (3,4) est omis, la protéinase K traitement plus doux peut être appliquée.
  6. Arrêter la réaction par deux rinçages de 1 min à 2 mg / ml de glycine dans du PBS 1x, Tween-20 à 0,1% à température ambiante.
  7. Post-fixer les embryons dans du paraformaldehyde à 4% dans du PBS 1x pendant 20 min à température ambiante.
  8. Par la suite, éliminer par lavage fixateur de paraformaldehyde à quatre reprises pendant 3 minutes dans du PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à température ambiante.
  9. Embryons post-fixe transfert de pré-tampon d'hybridation. La conservation des embryons dans un tampon de pré-hybridation à 20 ° C ou directement procéder à l'hybridation des sondes.

4. hybridation de sondes

  1. Transfert des embryons conservés à -20 ° C dans un tampon de pré-hybridation à température ambiante. Distribuer des embryons dans un tampon de pré-hybridation dans 2,0 ml Microtubes.
  2. Pendant 30 minutes au minimum, de pré-hybridation des échantillons d'embryon à 65 ° C dans un tampon de pré-hybridation.
    Remarque: Pour le pré-hybridation et l'hybridation étapes un bain d'eau est utilisé. Pendant la pré-hybridation, il est temps de préparer le mélange de la sonde en combinant jusqu'à trois sondes d'ARN antisens, chacun spécifique d'un transcrit de gène différent et marqué avec un haptène différent.
  3. Pour obtenir le mélange de sondes, ajouter des quantités conjointement appropriées (généralement entre 1 ul à 6 ul) de chaque antisens sonde d'ARN souhaitée originale haptène marqué dans du tampon d'hybridation de 100 pi (50% v / v de formamide désionisé, 5x SSC, 50 ug / ml sel de sodium d'héparine, 0,1% en volume / volume de Tween-20, 5 mg / ml d'ARN torula, 5% en poids / volume de sulfate de dextran).
    Remarque: L'addition de sulfate de dextrane est facultative.
  4. Dénaturer le mélange sonde d'ARN antisens dans un bloc chauffant à 80 ° C pendant 5 min. Par la suite transférer la sonde mélange dénaturé directement à 65 ° C.
  5. Éliminer la majeure partie de la pré-hybridationtampon à partir des échantillons d'embryons et d'ajouter la sonde mélange dénaturé.
  6. Laissez échantillons d'embryons hybrident pour sonder mélange O / N à 65 ° C.
    Note: Les températures comprises entre 55 ° C et 65 ° C sont couramment utilisés pour l'hybridation, avant et après l'hybridation étapes. Hybridation à 65 ° C offre des conditions plus strictes et est recommandé en cas de problèmes de fond lors de l'utilisation des températures plus basses. Si il n'y a pas de problèmes de fond, l'hybridation à 55 ° C est recommandée, ce qui offre l'avantage de la force du signal accrue et une meilleure intégrité de l'embryon.
  7. Le lendemain matin, d'abord transférer les solutions drastiques de lavage à 65 ° C, pour vous assurer qu'ils sont chauffés à la température correcte dans le temps.
  8. Transfert hybridation sonde mélange avec des embryons provenant des microtubes 2,0 ml dans des inserts d'une plaque à 12 puits contenant 2 ml de tampon de lavage hybridation préchauffé (50% de formamide dans 2 x SSC, 0,1% de Tween-20). Placer la plaque de 12 puits contenant l'embryo échantillons dans un four et incuber pendant 20 min à 65 ° C.
  9. Embryon échantillons de transfert à 2 ml nouveau tampon de lavage d'hybridation et incuber pendant 20 min à 65 ° C. Répétez cette étape une fois de plus.
  10. Enlever l'excès de sonde en 20 min lavages à 65 ° C, une fois dans 2 x SSC, 0,1% de Tween-20 et trois fois dans 0,2 x SSC, 0,1% de Tween-20.
  11. Transférer les échantillons d'embryons de 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 à température ambiante.
  12. Incuber les embryons dans du tampon de blocage (sérum de mouton 8% dans du PBS 1x, 0,1% de Tween-20) pendant au moins 30 min à température ambiante.

5. Anticorps de détection de sondes marquées haptène

Remarque: Contrairement à l'hybridation simultanée de toutes les trois sondes marquées de façon différente, chaque sonde est détectée après une autre incubation en cycles de coloration et d'anticorps distincts. Par conséquent, dans chaque cycle de détection seul est utilisé un anticorps (soit anti-digoxigénine-AP ou anti-fluorescéine-AP ou anti-biotine-AP).

  1. Choisissez entre STEP5.1.1 à 5.1.3 et procéder à la préparation de la dilution d'anticorps appropriée en fonction de l'haptène-étiquette qui doit être détectée.
    Remarque: Pour la détection séquentielle des sondes marquées de façon différente, un autre anti-haptène-anticorps est appliquée à chaque cycle de détection.
    1. Pour la détection d'une sonde marquée à la fluorescéine dilué anti-fluorescéine-AP conjugue 1: 4000 dans du tampon de blocage.
    2. Pour la détection d'une sonde marquée à la digoxigénine dilué anti-digoxigénine-AP conjugue 1: 4000 dans du tampon de blocage.
    3. Pour la détection d'une sonde marquée à la biotine préparer une solution anti-biotine conjugué à AP-une dilution 1: 4000 dans du tampon de blocage.
  2. Incuber embryons dans la solution anti-haptène-AP sélectionné pour 3 à 4 heures à température ambiante. Alternativement, incuber O / N à 4 ° C. Ne pas appliquer tous les trois anticorps simultanément.
  3. Afin d'éliminer l'anticorps non lié laver les embryons avec 1x PBS, 0,1% de Tween-20 pour 4 fois 15 min à température ambiante.
  4. Pour changer les systèmes de tampon a étéh deux fois 15 min à température ambiante dans TNT (0,1 M de Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M de NaCl, 0,1% de Tween-20).

6. phosphatase alcaline chromogénique coloration

  1. À la suite de la détection d'anticorps choisir entre STEP 6.1.1 à 6.1.4 et procéder à un nouveau de la phosphatase alcaline réactions de coloration chromogènes pour obtenir le signal de couleur désirée (voir tableau 1). Pour chaque tour de la détection d'une réaction chromogénique différente est appliquée à mettre en évidence chaque profil de transcription dans une autre couleur.
    1. La coloration Fast Red
      1. Laver deux fois les embryons pendant 15 min dans TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% de Tween-20).
      2. Bien que le lavage des embryons, préparer la solution de coloration rouge rapide du Fast Red TR / NAMP phosphatase alcaline Substrat Comprimés Set.
      3. Dissoudre un comprimé tampon de la tablette située dans 1 ml d'eau distillée et mélanger au vortex pour obtenir 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
      4. Mettez une pastille rouge TR / NAMP rapide en prêt le Tris tampon et dissoudre par vortex pour obtenir la solution de coloration rouge rapide.
      5. Clear Fast Red solution de coloration à partir de particules non dissoutes à travers un filtre à seringue de 0,2 pm.
    2. Fast Blue Staining
      1. Laver deux fois les embryons pendant 15 min dans du tampon de coloration SB8.2 frais (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, 0,1% de Tween-20).
      2. Bien que le lavage des embryons, préparer la solution de coloration au bleu rapide à partir de 50 mg / ml de Fast Blue BB (dans le DMF) et 50 mg / ml de phosphate de naphtol (dans du DMSO) des solutions mères.
      3. Fraîchement préparer une solution Fast Blue BB à 0,5 mg / ml dans SB8.2.
      4. Fraîchement préparer une solution de phosphate de naphtol séparé à raison de 0,5 mg / ml dans SB8.2.
      5. Ajouter goutte à goutte la solution de phosphate de naphtol préparée dans la solution bleu rapide BB sous mélange constant avec un vortex. La concentration de travail finale obtenue est de 0,25 mg / ml pour les deux composants de substrat.
        Remarque: Différents Fast Blue / naphtol phospcombinaisons de haine résultent dans différentes nuances de couleur (voir tableau 1).
    3. BCIP / NBT coloration
      1. Laver deux fois les embryons pendant 15 min dans du tampon de coloration SB9.5 frais (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, 0,1% de Tween-20).
      2. Pour un signal chromogénique purpleblue, fraîchement préparer la solution de coloration BCIP / NBT en ajoutant 1 ul lévamisole, 3,5 pi et 4,5 pi BCIP NBT par ml de tampon de coloration de SB9.5 et bien mélanger.
    4. INT coloration
      1. Laver les embryons deux fois pendant 15 minutes dans un tampon de coloration SB9.5 frais.
      2. Pour un signal chromogénique yellowbrown, fraîchement préparer la solution de coloration INT en ajoutant 1 ul lévamisole, 5 pi Magenta-Phos et 5 pi INT par ml de tampon de coloration de SB9.5 et bien mélanger.
        Remarque: Vous pouvez également utiliser 7,5 pl / ml BCIP / INT solution de coloration prête à l'emploi.
  2. Pour les échantillons d'embryons de transfert de réaction de colorationà une plaque à 24 puits. Incuber chaque échantillon dans 400 ul de la solution de coloration choisi dans le noir.
  3. Surveiller occasionnellement signaler le développement sous un stéréomicroscope. Arrêter la réaction de coloration quand l'intensité de signal désirée et avant important signal de fond est observée.
  4. Pour arrêter la réaction chromogène, transférer les embryons colorés dans des inserts d'une plaque à 12 puits contenant 2 ml par puits TNT. Rincer les embryons colorés deux fois en TNT.
  5. Laver deux fois les embryons pendant 10 minutes dans du PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à la température ambiante pour éliminer substrat résiduel.

7. Anticorps Removal / inactivation de la phosphatase alcaline

  1. Retirer anticorps et inactiver la phosphatase alcaline par incubation dans 2 ml de solution d'arrêt à faible pH (0,1 M de glycine-HCl pH 2,2, 0,1% de Tween-20) pendant 10 min à température ambiante.
  2. Rincer pendant 1 minute avec 2 ml de PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à température ambiante.
  3. Laver 3 fois pendant 3 minutes dans du PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à température ambiante.

8. Deuxième ronde de détection

  1. Pour détecter le motif de la distribution d'une seconde transcription procéder à la détection des anticorps de sondes d'haptène marqué (STEP 5.1 à 5.4) à l'aide des conjugués anticorps-AP ciblées contre le deuxième haptène-marqueur.
  2. Effectuer la phosphatase alcaline coloration chromogénique (STEP 6.1 à 6.5) appliquant une combinaison de substrat qui produit une couleur contrastant avec celle utilisée dans le premier tour de détection (pour les couleurs disponibles, voir le tableau 1).
  3. Retirer deuxième conjugué anticorps-AP comme décrit dans l'étape 7.1 à 7.3.

9. Troisième Cycle Détection

  1. Afin de détecter le modèle de distribution d'un troisième transcription, procéder à la détection des anticorps de sondes d'haptène marqué (STEP 5,1 à 5,4) en utilisant un anticorps spécifique conjugue-AP pour la troisième haptène-marqueur.
  2. Effectuer la phosphatase alcaline coloration chromogénique (STEP 6.1 à 6.5) appliquant une combinaison de substrat qui n'a pas été apretors dans les tours de détection précédents. Choisissez une réaction chromogène qui produit une couleur précipiter facile à distinguer de ceux des deux tours précédents de détection (choix de couleur, voir le tableau 1).

10. Montage et Imagerie

  1. Transfert d'embryons colorés correctement à 30% de glycerol dans du STP et on incube jusqu'à ce que les embryons sont entièrement trempées dans la solution de glycérol. Ils sont bien équilibrés quand ils se déposent au fond.
  2. Embryons de transfert à 70% de glycérol en H 2 O et laisser équilibrer à RT. Les embryons colorés peuvent être stockés dans 70% de glycérol à 4 ° C.
  3. Pour le montage, une pipette tachée embryons dans une gouttelette de glycérol de 70% sur un porte-objet et sans toucher les entretoises collés à la diapositive (Figure 3). Appliquer la lamelle.
  4. Voir embryons monté sous un microscope à dissection. Déplacez la lamelle appliquée, de sorte que les embryons tournent à l'orientation souhaitée.
  5. Observez bienembryons orientés à haute résolution (20X, 40X objectifs) sous un microscope composé avec différentiel optique interférences de contraste.
  6. Capturez des images avec une caméra numérique couleur et d'économiser sur le périphérique de stockage numérique.

Representative Results

Le protocole décrit permet la visualisation simultanée de plusieurs schémas de transcription de différentes couleurs. MC-WISH offre l'avantage de comparer directement les profils d'expression de gènes différents dans la même embryon. A titre d'exemple, les profils d'expression des stigmates vides (Ems) 19, fushi tarazu (FTZ) 20 et bâclée jumelé 1 (SLP1) 21 sont comparés directement chez la drosophile embryons au stade melanogaster blastodermiques et visualisées dans une variété de nuances de couleurs (figure 4) .

Différentes combinaisons de substrat AP sont disponibles pour obtenir un panel de contraste précipités de couleur (tableau 1). Le précipité de couleur rouge produite par le précipité pourpre produite par BCIP / NBT Fast Red et peut être facilement distingués et sont donc utilisés plus couranteLy dans des expériences de deux couleurs (figure 4A). Cependant, la tache BCIP / NBT peut rapidement se transformer en une couleur plutôt sombre, de sorte que la couleur rouge rapide est déguisé en cas de co-distribution partielle des transcriptions. Par conséquent, l'application de Bleu rapide peut être avantageux, ce qui génère des produits verts, bleus et violets en combinaison avec NAMP, et NABP NAGP, respectivement (tableau 1). La combinaison de Blue rapide avec NAMP donne une couleur bleu clair qui est facilement discernable à partir du produit Fast Red dans des domaines d'expression adjacentes ou qui se chevauchent comme indiqué ici pour EMS et sites d'expression SLP1 visualisées en rouge et bleu, respectivement (figure 4B). La combinaison Fast Blue NAGP offre un fort contraste similaire à la tache rouge rapide, de sorte que le domaine vert ems est clairement distinctif à partir du site d'expression de SLP1 rouge (figure 4C). Cependant, si le SME et sites d'expression sont SLP1 DEprotégé par Fast Blue Fast Red NABP et, respectivement, la violette et précipités résultant de couleur rouge sont moins perceptibles (Figure 4D). Comme mentionné ci-dessus, Fast-Rouge et du Fast Blue NAGP sont faciles à distinguer, comme indiqué par SLP1 et d'expression ftz en rouge et vert, respectivement (figure 4D).

MagentaPhos en combinaison avec INT produit un précipité jaune, qui est utilisé pour révéler l'expression de ftz segmentaire (Figure 4C, E). Le précipité de couleur jaune génère un bon contraste pour les substrats de couleur bleue comme en témoigne la détection de SLP1 et ftz avec Fast Blue NAMP et MAG / INT, respectivement (figure 4E). Cependant, le précipité jaune est moins facile de discerner le produit Red rapide. Le domaine de l'EMS d'expression teinté jaune peut être guère Disti nguished de l'expression rostrale SLP1 indiqué en rouge (Figure 4F). Par conséquent, la combinaison de substrats de couleurs doit être choisie avec soin pour chaque expérience.

Figure 1
Figure 1. Organigramme du MC-WISH. Pour la visualisation multicolore de trois modèles de transcription uniques, choisir entre différents conjugués anticorps-AP et les combinaisons de substrat de couleur dans chaque cycle de détection. Abréviations: AP, la phosphatase alcaline; BIO, la biotine; DIG, digoxigénine; FLUO, la fluorescéine. Pour voir d'autres abréviations légendes à la figure 4 et le tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Inserts en tant que supports d'embryons. (A) Inserts équipés au fond avec des membranes de polyester de 15 mm de diamètre et 74 um maillage sont utilisés comme transporteurs embryon de drosophile. (B) Les inserts sont montés dans des plaques à 12 puits, qui fonctionnent comme des plateaux de réservoir pour les différentes solutions. (C) les transporteurs et les poignées disponibles permettent le traitement de (D) 12 insertions / échantillons d'embryons simultanément. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Montage d'embryons colorés. Les embryons sont montés dans une goutte de 70% de glycerol entre deux piles de lamelles, qui fonctionnent comme des éléments d'espacement. Déplacement en douceur de l'applicationmenti grande lamelle permet de faire tourner les embryons montés dans l'orientation souhaitée pour l'observation et la photographie. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Multicolor visualisation des transcrits d'ARNm dans embryons de drosophile. Exemples d'expériences MC-WISH dans embryons de drosophile sont présentées à partir des vues latérales. Les profils d'expression de l'ARNm de stigmates vides (EMS), fushi tarazu (ZLE) et bâclée apparié 1 (SLP1) sont visualisés par différentes combinaisons de couleurs AP substrat, qui sont indiqués sur chaque panneau. Transcriptions ont été détectés par (A) FLUO ftz et ems DIG, ( SLP1 FLUO, ems BIO, et DIG ftz, (C) ems BIO, SLP1 FLUO et DIG ftz, (D) de BIO ftz, SLP1 FLUO, et ems DIG, (E) SLP1 FLUO, ems DIG, et ftz BIO, (F) BIO ftz, SLP1 FLUO, et ems DIG sondes marquées. Les sondes d'haptène marqué ont été détectés par immunohistochimie une après l'autre dans l'ordre dans la liste. Abréviations: FB Fast Blue; FR, Fast tablette-Rouge. Pour voir d'autres abréviations légendes à la figure 1 et tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Combinaison du substrat Ajouter à 1 ml de tampon AP Concentration [pg / ml] Tampon AP Couleur Sensibilité du signal
BCIP NBT 3,5 pi 4,5 pi 175 337,5 SB9.5 mauve +++
MAG INT 5 ul 5 ul 250 250 SB9.5 jaune +
BCIP / INT solution stock 7,5 pl 250 250 SB9.5 jaune +
Fast Blue NAMP 5 ul 5 ul 250 250 SB8.2 bleu ++
Fast Blue NABP 20 ul 10 ul 1000 500 SB8.2 violet ++
Fast Blue NAGP 10 ul 10 ul 500 500 TT8.2 vert +
Fast Red NAMP Une tablette 1000 400 TT8.2 rouge ++

Tableau 1. combinaisons de substrat abréviations: de +++, forte;. ++, Moyen; +, Faible NBT, chlorure de 4-nitro-bleu-tétrazolium; BCIP, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate; INT, le 2- (4-iodo-phényl) -3- (4-nitrophényl) -5-phényl-tétrazolium chlorure; MAG, Magenta-Phos, le 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-phosphate, NAMP, de naphtol-AS-MX phosphate; NABP, Naphthol-AS-BI-phosphate; NAGP, Naphthol-AS-GR-phosphate; SB9.5, tampon de coloration à pH 9,5; SB8.2, tampon de coloration à pH 8,2; TT8.2, tampon Tris-Tween à pH 8,2.

Discussion

L'hybridation in situ (ISH) avec des sondes d'acides nucléiques marquées de manière radioactive est souvent utilisé pour détecter la localisation d'ARN sur des coupes de tissus. La méthode de ISH radioactifs, cependant, est consommatrice de temps, moins sensible, et ne permet pas l'appréciation des motifs complets de distribution de transcription en entier montures. En revanche, la méthode MC-WISH décrit ici permet la comparaison directe de plusieurs domaines d'expression de gènes dans des couleurs contrastantes dans les embryons intacts. MC-CŒUR présente l'avantage de contexte est immédiatement évident histologique et visualisée simplement par microscopie sur fond clair standard. Cela donne la possibilité de relier les domaines d'expression génique topographiquement à l'autre avec une grande précision et définir les sites d'expression uniques et se chevauchent d'une manière rapide et fiable. D'autre part, ISH fluorescente multiplexé (FISH) est plus puissant par rapport à la sensibilité et la résolution et est utilisé de préférence, si cellulaire ou même re sub-cellulairesolution de détection de l'ARNm est nécessaire.

Le large éventail de produits de transcription qui a été cartographiée par MC-WISH suggère que pratiquement toute transcription peut être analysé non seulement dans l'embryon, mais aussi dans les tissus larvaires et adultes et d'autres espèces que la drosophile. En effet, la procédure décrite en détail ici pour la drosophile, fonctionne de façon similaire efficace avec des embryons de poisson zèbre de 11,16,22. En outre, la méthode MC-WISH peut être adapté à une grande variété d'invertébrés et de vertébrés embryons et spécimen de tissu.

Haptène étiquettes et les concentrations de sonde

On utilise couramment la fluorescéine, la digoxigénine et la biotine comme haptène étiquettes de sondes d'ARN. En outre, des sondes de dinitrophénol marqué peuvent être appliquées, qui ont été introduites dans les expériences 23-25 ​​WISH poisson zèbre. Les sondes marquées à la fluorescéine présentent une sensibilité moindre par rapport aux autres haptène-étiquettes, de sorte que la fluorescéine est mieux utilisé fou la détection des transcrits abondants. Chaque sonde nouvellement transcrit est d'abord testée dans une expérience de seul souhait, où sa performance est évaluée soit en utilisant BCIP / NBT ou Fast Red comme substrat. Une concentration de la sonde est considérée comme optimale lorsque un signal fort sans développement de fond est atteint en quelques minutes à une heure.

Pour vous assurer que les domaines d'expression d'intérêt ont été détectés dans toute leur étendue par MC-WISH, il est essentiel pour visualiser chaque profil de transcription par une seule étiquette expériences WISH utilisant la combinaison du substrat le plus sensible, BCIP / NBT. Cela garantit que la faiblesse des domaines d'expression ne soient pas négligés dans l'expérience multi-cible. Pour compenser la moindre sensibilité des autres combinaisons de substrat, il est essentiel d'utiliser doublé (à triplé) des concentrations de sonde par rapport à BCIP / NBT coloration standard.

PH faible inactivation

L'étape d'inactivation de pH faible peut conduire àdésintégration partielle des ARN antisens sonde hybrides / ARNm sens haptène marqué résultant de la détection du signal réduit dans les deuxième et troisième cycles de coloration. Pour minimiser la perte de la sensibilité, les étapes d'inactivation sont aussi courts que possible. Nous avons vécu que le temps d'incubation de 10 min à pH faible est suffisante pour l'élimination de l'AP-activité. Les lavages rapides ultérieures dans de grands volumes d'assurer une dilution rapide des non liées conjugués anticorps-AP et empêcher la ré-lier aux sondes hapténisée. D'autres procédures sont la fixation de paraformaldéhyde et l'inactivation de chaleur. Cependant, certains des précipités de couleur ne sont pas stables à la chaleur et le paraformaldéhyde fixation peut ne pas être suffisant pour l'inactivation complète des AP. Inactivation incomplète de la première appliquée conjugué anticorps-AP peut conduire à re-visualisation de la structure de l'ARNm dans la détection suivante leader ronde pour chevauchement faux positif dans l'expression avec la deuxième espèce d'ARNm à détecter. Par conséquent, dans une expérience témoin èmee embryons sont divisées en deux fractions, après l'inactivation de la première appliquée conjugué anticorps-AP. Le deuxième conjugué anticorps-AP est omis de la fraction de contrôle et ne doit pas produire un signal dans la seconde réaction colorée. Cependant, si la réaction de deuxième couleur génère un motif de distribution de signaux correspondant à la première, puis la procédure d'inactivation n'a pas été efficace. Dans ce cas, le temps d'incubation dans une solution d'arrêt à faible pH doit être prolongée pour l'expérience suivante.

Les commandes d'application de substrat AP

Etant donné que la sensibilité diminue avec chaque cycle de détection ultérieur, il est préférable de détecter les ARNm moins abondantes avant transcrits plus abondantes. En outre, le Fast Blue combinaisons de substrat Fast Red et sont nettement moins sensible que l'purpleblue BCIP / NBT tache, de sorte que les colorants rapides sont appliquées de préférence dans le premier tour de coloration pour la détection de la transcription exprimé plus fort. Cela a également hcomme l'avantage ultérieur BCIP / NBT coloration peut être surveillé dans le temps et est arrêté avant que le signal d'obscurité devient trop purpleblue en ce qui concerne les colorants rapides légers. Ainsi, dans une expérience de deux-couleur standard, d'abord l'ARNm exprimé plus forte est détectée par Fast-Rouge et du deuxième le plus faible par BCIP / NBT. Comme une alternative aux colorants rapides les jaunes combinaisons de substrat INT peuvent être appliquées, qui produisent cependant précipités qui deviennent floues après un certain temps. Par conséquent BCIP / INT est exclusivement appliquée dans le dernier tour de coloration. Par conséquent, dans une expérience de trois couleurs, nous utilisons souvent le premier Fast Red, deuxième BCIP / NBT (ou Fast Blue) et le troisième une combinaison de substrat INT. Notez qu'il est conseillé de photographier embryons colorés dès que possible lors de l'application INT.

Détection fluorescente de colorants azoïques

Il peut être parfois difficile de reconnaître des modèles d'expression qui se chevauchent quand un précipité de couleur plus foncée est un ombrage un briquet. Fou par exemple, un précipité BCIP / NBT fortement développé peut masquer les signaux de colorants rapides légers. Une façon de contourner ce problème consiste à capturer des images immédiatement après chaque coloration et éliminer le précipité de couleur appliquée avant la prochaine ronde de détection. Dans ce cas, colorant azoïque soluble dans l'alcool (Fast Red) et INT précipités sont éliminés par lavages d'éthanol après les premier et deuxième tours de détection, respectivement, et BCIP / NBT coloration est appliqué comme le dernier substrat AP-26. Une autre possibilité est de profiter des propriétés de fluorescence de colorants azoïques. Fast Red peut être visualisée à l'aide filtre rhodamine fixe 27, tandis que le Blue rapide peut être observée avec des filtres rouge lointain 28,29. Comparaison ou superposition d'images chromogènes et fluorescentes peuvent révéler le site de co-distribution.Using cette approche, le développement de signal BCIP / NBT doit être arrêté dans le temps, de sorte qu'il ne devienne pas trop dense et étancher le signal fluorescent du colorant azoïque produit de réaction.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water Thermo Scientific R0603
T7 RNA Polymerase  Thermo Scientific EP0111
T3 RNA Polymerase  Thermo Scientific EP0101
SP6 RNA Polymerase  Thermo Scientific EP0131
RiboLock RNase Inhibitor  Thermo Scientific EO0381
DNase I, RNase-free  Thermo Scientific EN0521
NTP Set Thermo Scientific R0481
Digoxigenin-11-UTP Roche 11209256910
Fluorescein-12-UTP Roche 11427857910
Biotin-16-UTP Roche 11388908910
Ammonium acetate Applichem A2936
Ethanol, absolute  Merck 100983
di-Sodium hydrogen phosphate Scharlau SO0339
Sodium dihydrogen phosphate Scharlau SO0331
Tween-20 Sigma P1379
Paraformaldehyde Sigma P6148
Methanol Sigma 32213
Proteinase K Thermo Scientific EO0491
Glycine Sigma G7126
Hydrochloric acid  Merck 100317
tri-Sodium citrate Scharlau SO0200
deionized formamide Applichem A2156
RNA type VI from torula yeast Sigma R6625
Heparin sodium salt Applichem A3004
Dextran sulfate sodium salt Sigma D6001
Sheep serum Sigma S2263
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments  Roche 11426303001
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments Roche 11093274910
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments Roche 11426303001
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody Vector laboratories MB-3100
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane Scharlau TR04241000
Magnesium chloride Scharlau MA0036
Sodium chloride Scharlau SO0227
Levamisole Sigma L9756
N,N-Dimethylformamide Sigma D4551
Dimethylsulfoxide Applichem A3006
Fast Red tablet set Sigma F4648
Fast Blue BB salt Sigma F3378
Naphthol-AS-MX-phosphate Sigma N5000
Naphthol-AS-GR-phosphate Sigma N3625
Naphthol-AS-BI-phosphate Sigma N2250
Magenta-Phos Biosynth B7550
INT Sigma I8377
NBT Applichem A1243
BCIP Applichem A1117
INT/BCIP solution Roche 11681460001
Glycerol 86-88% Scharlau GL0023
Universal incubator Memmert BE400
Waterbath Memmert WB14
Heat block Grant QBT2
Netwell  inserts 15 mm Corning 3477
Netwell carrier kit 15 mm Corning 3520
12-well cell culture plate Corning 3513
24-well plate Sarstedt 83.3922
1.5 ml microtube Sarstedt 72.690.001
2.0 ml microtube Sarstedt 72.691

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References

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