Summary
Vi beskriver ett kromogent hela montera förfarande multi-målet in situ hybridisering (MC-WISH) i intakta Drosophila embryon som möjliggör simultan och specifikt påvisande av tre olika mRNA fördelningsmönster genom att kontrastera färg fällningar.
Abstract
För att analysera genreglerande nätverk aktiva under fosterutvecklingen och organogenesen är det viktigt att exakt definiera hur olika gener uttrycks i den fysiska förhållande till varandra in situ. Multi-mål kromogena hela montera in situ hybridisering (MC-WISH) avsevärt underlättar omedelbar jämförelse av genexpressionsmönster, eftersom den tillåter särskiljande visualisering av olika mRNA i kontrasterande färger i samma prov prov. Detta ger möjlighet att relatera genuttryck domäner topografiskt varandra med hög noggrannhet och att definiera unika och överlappande uttrycks webbplatser. I den presenterade protokollet beskriver vi en MC-WISH-förfarande för att jämföra mRNA-uttrycksmönster av olika gener i Drosophila embryon. Upp till tre RNA-prober, varje specifik för en annan gen och märkt med en annan hapten, är samtidigt hybridiserad till embryoproverna och därefter detekteras med alkaline fosfatas-baserade kolorimetriska immunohistokemi. Det beskrivna förfarandet är detaljerad för Drosophila här, men fungerar lika bra med zebrafisk embryon.
Introduction
In situ hybridisering (ISH) är standardmetoden för detektering och lokalisering av RNA-transkript i en morfologisk sammanhang inom celler, vävnader och organismer 1. De signaler som alstras av ISH förfarandet vanligen visualiseras med radioaktiva, fluorescerande och kromogena detekteringssystem. Under senare år har betydande tekniska framsteg inom fluorescerande ISH (FISK) 2 resulterade i dramatiskt förbättrad känslighet och upplösning, vilket gör detektering och kvantifiering av RNA uttryck vid encelliga och sub-cellulära nivåer och RNA visualisering upp till enstaka molekyler 3,4 .While sofistikerade enda molekyl FISH metoder används för mer specialiserade applikationer, är kromogent ISH utbredd som en rutinmässig RNA in situ detektionsmetoden i forskning och klinisk diagnostik. För kromogent detektering enzym utfällningsreaktioner används, som genererar synliga produkter i kontrasterande färger på platsernaav hybridisering 5. Detta har fördelen att RNA visualisering kan kombineras med rutin histologiska fläckar och morfologisk sammanhanget är omedelbart framgår av standard bright mikroskopi. Dessutom, många av de tillämpade färgsubstrat producerar fällningar, som är stabila i organiska och / eller vatten montering media, så att permanenta preparat prov kan erhållas 5.
I Drosophila, första ISH-protokoll tillämpas radioisotopmärkta prober för utskrift upptäckt på sektionerad material 6. Även om det är svårt att rekonstruera från vävnadssnitt komplett avskrift mönster av hela embryon eller organsystem, gör tillämpningen av kromogena ISH förfaranden med icke-radioaktivt märkta sönder det möjligt att globalt upptäcka RNA fördel i hela-fästen 7. Även om många varianter av kromogena ISH finns, i typisk hela montera in situ hybridisering (WISH) protokoll hybridized hapten-märkta sönder upptäcks av anti-hapten-antikroppar konjugerade till en reporter enzym och mRNA transkript visualiseras genom en fällnings kromogen.
Paletten av olikfärgade fällningar som producerats av reportern enzymerna alkaliskt fosfatas (AP), pepparrotsperoxidas (POD), och beta-galaktosidas (gal) medger särskiljande detektion av flera mål i ett och samma prov 8-14. Men varar POD enzymatisk aktivitet under en begränsad tidsperiod och GAL kolorimetriska reaktionen är något mindre känslig, så att utan ytterligare signal (tyramide) förstärkning 15 detektion av mindre rikligt transkript kan vara en utmaning med dessa enzymer. Däremot bestående aktivitet AP möjliggör långvarig substratomsättning och hög signal-brusförhållande. Därför har sekventiell upptäckt med hjälp av AP reporter enzym med olikfärgade substrat visat sig framgångsrika i effektiv ochutmärkande detektering av upp till tre olika transkript i enstaka embryon 10-12,16.
För denna multi-mål kromogena WISH (MC-WISH) metoden (Figur 1) 14, är märkta antisens-RNA-prober som genereras av in vitro transkription och är markerade med en av de tillgängliga hapten-etiketter. Embryon är formaldehyd fast och permeabiliseras av metanol behandling och proteinas K matsmältningen. Hybridisering av embryon samtidigt utföras med upp till tre olika märkta antisense RNA-prober var specifika för en annan gen. Efter avlägsnande av obunden sond genom stringenta tvättar varje hapten-etikett visualiseras i en separat omgång för upptäckt. En enda upptäckt omgång består av inkubation av embryon med en anti-hapten antikropp kopplad till AP och RNA visualisering genom tillämpning av en AP-substrat som producerar en lokaliserad stabil färg fällning. Efter antikroppsdetektion och färgning, den tillämpade antikropp-AP conjugrinden avlägsnas genom ett lågt pH tvätt. I flerfärgs experiment, varje omgång av detektering utnyttjar en antikropp riktad mot en annan hapten märke och varje transkript mönstret visualiseras genom en annan färg substrat (Tabell 1). Embryon är monterade i glycerol och avbildas under ett högupplösande mikroskop med användning av differentialinterferenskontrast (DIC) optik.
Protocol
1. Märkning av RNA-prober genom transkription in vitro
- Montera in vitro transkriptionsreaktion i en 1,5 ml mikrorör enligt RNase fria betingelser: 10,5 | il DEPC-behandlat H2O, 4,0 | il 5x transkriptionsbuffert, 1,0 | il (1 | ig) lineariserad, renat templat-DNA i DEPC-behandlat H2O, 1,3 pl NTP mix, 0,7 pl hapten-märkt UTP, 0,5 pl RiboLock RNA-inhibitor, 2,0 pl RNA-polymeras.
Obs: Den slutliga reaktionsvolymen är 20 | il. - Beroende på mallen är promotorsekvensen använda T7, T3 eller SP6 RNA-polymeras för transkription in vitro (se referens 17).
- Välj digoxigenin-11-UTP, biotin-16-UTP eller fluorescein-12-UTP som etikett för RNA-sond. För mer information, se diskussion hapten-etiketter och sondkoncentrationer i diskussionen.
- Blanda transkriptionsreaktion och spinn ner inom kort.
- Låt transkriberaför 3 h vid 37 ° C.
- Lägg ett pl RNas-fritt DNas I till transkriptionsreaktionen för att avlägsna schablon-DNA, blanda väl, och inkubera under 15 minuter vid 37 ° C.
- Justera med DEPC-behandlat H2O provvolymen till 200 pl.
- Tillsätt 100 | il (0,5 vol) 7,5 M ammoniumacetat och 600 | il (3 vol) etanol för utfällning märkt RNA-prob. Inkubera under 30 min vid RT.
- Använd inte iskall etanol, eftersom detta kan leda till oönskad utfällning av oregistrerade nukleotider.
- Centrifugera ner den transkriberade RNA i ett temperaturreglerat centrifugera vid maximal hastighet (20.800 x g) under 30 min vid 20 ° C. Försiktigt aspirera supernatanten.
- Tvätta den resulterande pelleten med 70% etanol vid rumstemperatur och centrifugera vid 20.800 xg under 10 minuter vid 20 ° C.
- Avlägsna supernatanten och vara noga med att inte av misstag aspirera lösa pelleten. Låt pelletslufttorka i mikrorör med öppna lock för några minuter vid RT.
- Dislösa den erhållna pelleten i 100 pl DEPC-behandlat H2O
- Tillsätt 300 | il för-hybridiseringsbuffert (50% volym / volym avjoniserad formamid, 5 x SSC, 50 | ig / ml heparin-natriumsalt, 0,1% volym / volym Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA) och förvara vid -20 ° C . Sönder kan vara långsiktig lagrades vid -20 ° C.
Notera: För ett första test av den nyligen transkriberade sonden utspädd 3 il hapten-märkt RNA-sond i 100 ul hybridiseringsbuffert för att erhålla den slutliga koncentrationen för WISH experimentet.
2. Behandling av Embryo Prover Använda Skär
Obs! Om du använder mikrorör eller flerbrunnsplattor för bearbetning embryon genom de olika inkuberingssteg bär risken att förlora betydande mängder av embryon genom misstag aspire dem under utbyte av lösningar. För att undvika denna förlust, kan det vara till hjälp att använda korgar (såsom Netwell infogningar) för utförande embryo prover genom förfarandet. Dessa är polystyren iskär med en polyestermask nedtill (figur 2A), på vilken embryona vila under bearbetning.
- För bearbetning embryon i WISH förfarandet, montera insatserna i en 12-brunnsplatta (figur 2B) och tillsätt 2 ml av den lämpliga lösningen till varje brunn.
- Pipett embryon i insatserna med hjälp av en blå spets. Se till att alla embryon är nedsänkta i vätska.
- När inkubationstiden är slut plats embryot innehållande insert i en annan 12-brunnars platta, som är fylld med lösningen för nästa steg.
- Använd bärare och handtag (figur 2C) att överlåta upp till 12 prover åt gången från en lösning till en annan (figur 2D).
Obs! För att minska de nödvändiga volymer, använd 2,0 ml mikrorör för pre-hybridisering / hybridiseringsstegen (se steg 4.1) och 24-brunnsplattor för färgning reaktioner (STEG 6,2). De hybridisering och färgning reaktioner utförs i volymer om 1001; l och 400 pl, respektive.
- Använd bärare och handtag (figur 2C) att överlåta upp till 12 prover åt gången från en lösning till en annan (figur 2D).
3. Beredning av embryon för hybridisering
- Samla, dechorionate, fixa, och devitellinize embryon med hjälp av standardprocedurer 14,18. De framställda embryona rutinmässigt lagras i metanol vid -20 ° C.
- Överför embryon som skall användas för hybridisering in situ till RT och fördela i skären i en 12-brunnar fylls med 2 ml metanol per brunn.
- Rehydrera embryon genom en minskande metanol serie vid RT. Inkubera embryon varje gång under tre min i: (i) 75% metanol i 1 x PBS (ii) 50% metanol i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% metanol i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1 x PBS, 0,1% Tween-20.
- Pre-fix embryona i 4% paraformaldehyd i 1x PBS i 20 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna fixativ av 4 tvättar för 3 min i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 vid RT. Under tiden tina och förbereda proteinas K och glycin arbetslösningar.
- Stoppa reaktionen genom två 1 min sköljningar i 2 mg / ml glycin i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 vid RT.
- Post-fix embryona i 4% paraformaldehyd i 1x PBS i 20 min vid rumstemperatur.
- Därefter avlägsna paraformaldehyd fixativ genom tvättning fyra gånger under 3 min i 1 x PBS, 0,1% Tween-20 vid RT.
- Överför efterfixerades embryon till pre-hybridiseringsbuffert. Förvara embryon i pre-hybridiseringsbuffert vid -20 ° C eller direkt gå vidare med hybridisering av prober.
4. Hybridisering av prober
- Överför embryon förvaras vid -20 ° C i pre-hybridiseringsbuffert till RT. Fördela embryon i pre-hybridiseringsbuffert i 2,0 ml mikroröres.
- Under 30 minuter vid ett minimum, pre-hybridisera embryo prover vid 65 ° C i pre-hybridiseringsbuffert.
Obs: För pre-hybridisering och hybridisering steg ett vattenbad används. Under för-hybridisering finns det tid att förbereda sondblandningen genom att kombinera upp till tre antisens-RNA-prober, som var och är specifik för en annan gen-transkript och märkt med ett annat hapten. - För att erhålla den sondblandningen, tillsätt tillsammans lämpliga mängder (vanligen mellan 1 | j, l till 6 | j, l) av varje önskad ursprunglig hapten-märkt antisens-RNA-sond i 100 ul hybridiseringsbuffert (50% volym / volym avjoniserad formamid, 5 x SSC, 50 | j, g / ml heparin-natriumsalt, 0,1% volym / volym Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA, 5% vikt / vol dextransulfat).
Anmärkning: tillsats av dextransulfat är valfri. - Denaturera antisens-RNA sondblandningen i ett värmeblock vid 80 ° C under 5 minuter. Därefter överföra denaturerade sondblandningen direkt till 65 ° C.
- Avlägsna det mesta av pre-hybridiseringbuffert från embryo proverna och lägg det denaturerade sondblandningen.
- Låt embryo prover hybridiserar till sondblandning O / N vid 65 ° C.
Not: temperaturer som sträcker sig mellan 55 ° C och 65 ° C används rutinmässigt för hybridiseringsbetingelser, pre- och post-hybridiseringsstegen. Hybridisering vid 65 ° C ger mest stränga villkor och rekommenderas vid bakgrundsproblem när du använder lägre temperaturer. Om det inte finns några bakgrundsproblem, hybridisering vid 55 ° C rekommenderas, vilket ger fördelen med förbättrad signalstyrka och förbättrad embryo integritet. - Nästa morgon, först överföra stringens tvättlösningar till 65 ° C, för att se till att de värms upp till rätt temperatur i tid.
- Överföring hybridiseringsprob blandning med embryon från de 2,0 ml mikrorör till skär av en 12-brunnars platta innehållande 2 ml förvärmd hybridisering tvättbuffert (50% formamid i 2 x SSC, 0,1% Tween-20). Placera 12-brunnar innehållande embryo prover i en ugn och inkubera i 20 minuter vid 65 ° C.
- Överför embryo prover till 2 ml ny hybridisering tvättbuffert och inkubera i 20 minuter vid 65 ° C. Upprepa det här steget en gång.
- Avlägsna överskott sond med 20 minuterstvättar vid 65 ° C, en gång i 2 x SSC, 0,1% Tween-20 och tre gånger i 0,2 x SSC, 0,1% Tween-20.
- Överföra embryot proverna till 1x PBS, 0,1% Tween-20 vid RT.
- Inkubera embryon i blockeringsbuffert (8% fårserum i 1 x PBS, 0,1% Tween-20) under åtminstone 30 min vid RT.
5. Antikropp Upptäckt av hapten-märkta prober
Obs: I motsats till den samtidiga hybridisering av alla tre olika märkta prober, är varje prob detekteras en efter en i separata omgångar av antikropp inkubation och färgning. Därför, i varje upptäckt omgång endast en antikropp används (antingen anti-digoxigenin-AP eller anti-fluorescein-AP eller anti-biotin-AP).
- Välj mellan STEP5.1.1 till 5.1.3 och fortsätter med framställning av den lämpliga antikroppen utspädning enligt hapten-etikett som skall detekteras.
Obs: För sekventiell detektering av olika märkta sönder, en annan anti-hapten-antikroppar som tillsätts i varje detekteringscykel.- För detektion av en fluorescein-märkt prob utspädd anti fluorescein-AP-konjugaten 1: 4000 i blockeringsbuffert.
- För detektion av en digoxigenin-märkt prob utspädd anti digoxigenin-AP-konjugaten 1: 4000 i blockeringsbuffert.
- För detektion av en biotinmärkt sond framställa en anti-biotin-AP-konjugatet lösningen vid en 1: 4000 spädning i blockeringsbuffert.
- Inkubera embryon i den valda anti-hapten-AP lösning för tre till fyra timmar vid rumstemperatur. Alternativt, inkubera O / N vid 4 ° C. Applicera inte alla tre antikroppar samtidigt.
- För att avlägsna obunden antikropp tvättas embryona med 1 x PBS, 0,1% Tween-20 för 4 gånger 15 min vid RT.
- Om du vill ändra buffertsystem varh två gånger 15 min vid RT i TNT (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20).
6. Alkaline Phosphatase Chromogenic Färgning
- Efter antikroppsdetektion välja mellan STEG 6.1.1 till 6.1.4 och gå vidare med en av de alkaliska fosfatas kromogena färgreaktioner för att erhålla den önskade färgsignalen (se tabell 1). För varje omgång av upptäckt ett annat kromogent substratreaktion används för att markera varje utskrift mönster i en annan färg.
- Fast Red Färgning
- Tvätta embryona två gånger under 15 min i TT8.2 (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2, 0,1% Tween-20).
- Medan tvätta embryon, förbereda Fast Red färglösningen från Fast Red TR / NAMP Alkaline fosfatassubstrat Tabletter Set.
- Lös en buffert tablett från tabletten inställd i 1 ml destillerat vatten och blanda genom att vortexa att erhålla 0,1 M Tris-HCl, pH 8,2.
- Släpp en Fast Red TR / NAMP tablett i den förberedda Tris buffert och lös upp genom virvelbildning för att få Fast Red färglösningen.
- Klar Fast Red färglösningen från icke-upplösta partiklar genom ett 0,2 pm sprutfilter.
- Fast Blue Färgning
- Tvätta embryon två gånger under 15 min i färsk SB8.2 färgningsbuffert (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- Medan tvätta embryona, förbereda Fast Blue färgningslösningen från 50 mg / ml Fast Blue BB (i DMF) och 50 mg / ml naftol fosfat (i DMSO) stamlösningar.
- Färskt förbereda en Fast Blue BB-lösning vid 0,5 mg / ml i SB8.2.
- Färskt förbereda en separat naftol fosfatlösning på 0,5 mg / ml i SB8.2.
- Droppvis lägga beredda naftol fosfatlösning i Fast Blue BB lösning under konstant blandning med en virvel. Den resulterande slutliga arbetskoncentrationen är 0,25 mg / ml för båda substratkomponenter.
Obs: Olika Fast Blue / naftol phosphat kombinationer resulterar i olika färgnyanser (se tabell 1).
- BCIP / NBT färgning
- Tvätta embryon två gånger under 15 min i färsk SB9.5 färgningsbuffert (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- För en purpleblue kromogent signal, nyligen förbereda BCIP / NBT-färgningslösning genom att tillsätta 1 | il levamisol, 3,5 | il BCIP och 4,5 | il NBT per ml SB9.5 färgningsbuffert och blanda väl.
- INT Färgning
- Tvätta embryona två gånger under 15 min i färsk SB9.5 färgningsbuffert.
- För en gulbrun kromogent signal, nyligen förbereda INT färgningslösning genom att tillsätta 1 | il levamisol, 5 pl magenta-Phos och 5 pl INT per ml SB9.5 färgningsbuffert och blanda väl.
Obs: Du kan använda 7,5 pl / ml BCIP / INT redo att använda färglösningen.
- Fast Red Färgning
- För färgningsreaktion överförings embryo provertill en 24-brunnsplatta. Inkubera varje prov i 400 | il av den valda färglösningen i mörker.
- Övervaka ibland signalera utveckling under ett stereomikroskop. Stoppa färgreaktion när den önskade signalstyrkan erhålls och innan signifikant bakgrundssignal observeras.
- För att stoppa den kromogena reaktionen överföra färgade embryon till skär av en 12-brunnar innehållande 2 ml TNT per brunn. Skölj färgade embryon två gånger i TNT.
- Tvätta embryona två gånger under 10 min i en × PBS, till 0,1% Tween-20 vid RT avlägsna kvarvarande substrat.
7. Antikropp Removal / alkaliskt fosfatas inaktive
- Avlägsna antikropp och inaktivera alkaliskt fosfatas genom inkubering i 2 ml lågt pH stopplösning (0,1 M glycin-HCl, pH 2,2, 0,1% Tween-20) under 10 min vid RT.
- Skölj under 1 min med 2 ml av en x PBS, 0,1% Tween-20 vid RT.
- Tvätta 3 gånger under 3 min i en × PBS, 0,1% Tween-20 vid RT.
8. Andra Detection Round
- För att detektera fördelningsmönstret av en andra transkript fortsätta med antikropp upptäckt av hapten-märkta prober (STEG 5,1-5,4) med hjälp av antikropp-AP-konjugat riktade mot den andra hapten-etikett.
- Utför alkaliskt fosfatas kromogena färgning (STEG 6,1-6,5) applicering av en substratkombination som ger en kontrasterande färg till den som används i den första detekterings omgången (för tillgängliga färger se tabell 1).
- Avlägsna andra antikropp-AP-konjugatet enligt beskrivningen i STEG 7,1 till 7,3.
9. Tredje Detection Round
- För att detektera fördelningsmönstret av tredjedel transkript, vidare med antikroppsdetektion av hapten-märkta prober (STEG 5,1 till 5,4) under användning av antikropp-AP-konjugaten specifik för 3:e hapten-markör.
- Utför alkaliskt fosfatas kromogena färgning (STEG 6,1-6,5) applicering av en substrat kombination som inte var apkryssat i de tidigare omgångarna upptäckt. Välj en kromogen reaktion som producerar en färg fälla lätt att skilja sig från de tidigare två detektionsrundor (för färgval se tabell 1).
10. Montering och Imaging
- Överför ordentligt färgade embryon till 30% glycerol i PBS och inkubera tills embryon är helt indränkt i glycerollösning. De är väl ekvilibrerad när de sjunker till botten.
- Överför embryon till 70% glycerol i H2O och låt jämvikt vid RT. De färgade embryon kan lagras i 70% glycerol vid 4 ° C.
- För montering, pipett färgas embryon i 70% glycerol droppe på ett objektglas och utan att röra distanserna limmade till sliden (Figur 3). Applicera locket halka.
- Visa monterad embryon under ett dissektionsmikroskop. Flytta den applicerade täckglas, så att embryona rotera för att den önskade orienteringen.
- Observera korrektorienterade embryon med hög upplösning (20X, 40X mål) under ett mikroskop med differential interferens kontrast optik.
- Ta bilder med en digital färgkamera och spara på digital lagringsenhet.
Representative Results
Den beskrivna protokollet möjliggör samtidig visualisering av flera transkript mönster i olika färger. MC-WISH ger fördelen att direkt jämföra uttrycksmönstret för olika gener i samma embryo. Som ett exempel, uttrycksmönster tomma spiracles (EMS) 19, fushi tarazu (FTZ) 20 och slarviga parade 1 (slp1) 21 direkt jämförs i Drosophila melanogaster BLASTODERM skede embryon och visualiseras i en mängd olika färgnyanser (Figur 4) .
Olika AP substratkombinationer är tillgängliga för att erhålla en panel av kontrasterande färg fällningar (tabell 1). Den röda färgen fällningen produceras av Fast Red och lila fällningen produceras av BCIP / NBT kan vara lätt skiljas och används därför vanligastely i två-färgexperiment (Figur 4A). Däremot kan BCIP / NBT fläck snabbt förvandlas till en ganska mörk färg, så att Fast Röd färg är förklädd vid partiell samdistribution av transkript. Därför kan tillämpningen av Fast Blue vara en fördel, som alstrar blått, grönt och violett produkter i kombination med NAMP, NAGP och nabp, respektive (tabell 1). Kombinationen av Fast Blue med NAMP ger en ljusblå färg som är lätt att urskilja från Fast Red produkten i angränsande eller överlappande uttrycksdomäner som visas här för ems och slp1 uttryck platser visualiseras i rött och blått, respektive (Figur 4B). Den Fast Blue NAGP kombination ger en liknande stark kontrast till den Fast Red fläcken, så att den gröna ems-domänen är klart distinkt från den röda slp1 expressionsstället (Figur 4C). Men om ems och slp1 uttrycks platser är frånskyddas av Fast Blue nabp och Fast Red, respektive, den resulterande violett och röd färg fällningar är mindre märkbar (Figur 4D). Såsom nämnts ovan, Fast Red och Fast Blue NAGP är lätta att skilja såsom visas av slp1 och FTZ expression i rött och grönt, respektive (Figur 4D).
MagentaPhos i kombination med INT ger en gul fällning, som används för att avslöja den segmentell expression av FTZ (Figur 4C, E). Den gulfärgade fällningen genererar bra kontrast till de blåfärgade substraten som exemplifieras genom detektering av slp1 och FTZ med Fast Blue NAMP och MAG / INT, respektive (Figur 4E). Men den gula fällningen svårare urskiljas från Fast Red produkten. Den gula färgade uttryck domän ems kan knappast Disti nguished från rostralt uttryck för slp1 visas i rött (Figur 4F). Därför måste en kombination av färgsubstrat för att väljas med omsorg för varje experiment.
Figur 1. Flödesschema av MC-WISH. För flerfärgad visualisering av tre unika transkript mönster, välja mellan olika antikropp-AP-konjugat och färgsubstratkombinationer i varje detekteringscykel. Förkortningar: AP, alkaliskt fosfatas; BIO, biotin; DIG, digoxigenin; FLUO fluorescein. För andra förkortningar se legender till figur 4 och tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
s / ftp_upload / 53.830 / 53830fig2.jpg "/>
Figur 2. Skär som embryobärare. (A) Skär monterade i botten med polyestermembran av 15 mm diameter och 74 pm maskstorlek används som Drosophila embryo bärare. (B) Insatserna är monterade i 12-brunnsplattor, som fungerar som reservoarfacken för olika lösningar. (C) Tillgängliga bärare och handtag tillåter behandling av (D) 12 skär / embryo prover samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Montering av färgade embryon. Embryon är monterade i en droppe av 70% glycerol mellan två staplar av täckglas, som fungerar som distansorgan. Gentle förflyttning av appenljugit stor täck hjälper till att rotera monterade embryon till önskad orientering för observation och fotografering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Multi visualisering av mRNA-transkript i Drosophila embryon. Exempel på MC-WISH experiment i Drosophila embryon visas från sidovyer. MRNA uttryck mönster av tomma spiracles (EMS), fushi tarazu (FTZ) och slarviga parade 1 (slp1) visualiseras genom olika AP färgsubstratkombinationer, som anges på varje panel. Transkript detekterades med (A) FTZ FLUO och EMS DIG, (
| Substratkombination | Lägg till en ml AP-buffert | Concentration [ig / ml] | AP-buffert | Färg | Signal känslighet |
| BCIP NBT | 3,5 pl 4,5 pl | 175 337,5 | SB9.5 | lila | +++ |
| MAG INT | 5 ^ 5 ^ il | 250 250 | SB9.5 | gul | + |
| BCIP / INT stamlösning | 7,5 ^ il | 250 250 | SB9.5 | gul | + |
| Fast Blue NAMP | 5 ^ 5 ^ il | 250 250 | SB8.2 | blå | ++ |
| Fast Blue nabp | 20 ^ 10 ^ il | 1000 500 | SB8.2 | violett | ++ |
| Fast Blue NAGP | 10 pl 10 pl | 500 500 | TT8.2 | grön | + |
| Fast Red NAMP | 1 tablett | 1000 400 | TT8.2 | röd | ++ |
Tabell 1. substratkombinationer Förkortningar: +++, stark;. ++, Medium; +, Svag NBT, 4-nitro-blått-tetrazoliumklorid; BCIP, 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat; INT, 2- (4-jodfenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5-fenyl-tetrazoliumklorid; MAG, magenta-Phos, 5-brom-6-klor-3-indolyl-fosfat, NAMP, naftol-AS-MX-fosfat; Nabp, Naftol-AS-BI-fosfat; NAGP, Naftol-AS-GR-fosfat; SB9.5, färgningsbuffert vid pH 9,5; SB8.2, färgning buffert vid pH 8,2; TT8.2, Tris-Tween-buffert vid pH 8,2.
Discussion
In situ-hybridisering (ISH) med radioaktivt märkta nukleinsyraprober används ofta för att detektera lokaliseringen av RNA på vävnadssektioner. Den radioaktiva ISH-metoden, men är tidskrävande, mindre känslig, och inte tillåter uppskattning av kompletta transkript fördelningsmönster i hela-fästen. Däremot medger den här beskrivna MC-WISH metoden direkt jämförelse av flera genuttryck domäner i kontrasterande färger inom intakta embryon. MC-WISH har fördelen att histologiska sammanhanget är omedelbart uppenbar och visualiseras genom att helt enkelt standard bright mikroskopi. Detta ger möjlighet att relatera genuttryck domäner topografiskt varandra med hög noggrannhet och definiera unika och överlappande uttrycks platser i ett snabbt och tillförlitligt sätt. Å andra sidan, är multiplexerad fluorescerande ISH (FISH) kraftfullare med avseende på känslighet och upplösning och används företrädesvis, om cellulär eller ens subcellulär rekrävs lösning av mRNA-detektering.
Det breda spektrum av transkript som har kartlagts av MC-WISH tyder på att praktiskt taget alla transkript kan analyseras inte bara i outvecklad men också i larver och vuxna vävnader och i andra än Drosophila arter. Faktum är att beskrivna proceduren beskrivs här för Drosophila, fungerar på samma sätt effektivt med zebrafisk embryon 11,16,22. Dessutom kan MC-WISH-metoden anpassas till en mängd olika ryggradslösa och ryggradsdjur embryon och vävnadsprov.
Hapten-etiketter och probkoncentrationer
Vi använder rutinmässigt fluorescein, digoxigenin och biotin som hapten etiketter av RNA-prober. Dessutom, dinitrofenol-märkta sönder kan tillämpas som har införts i zebrafisk WISH experiment 23-25. Fluoresceinmärkt prober uppvisar mindre känslighet i jämförelse med de andra hapten-etiketter, så att fluorescein är bäst används feller detektering av rikliga transkript. Varje nyligen transkriberade proben först testas i en enda WISH experiment, där dess prestanda utvärderas antingen BCIP / NBT eller Fast Red som substrat. En sond koncentration anses vara optimal när en stark signal utan bakgrunds utveckling uppnås inom min till några timmar.
För att säkerställa att uttrycket domäner intresse har upptäckts i full utsträckning av MC-WISH, är det viktigt att synliggöra varje utskrift mönster genom en enda märkes WISH experiment med den mest känsliga substratkombination, BCIP / NBT. Detta säkerställer att svaga uttrycksdomäner inte förbises i multi-mål experiment. För att kompensera för den mindre känslighet av de andra substratkombinationer är det viktigt att använda fördubblats (till tredubblats) sondkoncentrationer jämfört med standard BCIP / NBT färgning.
Lågt pH inaktive
Det låga pH inaktiveringssteg kan leda tillpartiell sönderdelning av antisens-hapten-märkt RNA-sond / känsla mRNA hybrider som resulterar i minskad signaldetektering i andra och tredje färgnings rundor. För att minimera förlust i känslighet, de inaktiveringssteg är så korta som möjligt. Vi upplevde att en 10 minuters inkubationstid vid lågt pH är tillräcklig för eliminering av AP-aktivitet. De efterföljande snabba tvättar i stora volymer säkerställa en snabb utspädning av obundna antikropp-AP-konjugat och förhindra åter bindning till haptenized sonder. Alternativa förfaranden inkluderar paraformaldehyd fixering och värmeinaktivering. Men några av de färg fällningarna inte är värmestabilt och paraformaldehyd fixering kanske inte räcker för fullständig inaktivering av AP. Ofullständig inaktivering av den första anbringade antikropp-AP-konjugatet kan leda till re-visualisering av mRNA mönstret i följande detekteringen runda leder till falskt positiva överlappning i uttryck med de andra mRNA-typer som skall detekteras. Därför, i ett kontrollförsök the embryon delas upp i två fraktioner efter inaktivering av den första tillämpad antikropp-AP-konjugat. Den andra antikroppen-AP-konjugatet är utelämnad från kontrollfraktionen och bör inte alstra en signal i det andra färgreaktion. Om emellertid den andra färgreaktion alstrar en signal fördelningsmönster som motsvarar den första en, sedan inaktiveringsförfarandet var inte effektiv. I detta fall bör inkubationstiden i svagt stopplösning pH förlängas för nästa experiment.
Beställer av AP-substrat ansökan
Eftersom känsligheten minskar med varje efterföljande omgång av upptäckt, är det lämpligt att detektera mindre rikligt mRNA före rikligare avskrifter. Dessutom Fast Red och Fast Blue substratkombinationer är betydligt mindre känsliga än purpleblue BCIP / NBT fläck, så att snabba färgämnen företrädesvis tillämpas i första färgning runt för detektering av starkare uttryckt transkript. Också denna timsom den fördelen att efterföljande BCIP / NBT färgning kan övervakas och stoppas i tid innan purpleblue signalen blir för mörkt i förhållande till de lättare Snabba färgämnen. Således i en standard tvåfärgad experiment, först starkare uttryckt mRNA detekteras av Fast Red och andra den svagare en av BCIP / NBT. Som ett alternativ till de snabba färgämnen de gula INT substratkombinationer kan tillämpas, vilket dock producera fällningar som blir diffusa efter en viss tid. Därför BCIP / INT uteslutande tillämpas i den sista färgning omgången. Följaktligen i en tre-färg experiment använder vi ofta först Fast Red, andra BCIP / NBT (eller Fast Blue) och tredje en INT substratkombination. Observera att det är lämpligt att fotografera färgade embryon så snart som möjligt vid tillämpning INT.
Fluorescensdetektion av azofärgämnen
Det kan ibland vara svårt att känna igen överlappande uttrycksmönster när en mörkare färg fällning skuggar en ljusare. Feller exempel, kan en starkt utvecklad BCIP / NBT fällning mask ljusare Snabba färgsignaler. Ett sätt att komma runt detta problem är att omedelbart ta bilder efter varje färgning och ta bort den pålagda färgen fällningen innan nästa detekterings runda. I detta fall är alkohollösliga azo dye (Fast Red) och INT fällningar avlägsnades genom etanol tvättar efter den första och den andra detekterings rundor, respektive, och BCIP / NBT färgning används som den sista AP-substrat 26. En annan möjlighet är att dra fördel av de fluorescerande egenskaperna hos azofärgämnen. Fast Red kan visualiseras med rodamin filteruppsättningar 27, medan Fast Blue kan observeras med långt rött filter 28,29. Jämförelse eller överlagring av kromogena och fluorescerande bilder kan avslöja platsen för co-distribution.Using detta tillvägagångssätt, BCIP / NBT-signal utveckling måste stoppas i tid, så att det inte blir alltför tät och släcka den fluorescerande signalen från azofärgämnet reaktionsprodukt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolor whole-mount in situ hybridization. Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
