Summary
We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.
Abstract
Om gen regulerende netwerken actief tijdens embryonale ontwikkeling en organogenese is het essentieel om precies te bepalen hoe de verschillende genen tot expressie ruimtelijk ten opzichte van elkaar in situ analyse. Multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) aanzienlijk vergemakkelijkt de onderhavige vergelijking van genexpressiepatronen, omdat daarmee onderscheidend visualiseren van verschillende mRNA-soorten in contrasterende kleuren in hetzelfde proefstuk. Dit geeft de mogelijkheid om genexpressie domeinen topografisch tot elkaar met een hoge nauwkeurigheid en unieke expressie overlappende gebieden definiëren. In de gepresenteerde protocol beschrijven we een MC-WISH procedure voor het vergelijken van mRNA expressiepatronen van verschillende genen in Drosophila embryo. Maximaal drie RNA probes, elk specifiek voor een ander gen en gelabeld met een ander hapteen, gelijktijdig gehybridiseerd aan het embryo monsters vervolgens gedetecteerd met alkaline fosfatase-gebaseerde colorimetrische immunohistochemie. De beschreven procedure wordt hier voor Drosophila gedetailleerd, maar werkt net zo goed met de zebravis embryo's.
Introduction
In situ hybridisatie (ISH) is de standaardmethode voor de detectie en lokalisatie van RNA-transcripten in de morfologische context, in cellen, weefsels en organismen 1. De signalen die door de ISH procedure worden gewoonlijk gevisualiseerd door radioactieve, fluorescerende en chromogene detectiesystemen. In de afgelopen jaren aanzienlijke technologische vooruitgang in fluorescente ISH (FISH) 2 resulteerde in sterk verbeterde gevoeligheid en resolutie, waardoor de detectie en kwantificering van RNA-expressie in single-cell en sub-cellulair niveau en RNA visualisatie tot enkele moleculen 3,4 .Terwijl geavanceerde single-molecule FISH werkwijzen worden gebruikt voor meer gespecialiseerde toepassingen, chromogene ISH wijdverspreid als routine RNA in situ detectie werkwijze onderzoek en klinische diagnostiek. Voor chromogene detectie enzym neerslagreacties gebruikt, die zichtbaar produkten contrasterende kleuren bij het plaatsen genereren5 van hybridisatie. Dit heeft het voordeel dat RNA visualisatie te combineren met routinematige histologische vlekken en morfologische context is direct duidelijk door standaard helderveld microscopie. Bovendien tal van de toegepaste substraten kleur produceren precipitaten, die stabiel in organische en / of waterige fixeermiddelen zijn, zodat permanent monsterbereidingen worden verkregen 5.
In Drosophila, eerste ISH protocollen toegepast-radio-isotoop gelabelde probes voor transcriptie detectie op doorsnede materiaal 6. Hoewel het moeilijk is te reconstrueren weefselcoupes volledige transcript patronen van gehele embryo of orgaansystemen, de toepassing van chromogene ISH procedures met niet-radioactief gemerkte probes maakt het mogelijk om wereldwijd detecteren RNA verdelingen geheel-mounts 7. Hoewel vele variaties van chromogene ISH bestaan, in de typische whole-mount in situ hybridisatie (WISH) protocollen hybridized-hapteen gelabelde probes worden gedetecteerd door anti-hapteen antilichamen geconjugeerd aan een reporter-enzym en mRNA transcripten worden gevisualiseerd door een neerslagmiddel chromogeen.
Het palet van verschillend gekleurde precipitaten door de reporter enzymen alkalische fosfatase (AP), mierikswortelperoxidase (POD) en beta-galactosidase (GAL) maakt de onderscheidende detectie van meerdere doelen in een en hetzelfde monster 8-14. Echter, POD enzymatische activiteit duurt slechts een beperkte tijdsperiode en gal colorimetrische reactie is iets minder gevoelig, waardoor zonder extra (tyramide) signaalversterking 15 de detectie van minder overvloedige transcripten uitdaging met deze enzymen kan worden. In tegenstelling, de blijvende activiteit van AP zorgt voor langdurig substraat omzet en een hoge signaal-ruisverhouding. Daarom heeft sequentiële detectie gebruik AP reporter enzym met verschillend gekleurde substraten succesvol gebleken in de effectieve enonderscheidende detectie van tot drie verschillende transcripten in één embryo 10-12,16.
Voor deze multi-target chromogene WISH (MC-WISH) werkwijze (figuur 1) 14, gelabeld antisense RNA-probes gegenereerd door in vitro transcriptie en voorzien van een van de beschikbare hapteen-labels. Embryo formaldehyde gefixeerd en permeabel gemaakt met methanol behandeling en proteinase K digestie. Hybridisatie van embryo gelijktijdig uitgevoerd met maximaal drie verschillend gemerkte antisense RNA probes elk specifiek voor een ander gen. Na verwijdering van ongebonden probe van stringente wassingen elk hapteen-label wordt gevisualiseerd in een afzonderlijke ronde detectie. Een enkel detectie ronde bestaat incubatie van embryo met een anti-hapteen antistof gekoppeld aan AP en RNA visualisatie door toepassing van een AP-substraat dat een gelokaliseerde stabiele kleur neerslag produceert. Na antilichaamdetectie en vlekken, de toegepaste antilichaam-AP conjupoort wordt verwijderd door een lage pH wassen. In veelkleurig experimenten elke ronde detectie maakt gebruik van een antilichaam gericht tegen een ander hapteen-label en elk transcript patroon wordt zichtbaar gemaakt door een andere kleur substraat (tabel 1). Embryo's worden aangebracht in glycerol en afgebeeld onder hoog-resolutie samengestelde microscoop met differentiële interferentie contrast (DIC) optiek.
Protocol
1. Labeling van RNA-probes in vitro door transcriptie
- Monteer in vitro transcriptie reactie in 1,5 ml microbuisjes onder RNase-vrije omstandigheden: 10,5 pi DEPC behandeld H2O, 4,0 pi 5x transcriptiebuffer, 1,0 pl (1 pg) gelineariseerd gezuiverde template DNA in DEPC behandeld H 2 O, 1,3 ui NTP mix, 0,7 gl-hapteen gelabeld UTP, 0,5 pi RiboLock RNA inhibitor, 2,0 ul RNA-polymerase.
Opmerking: Het uiteindelijke reactievolume 20 pl. - Afhankelijk van de sjabloon promotorsequentie gebruik T7, T3 of SP6 RNA polymerase voor de in vitro transcriptie (zie referentie 17).
- Selecteer digoxigenine-11-UTP, biotine-16-UTP of fluoresceïne-12-UTP als label voor de RNA-probe. Voor meer informatie, zie de bespreking van hapteen-labels en probe concentraties in de discussie.
- Meng transcriptiereactie en spin down binnenkort.
- Laat transcriberengedurende 3 uur bij 37 ° C.
- Voeg 1 ul RNase-vrij DNase I bij de transcriptie reactie voor verwijdering van matrijs DNA, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Pas met DEPC behandeld H 2 O van het monster volume tot 200 ul.
- Voeg 100 pl (0,5 vol) 7,5 M ammoniumacetaat en 600 pl (3 vol) ethanol gelabelde RNA-probe precipiteren. Incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Gebruik ijskoude ethanol, omdat dit kan leiden tot ongewenste precipitatie van opgenomen nucleotiden.
- Spin down het getranscribeerde RNA in een temperatuurgeregelde centrifuge bij maximale snelheid (20.800 x g) gedurende 30 min bij 20 ° C. Zorgvuldig aspireren supernatans.
- Was de resulterende pellet met 70% ethanol bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 20.800 xg gedurende 10 min bij 20 ° C.
- Verwijder supernatant en wees voorzichtig niet om de losse pellet ongeluk te zuigen. Laat pellet drogen in microbuisjes met geopende deksel voor een paar minuten bij kamertemperatuur.
- Disoplossen van de verkregen pellet in 100 pl DEPC behandeld H 2 O.
- Voeg 300 pi pre-hybridisatiebuffer (50% vol / vol gedeïoniseerd formamide, 5x SSC, 50 ug / ml heparine natriumzout, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml morulagist RNA) en bewaar bij -20 ° C . Probes kunnen langdurige bewaard bij -20 ° C.
Opmerking: Voor een eerste test van de nieuw getranscribeerd probe verdunde 3 ul-hapteen gelabelde RNA probe in 100 ul hybridisatie buffer om de uiteindelijke concentratie van de WISH experiment te verkrijgen.
2. Verwerking van Embryo monsters met behulp van Voegt
Opmerking: Het gebruik microbuisjes of multi-well platen voor verwerking embryo door de verschillende incubatiestappen draagt het risico dat significante hoeveelheden embryo's er per ongeluk opzuigen tijdens uitwisseling van oplossingen. Om dit verlies te voorkomen, kan het nuttig zijn om manden (zoals netwell inserts) voor het vervoer van embryo monsters door de procedure te gebruiken. Deze zijn polystyreeninserts met een polyester maas op de bodem (Figuur 2A), waarvan de embryo rusten tijdens de verwerking.
- Voor de verwerking van embryo's in de WISH procedure, de montage van de inserts in een 12-well plaat (Figuur 2B) en voeg 2 ml van de juiste oplossing in elk putje.
- Pipetteer de embryo's in de inserts met behulp van een blauwe tip. Zorg ervoor dat alle embryo's worden ondergedompeld in een vloeistof.
- Wanneer incubatietijd voorbij de plaats embryo-bevattende inserts in een 12-well plaat, die is gevuld met de oplossing voor de volgende stap.
- Gebruik dragers en handvatten (figuur 2C) te dragen tot 12 monsters tegelijkertijd van de ene naar de andere oplossing (figuur 2D).
Opmerking: Om de vereiste volumes te verminderen, gebruik 2,0 ml microbuisjes voor de pre-hybridisatie / hybridisatie stappen (zie stap 4.1) en de 24-well platen voor de kleuring reacties (STEP 6.2). De hybridisatie en kleuring reacties worden uitgevoerd in volumina van 1001, l en 400 gl resp.
- Gebruik dragers en handvatten (figuur 2C) te dragen tot 12 monsters tegelijkertijd van de ene naar de andere oplossing (figuur 2D).
3. Bereiding van embryo's voor hybridisatie
- Verzamelen, dechorionate, repareren en devitellinize embryo's met behulp van standaard procedures 14,18. De bereide embryo routinematig bewaard in methanol bij -20 ° C.
- Transfer embryo's worden gebruikt voor in situ hybridisatie tot kamertemperatuur en gedistribueerd naar de inserts van een 12-wells plaat gevuld met 2 ml methanol per putje.
- Hydrateren embryo's door een afnemende reeks methanol bij kamertemperatuur. Incubeer embryo telkens 3 minuten in: (i) 75% methanol in 1x PBS (ii) 50% methanol in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% methanol in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% Tween-20.
- Pre-fix het embryo in 4% paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder het fixeermiddel door 4 wassingen gedurende 3 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur. Ondertussen ontdooien en bereiden proteinase K en glycine werkende oplossingen.
- Stop de reactie door twee spoelingen in 1 min 2 mg / ml glycine in 1x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur.
- Na de vaststellen van de embryo's in 4% paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Vervolgens verwijdert paraformaldehyde fixeermiddel door wassen viermaal gedurende 3 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur.
- Transfer achteraf vast embryo's voor een pre-hybridisatiebuffer. WINKEL embryo pre-hybridisatie buffer bij -20 ° C of direct tot hybridisatie van probes.
4. Hybridisatie probes
- Transfer embryo bewaard bij -20 ° C in pre-hybridisatiebuffer tot kamertemperatuur. Verdeel embryo in de pre-hybridisatie buffer in 2,0 ml microtubes.
- Gedurende 30 min op een minimum, pre-embryo hybridiseren monsters bij 65 ° C in pre-hybridisatiebuffer.
Opmerking: Voor pre-hybridisatie en hybridisatie stappen een waterbad wordt gebruikt. Tijdens pre-hybridisatie er tijd om de probe-mengsel te bereiden uit maximaal drie antisense RNA probes, elk specifiek voor een ander gen transcript en gelabeld met een ander hapteen. - Om de probe-mengsel te verkrijgen, voeg samen geschikte hoeveelheden (gewoonlijk tussen 1 pi tot 6 pl) van elk gewenst oorspronkelijke hapteen gemerkte antisense RNA-probe van 100 ul hybridisatiebuffer (50% vol / vol gedeïoniseerd formamide, 5x SSC, 50 ug / ml heparine natriumzout, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA, 5% w / v dextran sulfaat).
Opmerking: Het toevoegen van dextransulfaat is optioneel. - Denatureren de antisense RNA-probe-mengsel in een verwarmingsblok bij 80 ° C gedurende 5 min. Vervolgens overdracht van de gedenatureerde probe-mengsel direct op 65 ° C.
- Verwijder het meeste pre-hybridisatiebuffer uit het embryo samples op de gedenatureerde probe-mengsel.
- Laat embryo monsters hybridiseren met probe mix O / N bij 65 ° C.
Opmerking: temperaturen tussen 55 ° C en 65 ° C worden routinematig gebruikt voor hybridisatie, pre- en post-hybridisatie stappen. Hybridisatie bij 65 ° C biedt strengste voorwaarden wordt aanbevolen bij achtergrondproblemen bij gebruik van lagere temperaturen. Als er geen achtergrondproblemen, hybridisatie bij 55 ° C aanbevolen, die het voordeel van verbeterde signaalsterkte en verbeterde embryo integriteit verschaft. - De volgende morgen eerst de stringentie wasoplossingen overbrengen naar 65 ° C, om ervoor te zorgen dat ze verwarmd tot de juiste temperatuur in de tijd.
- Transfer hybridisatieprobe mix met embryo's uit 2,0 ml microbuisjes inserts in een 12-wells plaat met 2 ml voorverwarmd hybridisatie wasbuffer (50% formamide in 2 x SSC, 0,1% Tween-20). Plaats de 12-wells plaat met het emBryo monsters in een oven en incubeer gedurende 20 minuten bij 65 ° C.
- Transfer embryo monsters 2 ml nieuwe hybridisatie wasbuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij 65 ° C. Herhaal nog een keer deze stap.
- Verwijder overmaat probe door 20 minuten wassen bij 65 ° C, eenmaal in 2 x SSC, 0,1% Tween-20 en drie maal in 0,2 x SSC, 0,1% Tween-20.
- Breng de embryo monsters 1x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur.
- Incubeer de embryo's in blokkerende buffer (8% schapen serum in 1x PBS, 0,1% Tween-20) gedurende ten minste 30 min bij kamertemperatuur.
5. Antibody Detectie van hapteen-gelabelde probes
Opmerking: In tegenstelling tot de gelijktijdige hybridisatie van drie verschillend gemerkte probes, wordt elke probe gedetecteerd na elkaar in afzonderlijke ronden van antilichaam incubatie en kleuring. Daarom is in elk detectie door slechts één antilichaam wordt gebruikt (ofwel anti-digoxigenine-AP of anti-fluoresceïne-AP of anti-biotine-AP).
- Kies tussen STEP5.1.1 tot 5.1.3 en vult het bereiden van de geschikte antilichaam verdunning volgens de hapteen-label dat moet worden gedetecteerd.
Opmerking: Voor opeenvolgende detectie van de verschillend gemerkte probes, wordt een anti-hapteen antilichaam toegepast in elke detectiecyclus.- Voor detectie van een fluoresceïne-gelabelde probe verdund anti-fluoresceïne AP-conjugaten 1: 4000 in blokkerende buffer.
- Voor detectie van een digoxigenine-gemerkte probe verdund anti-digoxigenine-AP conjugaten 1: 4000 in blokkerende buffer.
- Voor detectie van een met biotine gelabelde probe bereiden van een anti-biotine-AP conjugaat oplossing bij een 1: 4000 verdunning in blokkeerbuffer.
- Incubeer embryo's in de geselecteerde anti-hapteen-AP oplossing gedurende 3 tot 4 uur bij KT. Als alternatief, incubeer O / N bij 4 ° C. Niet alle drie antilichamen niet gelijktijdig van toepassing.
- Om ongebonden antilichaam te verwijderen was de embryo met 1x PBS, 0,1% Tween-20 gedurende 4 maal 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Om buffersystemen veranderen wash tweemaal 15 min bij kamertemperatuur in TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20).
6. alkalische fosfatase Chromogene kleuring
- Na antilichaamdetectie kiezen STEP 6.1.1 tot 6.1.4 en vervolgens één van de alkalische fosfatase kleuring chromogene reactie op het gewenste kleursignaal te verkrijgen (zie tabel 1). Voor elke ronde van de detectie een andere chromogene substraat reactie wordt toegepast op elke transcript patroon in een andere kleur te markeren.
- Fast Red kleuring
- Was de embryo tweemaal gedurende 15 min in TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% Tween-20).
- Terwijl het wassen van embryo's, de voorbereiding van de Fast Rode vlekken oplossing uit de Fast Red TR / NAMP alkalisch fosfatase Substrate Tabletten Set.
- Ontbinding van een buffer tablet uit de set in 1 ml gedestilleerd water tablet en meng door vortexen tot 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 te verkrijgen.
- Drop een Fast Red TR / NAMP tablet in de voorbereide Tris buffer en los door vortexen om de Fast Red kleuring oplossing te verkrijgen.
- Clear Fast Red kleuroplossing van niet-opgeloste deeltjes door een 0,2 urn spuitfilter.
- Fast Blue kleuring
- Was embryo tweemaal gedurende 15 min in vers SB8.2 kleurbuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- Tijdens het wassen embryo, bereid de Fast Blue kleuring oplossing van 50 mg / ml Fast Blue BB (in DMF) en 50 mg / ml naftol fosfaat (in DMSO) voorraadoplossingen.
- Vers bereid een Fast Blue BB oplossing bij 0,5 mg / ml in SB8.2.
- Vers bereid een aparte naftol fosfaatoplossing bij 0,5 mg / ml in SB8.2.
- Druppelsgewijs de bereide naftol fosfaatoplossing in de Fast Blue BB oplossing onder constant mengen met een vortex toe. De resulterende uiteindelijke werking concentratie 0,25 mg / ml voor zowel substraatbestanddelen.
Opmerking: Verschillende Snel Blauw / nafthol Phosphaat combinaties resulteren in verschillende tinten (zie tabel 1).
- BCIP / NBT kleuring
- Was embryo tweemaal gedurende 15 min in vers SB9.5 kleurbuffer (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20).
- Voor een purpleblue chromogene signaal, vers BCIP / NBT kleuroplossing te bereiden door het toevoegen van 1 pi levamisol, 3,5 gl BCIP en NBT 4,5 gl per ml SB9.5 vlekken buffer en meng.
- INT kleuring
- Was de embryo tweemaal gedurende 15 min in vers SB9.5 kleurbuffer.
- Voor een geelbruin chromogene signaal, vers INT kleuroplossing te bereiden door het toevoegen van 1 pi levamisol, 5 pl Magenta-Phos en 5 gl INT per ml SB9.5 vlekken buffer en meng.
Let op: U kunt ook gebruik maken van 7,5 pl / ml BCIP / INT kant-en-klare kleuroplossing.
- Fast Red kleuring
- Voor de kleuring reactie overdracht embryo monsterseen 24-wells plaat. Incubeer elk monster in 400 ul van de gekozen kleuroplossing in het donker.
- Monitor signaal af en ontwikkeling onder een stereomicroscoop. Stop de kleuring reactie wanneer de gewenste signaalsterkte wordt verkregen en voor belangrijke achtergrond signaal wordt waargenomen.
- Om de chromogene reactie te stoppen overbrengen lood inserts van embryo's in een 12-wells plaat met 2 ml TNT per putje. Spoel de gebrandschilderde embryo's twee maal in TNT.
- Was de embryo tweemaal gedurende 10 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur om resterende substraat te verwijderen.
7. Antibody Verwijdering / alkalisch fosfatase Inactivatie
- Verwijder antilichaam en inactiveren alkalisch fosfatase door incubatie in 2 ml lage pH stopoplossing (0,1 M glycine-HCl pH 2,2, 0,1% Tween-20) gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- 1 min spoelen met 2 ml van 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur.
- Was 3 maal gedurende 3 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur.
8. Tweede Detection Ronde
- Aan de distributie patroon van een tweede transcript te sporen verder te gaan met de detectie van antilichaam-hapteen gelabelde probes (STEP 5,1-5,4) met behulp van antilichaam-AP conjugaten gericht tegen het tweede hapteen-label.
- Voer alkalische fosfatase chromogene kleuring (stap 6,1 tot 6,5) het aanbrengen van een substraat combinatie die een contrasterende kleur aan die gebruikt in de eerste detectie round produceert (beschikbare kleuren zie Tabel 1).
- Verwijder tweede antilichaam-AP conjugaat zoals beschreven in stap 7,1-7,3.
9. Third Detection Ronde
- Om het verspreidingspatroon van een 3 transcript detecteren, verder met detectie van antilichaam-hapteen gelabelde probes (stap 5,1 tot 5,4) met behulp van antilichaam-AP conjugaten specifiek voor het 3 hapteen-label.
- Voeren alkalische fosfatase chromogene kleuring (STEP 6,1-6,5) het aanbrengen van een substraat combinatie die niet was apgetwijnd in de voorafgaande detectie ronden. Kies een chromogene reactie die veroorzaakt kleur precipiteren gemakkelijk te onderscheiden van die van de voorgaande twee detectie rondes (voor de kleurkeuze zie tabel 1).
10. Montage en Imaging
- Transfer goed gekleurd embryo's tot 30% glycerol in PBS en incubeer tot embryo's volledig zijn gedrenkt in de glycerol oplossing. Ze zijn goed evenwicht gebracht wanneer zij naar de bodem zinken.
- Transfer embryo tot 70% glycerol in H2O en laat equilibreren bij kamertemperatuur. De gekleurde embryo's kunnen worden opgeslagen in 70% glycerol bij 4 ° C.
- Voor montage pipet gekleurd embryo's in een 70% glycerol druppel op een object glijbaan en zonder gebruikmaking van de afstandhouders vastgelijmd aan de slede (figuur 3). Breng het deksel slip.
- Bekijk gemonteerd embryo onder een dissectie microscoop. Verplaats de toegepaste dekglaasje, zodat de embryo's draaien naar de gewenste positie.
- Goed observerenoriented embryo's met een hoge resolutie (20X, 40X doelstellingen) onder een samengestelde microscoop met Differentieel Interferentie Contrast optiek.
- Beelden vastleggen met een digitale kleuren camera en besparen op digitaal opslagapparaat.
Representative Results
De beschreven protocol voorziet in de gelijktijdige weergave van meerdere transcript patronen in verschillende kleuren. MC-WISH biedt het voordeel voor de expressiepatronen van verschillende genen vergelijken in hetzelfde embryo. Als voorbeeld, de expressiepatronen van lege spiracles (EMS) 19, fushi tarazu (FTZ) 20 en slordig gepaarde 1 (SLP1) 21 zijn direct vergeleken in Drosophila melanogaster blastoderm embryo's en gevisualiseerd in diverse kleurschakeringen (figuur 4) .
Verschillende AP substraat combinaties zijn verkrijgbaar voor een panel van contrasterende kleur precipitaten (Tabel 1) te verkrijgen. De rode kleur neerslag geproduceerd door Fast Rood en de paarse neerslag geproduceerd door BCIP / NBT kan gemakkelijk te onderscheiden en worden daarom gebruikt meest voorkomendely in twee kleuren experimenten (Figuur 4A). Echter, de BCIP / NBT vlek snel omslaan in een vrij donkere kleur, zodat de Fast Rode kleur is vermomd in het geval van een gedeeltelijke co-distributie van transcripten. Daarom kan de toepassing van Fast Blue van voordeel, die blauw, groen en violet producten leidt in combinatie met NAMP, NAGP en NABP respectievelijk (tabel 1). De combinatie van Fast Blauw met NAMP geeft een lichtblauwe kleur die gemakkelijk te onderscheiden van de Fast Red product in aangrenzende of overlappende expressie-domeinen zoals hier getoond EMS en SLP1 expressie plaatsen gevisualiseerd in rood en blauw respectievelijk (Figuur 4B). De Fast Blue NAGP combinatie geeft een vergelijkbaar sterk contrast met de Fast Red vlek, zodat de groene EMS domein duidelijk onderscheidend van de rode SLP1 expressie (figuur 4C). Echter, als ems en SLP1 meningsuiting sites zijn debeschermd door Fast Blue NABP en Fast Red respectievelijk de resulterende violette en rode kleur precipitaten minder waarneembaar (figuur 4D). Zoals hierboven vermeld, Fast Red en Fast Blue NAGP gemakkelijk te onderscheiden zoals getoond door SLP1 en FTZ expressie in rood en groen, respectievelijk (figuur 4D).
MagentaPhos in combinatie met INT produceert een geel neerslag, dat wordt gebruikt om de expressie van segmentale FTZ (figuur 4C, E) onthullen. De geel gekleurde neerslag genereert goed contrast met de blauw gekleurde substraten zoals bijvoorbeeld de detectie van SLP1 en FTZ met Fast Blue NAMP en MAG / INT respectievelijk (figuur 4E). De gele neerslag minder gemakkelijk waarneembaar uit de Fast Red product. De gele gebrandschilderde expressie domein van ems kan nauwelijks Disti worden nguished van de rostrale uitdrukking van SLP1 in het rood weergegeven (Figuur 4F). Daarom is de combinatie van kleuren substraten moet zorgvuldig gekozen worden voor elk experiment.
Figuur 1. Stroomdiagram van de MC-WISH. Voor veelkleurige visualisatie van drie unieke transcript patronen, kiezen tussen verschillende antilichaam-AP conjugaten en kleur substraat combinaties in elke detectie cyclus. Afkortingen: AP, alkalische fosfatase; BIO, biotine; DIG, digoxigenine; FLUO, fluoresceïne. Voor andere afkortingen zie legendes naar figuur 4 en tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
s / ftp_upload / 53.830 / 53830fig2.jpg "/>
Figuur 2. Inserts als embryo dragers. (A) Voegt aangebracht aan de onderkant met polyester membranen van 15 mm diameter en 74 urn maaswijdte worden gebruikt als Drosophila embryo dragers. (B) De inzetstukken zijn gemonteerd in 12-well platen, die functioneren als reservoir trays voor de verschillende oplossingen. (C) beschikbare dragers en handvatten laten verwerken van (D) 12 inserts / embryo monsters tegelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Bevestiging van gekleurde embryo. Embryo's worden gemonteerd in een daling van 70% glycerol tussen twee stapels dekglaasjes, die fungeren als afstandhouders. Zachte beweging van de appgelogen groot dekglaasje helpt om de gemonteerde embryo's te draaien in de gewenste richting voor observatie en fotografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Multicolor visualisatie van mRNA-transcripten in Drosophila embryo's. Voorbeelden van MC-WISH experimenten in Drosophila embryo's worden getoond van een zijdelings uitzicht. De mRNA expressie patronen van lege siphonen (ems), Fushi tarazu (FTZ) en slordig Gekoppelde 1 (SLP1) worden gevisualiseerd door verschillende kleuren AP substraat combinaties, die zijn aangegeven op elk paneel. Transcripten werden gedetecteerd door (A) FTZ FLUO en ems DIG, (
| Substraat combinatie | Voeg toe aan 1 ml AP buffer | Concentratie [ug / ml] | AP buffer | Kleur | Signaalgevoeligheid |
| BCIP NBT | 3,5 ul 4,5 pl | 175 337,5 | SB9.5 | purper | +++ |
| MAG INT | 5 pi 5 gl | 250 250 | SB9.5 | geel | + |
| BCIP / INT stockoplossing | 7,5 pl | 250 250 | SB9.5 | geel | + |
| Fast Blue NAMP | 5 pi 5 gl | 250 250 | SB8.2 | blauw | ++ |
| Fast Blue NABP | 20 ul 10 ul | 1000 500 | SB8.2 | violet | ++ |
| Fast Blue NAGP | 10 ul 10 ul | 500 500 | TT8.2 | groen | + |
| Fast Red NAMP | 1 tablet | 1000 400 | TT8.2 | rood | ++ |
Tabel 1. Ondergrond combinaties Afkortingen: +++, sterk;. ++, Medium; +, Zwak NBT, 4-nitro-blauw-tetrazolium chloride; BCIP, 5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat; INT, 2- (4-joodfenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5-fenyl-tetrazolium chloride; MAG, Magenta-Phos, 5-broom-6-chloor-3-indolyl-fosfaat, NAMP, naftol-AS-MX-fosfaat; NABP, Naftol-AS-BI-fosfaat; NAGP, Naftol-AS-GR-fosfaat; SB9.5, kleuring buffer bij pH 9,5; SB8.2, kleuring buffer bij pH 8,2; TT8.2, Tris-Tween-buffer bij pH 8,2.
Discussion
In situ hybridisatie (ISH) met radioactief gemerkte nucleïnezuur probes wordt vaak gebruikt om de lokalisatie van RNA te detecteren op weefselcoupes. De radioactieve ISH methode is echter tijdrovend, minder gevoelig, en bevat waardering volledige transcript distributiepatronen geheel-mounts niet toestaan. In contrast, maakt de hierin beschreven MC-WISH methode de directe vergelijking van verschillende genexpressie domeinen in contrasterende kleuren binnen intact embryo's. MC-WISH heeft het voordeel dat histologische context is onmiddellijk duidelijk en eenvoudig gevisualiseerd door standaard helderveld microscopie. Dit geeft de mogelijkheid om genexpressie domeinen topografisch tot elkaar met een hoge nauwkeurigheid te bepalen en unieke expressie overlappende locaties op een snelle en betrouwbare manier. Anderzijds multiplex fluorescente ISH (FISH) is krachtiger inzake de gevoeligheid en de resolutie en wordt bij voorkeur gebruikt als cellulaire of subcellulaire reoplossing van mRNA detectie is vereist.
Het brede spectrum van transcripten die in kaart is gebracht door MC-WISH suggereert dat vrijwel elke transcript kan worden geanalyseerd niet alleen in embryonale ook in larven en volwassen weefsels en anders dan Drosophila species. Inderdaad, de procedure beschreven hier beschreven voor Drosophila, werkt op dezelfde manier efficiënt met de zebravis embryo's 11,16,22. Bovendien kan de MC-WISH werkwijze worden aangepast om een groot aantal ongewervelde en gewervelde embryo en weefselmonster.
Hapteen-labels en probeconcentraties
We gebruiken routinematig fluoresceïne, digoxigenine en biotine als hapteen labels RNA probes. Bovendien-dinitrofenol gemerkte probes kunnen worden toegepast, die in zebravis WISH experimenten 23-25 werden ingevoerd. Fluoresceïne-gelabelde probes vertonen een geringere gevoeligheid in vergelijking met de andere hapteen-labels, zodat de fluoresceïne wordt het best gebruikt fof detectie van overvloedige transcripten. Elke nieuw getranscribeerd sonde wordt eerst getest in een enkele WISH experiment, waarbij de prestaties worden geëvalueerd of met BCIP / NBT of Fast Red als substraat. Een probe concentratie wordt beschouwd als optimaal wanneer een sterk signaal zonder achtergrond ontwikkeling wordt bereikt binnen minuten tot enkele uren.
Om ervoor te zorgen dat de expressie domeinen van belangstelling hebben in hun volle omvang door MC-WISH is ontdekt, is het essentieel om elke transcript patroon door de single-label WISH experimenten met de meest gevoelige substraat combinatie, BCIP / NBT visualiseren. Dit zorgt ervoor dat zwakke expressie domeinen niet over het hoofd in de multi-target experiment. Ter compensatie van de geringere gevoeligheid van het andere substraat combinaties is het essentieel om gebruik verdubbeld (verdrievoudigd) probe concentraties in vergelijking met standaard BCIP / NBT kleuring.
Lage pH inactivatie
De lage pH inactivatie stap kan leiden totgedeeltelijke desintegratie van de antisense-hapteen gelabelde RNA probe / sense mRNA hybriden verminderd detectiesignaal in de tweede en derde ronde kleuring. Om verlies in gevoeligheid te minimaliseren, inactivatiestappen zo kort mogelijk. We ervaren dat een 10 min incubatietijd bij lage pH is voldoende voor de eliminatie van AP-activiteit. De daaropvolgende snelle wassingen in grote hoeveelheden zorgen voor een snelle verdunning van AP-gebonden antilichaam conjugaten te voorkomen en opnieuw binden aan het hapteen gemodificeerde probes. Alternatieve procedures omvatten paraformaldehyde fixatie en warmte-inactivatie. Sommige van de kleur precipitaten niet stabiel hitte en paraformaldehyde fixatie niet voldoende om volledige inactivatie van AP zijn. Onvolledige inactivering van de eerste toegepaste antilichaam-AP conjugaat kan leiden tot opnieuw visualisatie van het mRNA patroon in de volgende detectie round leidt tot vals positieve overlap in expressie met de tweede mRNA-species te detecteren. Daarom is in een controle-experiment the embryo's worden gesplitst in twee fracties na inactivering van het eerste toegepaste antilichaam-AP-conjugaat. Het tweede antilichaam-AP conjugaat wordt weggelaten uit de controle gedeelte en zou geen signaal in de tweede kleurreactie te produceren. Indien de tweede kleurreactie een signaal verspreidingspatroon corresponderend met de eerste, dan de inactivatie procedure niet efficiënt. In dit geval dient de incubatietijd bij lage pH stopoplossing worden verlengd voor het volgende experiment.
Bestellingen van AP substraat applicatie
Omdat gevoeligheid druppels met elke volgende ronde van detectie, is het raadzaam om minder overvloedig mRNA te detecteren vóór overvloediger transcripten. Bovendien Fast Red en Fast Blue substraatcombinaties zijn aanzienlijk minder gevoelig dan de purpleblue BCIP / NBT vlek, zodat Fast kleurstoffen bij voorkeur worden toegepast in de eerste kleuring door voor detectie van de sterkere expressie transcript. Ook dit hals voordeel dat latere BCIP / NBT kleuring kan worden gecontroleerd en gestopt voordat de purpleblue signaal eindigt te donker ten opzichte van de lichtere Fast kleurstoffen. Dus in een standaard twee-kleuren experiment, eerst de sterkere uitgedrukt mRNA wordt gedetecteerd door Fast Rood en tweede van de zwakkere door BCIP / NBT. Als alternatief voor de Fast kleurstoffen gele INT substraat combinaties kunnen worden toegepast, die echter produceren precipitaten die raken diffuse na enige tijd. Daarom BCIP / INT wordt uitsluitend toegepast in de laatste vlekken round. Dus in een drie-kleuren experiment gebruiken we vaak eerst Fast Red, tweede BCIP / NBT (of Snel Blauw) en de derde een INT substraat combinatie. Merk op dat het raadzaam is om lood embryo's fotograferen zo snel mogelijk bij de toepassing van INT.
Fluorescentiedetectie van azokleurstoffen
Het kan soms moeilijk zijn om overlappende expressiepatronen herkennen wanneer een donkerdere kleur neerslag shadowing een lichtere. Fof kan bijvoorbeeld een sterk ontwikkeld BCIP / NBT neerslag lichtere Fast kleurstof signalen maskeren. Een manier om dit probleem te omzeilen is om beelden direct na elke kleuring vangen en verwijder de toegepaste kleur neerslag voor de volgende detectie door. In dit geval worden in alcohol oplosbare azokleurstof (Fast Red) en INT precipitaten verwijderd door wassen ethanol na de eerste en tweede detectie ronde respectievelijk en BCIP / NBT kleuring wordt toegepast als laatste AP-substraat 26. Een andere mogelijkheid is om gebruik te maken van de fluorescerende eigenschappen van azokleurstoffen. Fast Red kunnen worden gevisualiseerd met behulp van rhodamine filtersets 27, terwijl Fast Blue kan worden waargenomen met ver-rode filters 28,29. Vergelijking of overlay van chromogene en fluorescerende beelden kan de plaats van gelijktijdig distribution.Using deze benadering BCIP / NBT signaal ontwikkeling openbaren moet worden gestopt in de tijd, zodat het niet te dicht en wordt het fluorescentiesignaal van de azokleurstof doven reactieproduct.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
References
- Hauptmann, G. In Situ Hybridization Methods. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O'Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T.
- Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
