Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Glaukom framkallande ordningen i en Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

Glaukom är en sjukdom i det centrala nervsystemet som drabbar retinala ganglieceller (RGC: er). RGC axoner som bildar synnerven bär visuell input till hjärnan för visuell perception. Skador på RGC och deras axoner leder till synförlust och / eller blindhet. Även om den specifika orsaken till glaukom är okänd, är den primära riskfaktorn för sjukdomen ett förhöjt intraokulärt tryck. Glaukom framkallande förfaranden i djurmodeller är ett värdefullt verktyg för forskare som studerar mekanismen för RGC död. Sådan information kan leda till utveckling av effektiva nervskyddande behandlingar som kan hjälpa till att förebygga synnedsättning. Protokollet i detta dokument beskriver en metod för att inducera glaukom - lika förhållanden i en in vivo råttmodell där 50 pl 2 M hyperton saltlösning sprutas in i episklerala venösa plexus. Blanche av fartygen indikerar lyckad injektion. Denna procedur orsakar förlust av RGC att simulera glaukom. En månad efterinjektion avlivas djuren och ögonen avlägsnas. Därefter hornhinnan, linsen och glaskroppen bort för att göra en ögonmusslan. Näthinnan är sedan dras av från bakre delen av ögat och nålas på Sylgard rätter med kaktus nålar. Vid denna punkt, kan nervceller i näthinnan färgas för analys. Resultat från denna laboration visar att cirka 25% av RGC försvinner inom en månad efter det förfarande jämfört med den interna kontrollen. Detta förfarande möjliggör kvantitativ analys av retinal ganglion celldöd i en in vivo rått glaukom modell.

Introduction

Glaukom är en grupp av ögonsjukdomar som påverkar neuroner i näthinnan, specifikt, de retinala ganglionceller 1-2. Axonerna hos dessa celler konvergerar till att bli synnerven som bär visuell information till hjärnan där sikten är uppfattas. Skador på RGC och deras axoner orsakar därför synfel.

De primära egenskaper som förknippas med glaukom störningar är RGC degeneration och död, förhöjt intraokulärt tryck (lOP) och synnervspapillen cupping och atrofi. Dessa funktioner leder till synfältsbortfall eller fullständig, irreversibel blindhet. För närvarande har glaukom orsakas blindhet i 70 miljoner människor i världen 3. Som sådan, är det världens tredje största orsaken till blindhet 4.

Den exakta mekanismen för RGC död i glaukom förblir okänd. Mycket forskning har gjorts för att låsa upp mysteriet. Det är emellertid känt, att den primära riskfaktorn för glaukom är en ökning in intraokulära trycket på grund av oregelbunden spridning av kammarvatten (AH) i den främre ögonkammaren. AH fungerar som en transparent och färglös ersättning för blod i avaskulära främre ögonkammaren. Det ger näring de omgivande cellerna, avlägsnar utsöndrade restprodukter från metaboliska processer, transporter neurotransmittorer och möjliggör cirkulationen av läkemedel och inflammatoriska celler i ögat under patologiska tillstånd 1.

Upprätthållandet av kammarvatten cirkulation involverar ciliarkroppen och det trabekulära nätverket. Vattenhaltig humor produceras av ciliarkroppen. Den flyter sedan in i den främre kammaren för att upprätthålla den allmänna hälsan hos den okulära vävnaden. 75-80% av kammarvatten utflöde utsöndras aktivt genom icke-pigment ciliära epitelet när fluiden filtreras genom tre skikt av svampliknande vävnad i ciliarmuskeln. Fluid går ut genom det trabekulära nätverket och genom Schlemms kanal som gripatalet in i blodsystemet 5 .Det återstående 20 - 25% av utflödet kringgår det trabekulära nätverket och är passivt utsöndras av ultrafiltrering och diffusion genom uveo-skleral reaktionsvägen. Denna väg synes vara relativt oberoende av det intraokulära trycket 1.

När kammarvatten produktionen och utflödet är i obalans, byggs tryck i ögat. Såsom angivits, är denna ökning av det intraokulära trycket den primära riskfaktorn för utvecklingen av glaukom. Sådant tryck orsakar skador på de intrikata lager av neuroner i näthinnan vid baksidan av ögat. Skador på de retinala ganglion cell axoner av synnerven orsakar hjärnan att inte längre ta emot korrekt visuell information. Som ett resultat, är uppfattningen av sikt förlorad och fullständig blindhet kan förekomma.

Hittills finns det inget botemedel mot glaukom. Olika behandlingsmetoder finns som i första hand syftar till att minska det intraokulära trycket. Dessa inkluderar topiskmedicinering klasser såsom beta1-adrenerga receptorblockerare, eller utvärtes prostaglandinanaloger. Betablockerare minskar det intraokulära trycket genom att minska produktionen av kammarvatten 7. Prostaglandiner fungerar för att minska det intraokulära trycket genom att öka utflödet av kammarvatten 8-14. Alfa-adrenergiska agonister och kolsyraanhydrasinhibitorer används också som sekundära behandlingsmetoder. Alpha adrenerga agonister ökar utflödet genom uveosklerala vägen 15-17. Karbanhydrashämmare minska produktionen av AH genom enzymatisk inhibition 18. Mycket mer invasiva procedurer används också för att behandla glaukom. Laser trabeculoplasty används för att öka utflödet av kammarvatten 19. En annan kirurgisk behandling, kallad trabekulektomi skapar en alternativ plats dränering för att filtrera AH när den traditionella trabekulärt vägen är blockerad 20-21.

Dessa behandlingar har varit kända för att effektivt reducera lOP. Men upp till 40% av glaukompatienter visar normala IOP nivåer som indikerar ett behov av mer kompletta terapeutiska metoder. 22,23 Dessutom är irreversibel retinal ganglion celldöd ses i glaukom när den börjar och nuvarande behandlingar inte stoppa utvecklingen av sjukdomen 24-28. Detta har belyst behovet av effektiva neuroprotektiva terapier som riktar sig mot överlevnaden av nervceller själva. Utveckling av glaukom modeller är avgörande för denna utveckling.

I denna studie visar vi en metod för att inducera glaukom liknande effekter hos vuxna Long Evans-råttor med användning av ett modifierat förfarande som ursprungligen beskrivs av Morrison 29. I detta förfarande, injektioner av 2 M hyperton saltlösning i den episklerala venus plexus inducerar glaukomliknande tillstånd genom ärrbildning vävnad för att minska kammarvattenutflöde i det trabekulära nätverket vilket leder till en ökning i intraokulärt tryck och en betydande förlust av RGC wnom en månad av förfarandet 30-31. Glaukom framkallande förfaranden, såsom den som beskrivs här, kan vara nyckeln till ny utveckling inom glaukombehandlingar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som använder djurförsök har varit i enlighet med de normer för Institute of Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Western Michigan University.

1. Djur

  1. Använd han- och honråttor 3 månaders ålder i denna studie.
  2. Hålla djuren i en 12 timmar ljus / mörker-cykel med fri tillgång till mat och vatten.

2. Beredning av KAX Cocktail för djurens Anesthesia

  1. Lös upp 50 mg xylazin (20 mg / ml) i 5 ml ketamin (100 mg / ml) med 1 ml acepromazin (10 mg / ml) och 3 ml destillerat vatten. Blanda omsorgsfullt.
  2. Sterilisera med en sprutfilter och lagra denna lösning i en 10 ml serumflaska.

3. KAX Injektion

  1. Väg djur (g) och återvända till buren tills klar för injektion.
  2. Injicera 0,1 ml KAX / 100 g kroppsvikt intraperitonealt, med hjälp av en spruta 1 ml insulin med en 28 G nål.
  3. Tillåtaför djur att bli medvetslös. Kontrollera reflexer genom att klämma fötter och svans.
  4. Förvara alla djur på ett säkert sätt i laboratorium under hela operationen.
  5. Efter operationen, ersätta djur i sina burar och hålla bekväm i RT tills medvetandet återfås. Bara tillbaka djur till djur tjänst när djuren vakna och återuppta normala beteende.

4. Förberedelser för kirurgi och Micro Assembly

  1. Göra en steril 2 M NaCl-lösning.
  2. Använd en mikro avdragare (Figur 1C) för att dra en 0,86 mm innerdiameter tung polerad standard och tunnväggiga borosilikat röret i två fint avsmalnande glasmikronålar (Figur 1D figur 1E).
  3. Återfyllning en mikronål från föregående steg med 2 M saltlösning med användning av en återfyllning sprutnål och en 1 ml spruta (Figur 1B). Knacka ut luftbubblor från spetsen av elektroden.
  4. Fyll en andra 1 ml spruta med 2 MNaCl. Anslut en 18 G nål och sedan fästa en längd (ca 10 inches) av polyeten slang (Figur 1A). Använda sprutkolven för att fylla polyetylenrör med saltlösning genom nålen.
  5. När både mikronålen och slang är fyllda med koksaltlösning, noggrant ansluta två. Eliminera all luft i samband mellan dem (Figur 2).
  6. Fint avfasning spetsen av mikronålen genom att skrapa det mycket lätt mot strömmen av en kurs pappershandduk.
  7. Kontrollera motståndet hos mikronålen genom att försiktigt trycka in kolven på sprutan tills en fin ström av vätska kan ses på den pappershandduk. Strömmen av vätska bör inte vara bredare än 0,5 mm.

5. Beredning av djur

  1. Applicera 1 - 2 droppar topiskt anestetikum till hornhinnan (proparakain hydroklorid oftalmisk lösning, USP, 0,5%). Vänta tills ingen okulär reflex inträffar.
  2. Trim whiskers med en sax.
  3. Saturate en bomullstopp med Betadine lösning och kompress området runt den experimentella ögat.
  4. Med hjälp av ett mikroskop, bifoga en hemostat för att klämma den nedre ögonlocket för att bukta ögat, exponera episklerala ven och begränsa ögonrörelser. (Figur 3, pilspets)

6. Glaukom-inducerande Saline Injection

  1. När mikronålen montering och djuret är beredda, börjar injektioner.
  2. När djuret har bekräftats att vara okänslig för fot / svans nypa försiktigt tränga igenom episklerala ven med mikronålen genom att komma på en låg vinkel mellan 10 och 20 grader till venen (Figur 3, vit pil). En framgångsrik punktering i venen är uppenbar när blod kommer in i spetsen av mikronålen (Figur 3, svart pil).
  3. Långsamt och manuellt injicera ca 50 | j, l koksaltlösning in i venen. Detta bör ta cirka 10 sekunder. Venerna kommer blekna vit som saltet cirkulerar through vaskulaturen (Figur 4, pilspets). Vissa regioner får behålla en blodröd utseende (Figur 4, pil).
    1. Utföra en andra injektion i venen, motsatt till stället för den första, för att säkerställa grundlig retinal skada på fullständiga näthinneganglieceller skiktet.
      Obs: Inom några minuter, bör man se ett distinkt grumligt utseende genom ögats iris som saltet cirkulerar genom det vaskulära systemet.
  4. Lämnar den motsatta öga obehandlat för användning som en intern kontroll.

7. Animal Recovery

  1. Ta bort hemostat.
  2. Använd en bomulls applikatorn att tillämpa trippel antibiotisk salva (zinkbacitracin neomycinsulfat, polymysin B-sulfat) till platsen fastklämd av hemostat och injektionsställen. Vävnadsskada runt ögat inte sker med hjälp av hemostat.
  3. > Placera sövda djur i sina burar på en cirkulerande varmt vatten filt att bakåtent hypotermi. Hålla djuren under observation tills medvetandet och normalt beteende är åter. Transport vakna djur tillbaka till djuret koloni. Djuren kvarhålls i koloni fram tidpunkten för avlivning.

8. djuroffer och Retina Removal

  1. En månad efter det förfarande för att inducera glaukom, djuren avlivades genom CO2 kvävning och sekundär bröst punktering.
    1. Placera djuret i kammaren och sätt på locket ordentligt.
    2. Öppna CO 2 och gas reglerventiler för att möjliggöra 20% volym / min CO2 förskjutning av syre i kammaren.
    3. Låt fyra till fem minuter för djuret att upphöra.
    4. Stänga båda ventilerna.
    5. Ta bort djur från kammaren och utföra en sekundär bröstkorg punktering med en steril skalpell.
  2. Efter eutanasi, använd en skalpell för att skära bindväv i omlopps hålighet som omger ögat, being noga med att inte skära in i ögongloben själv.
  3. Använd noggrant vikta kanten sax för att klippa synnerven och eventuell kvarvarande vävnad för att extrahera intakta ögongloben. Placera extraherade ögonglob i en steril 60 mm x 15 mm engångspetriskål med färsk PBS.
  4. Gör en ögonmussla från ögongloben. För att göra detta, gör ett litet snitt med skalpell bara posteriort om gränsen mellan iris och sklera. Följ detta snitt runt omkretsen av ögat med små fjäder sax för att avlägsna hornhinnans hemisfären från ögongloben. Halvsfären som är ansluten till den optiska nerven återstår.
  5. Hitta mycket tunn rosa / beige näthinnan inuti ögonmusslan från avlivas djuret. Håll pigmenterade lagret av näthinnan med trubbiga pincett för att stabilisera ögonmusslan. Använd en annan par slutna pincett för att mycket försiktigt retas hela intakta näthinnan bort från bakre delen av ögat. Undvik att klämma, dra eller rycka näthinnan direkt.
  6. Använd små våren sax för att klippaområde där synnerven är fortfarande fäst till näthinnan.
  7. Var noga med att skära bort eventuellt kvarvarande pigmentepitel eller skleral vävnad från näthinnan.
  8. Med användning av en överföringspipett, mycket försiktigt överföra den isolerade näthinnan till en ren Sylgard belagd 35 mm x 10 mm petriskål med färsk PBS.

9. Hela-Mount Retina Förberedelse

  1. Väl inne i sylgard skålen, använd pincett och en kaktus nål för att fästa näthinnan på plats. Håll näthinnans ganglion cellager uppåt och synnerven ner. Näthinnans halvsfärisk form är noterbart även efter fixering. Krökning av näthinnan kommer att krypa mot taket när näthinneganglieceller skiktet är i den önskade orienteringen.
  2. Använda en liten sax för att klippa näthinnan i fyra kvadranter, vilket gör formen av en fyra blad klöver som strålar ut från det optiska nervhuvudet.
  3. Stift kvadranterna i näthinnan med ytterligare kaktus nålar för att göra näthinnan så platt som möjligt utan but sträckning (Figur 5).
  4. Fäst fästs näthinnor i sylgard skålen med 3 ml 4% paraformaldehyd O / N vid RT.

10. Antikropp Färgning av Retina

Obs: Stain fasta näthinnor med primära och sekundära antikroppar för visning neuroner i näthinnan (Figur 6).

  1. Skölj fasta, platta monterade näthinnor tre gånger för två minuter vardera i PBS.
  2. Permeabilisera näthinnor med 1% Triton X-100 med 1% fetalt bovint serum i PBS under 60 min.
  3. Rinse näthinnor tre gånger, 2 min vardera, i PBS.
  4. Skölj två gånger med 0,1% Triton X-100 i PBS, 5 min per tvätt.
  5. Skölj två gånger med PBS, 5 minuter per tvätt.
  6. Inkubera med 1% Triton X-100 och 1% fetalt bovint serum i PBS vid RT under 45 min.
  7. Skölj två gånger med 0,1% Triton X-100 i PBS, 5 min per tvätt.
  8. Skölj två gånger med PBS, 5 minuter per tvätt.
  9. Inkubera varje näthinna i 3 ml 1% fetalt bovinserum i PBSmed renat mus-anti-rått-CD90 / mus CD90.1 (1: 300 spädning) O / N vid RT.
  10. Skölj näthinnor en gång med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
  11. Skölj två gånger med PBS, 5 minuter per tvätt.
  12. Inkubera varje näthinna i 3 ml PBS (utan FBS) med sekundär Alexa Fluor 594 get-anti-mus-IgG (1: 300) O / N vid RT.
  13. Tvätta näthinnor med PBS frikostigt.
  14. Med hjälp av en dissekera mikroskop, försiktigt bort kaktus nålar från näthinnan.
  15. överföra försiktigt näthinnor på objektglas med en överföringspipett. Var noga med att bibehålla orientering med retinal ganglion cellager som vetter mot taket. Näthinnans halvsfärisk form är noterbart även efter fixering. Krökning av näthinnan kommer att krypa mot taket när näthinneganglieceller skiktet är i den önskade orienteringen.
  16. Absorbera överflödigt PBS med KimWipe eller annat sådant absorberande material. Var noga med att inte absorbera näthinnan.
  17. Tillsätt 5 droppar ½ glycerol och ½ PBS vikt som amounting media.
  18. Täck näthinnan med täck undvika luftbubblor.
  19. Säker täck använder genomskinligt nagellack, lim eller annat bindemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det här avsnittet visar apparatkomponenter och förfarande som används för att framkalla glaukomliknande tillstånd i en in vivo rått glaukom modell. Vi visar de individuella verktyg och utrustning som används för att utföra en hyperton saltlösning injektion vilket orsakar en ökning av det intraokulära trycket. Vi visar injektion i episklerala venus plexus med sin karakteristiska blanche effekt och den grumliga utseendet hos den främre kammaren som resulterar. Vi beskriver också processen för näthinnan bort och platt-montering för analys av förlorade RGC. Slutligen visar vi effekterna av injektionen på retinala ganglioncellöverlevnad. Eftersom fördelningen av RGC är ojämn i olika regioner av rått näthinnan, är bilder som erhållits från fyra 200 | j, m 2-regioner i varje näthinna, 4 mm bort från centrum av det optiska nervhuvudet. Det totala antalet Thy 1.1 märkta RGC i varje avsnitt räknas i genomsnitt och jämförs i experimentell och kontro ol näthinnor 31. Med denna metod, ändrade RGC räknas från ett genomsnitt på 225 i en bild av kontroll obehandlade villkor till 168 en månad efter ingreppet för att inducera glaukom liknande tillstånd (N = 30). Sammantaget kan de förfaranden som beskrivs här följas steg för steg för att analysera död retinala ganglion cellkroppar och axoner.

Figur 1
Figur 1. mikronål Components. (A) spruta med polyetenslang används för saltlösning injektion. (B) Återfyllning spruta användas för återfyllning borsilikatet mikronål. (C) Narishige elektrod avdragare används för att göra borosilikat mikronålar. (D) borsilikatglas elektroder före och efter att dras i elektroden avdragare. (E) förstorad bild av mikrokanylspetsen efter att dras.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Komplett mikronål Assembly. Micro bifogas polyetenrör fäst vid sprutan med hyperton saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Glaukom framkallande Saline Injektion i den episklerala Venös Plexus. Bild saltlösning injektion i episklerala ven av en levande, sövda Long Evans råttan. Pilspetsen indikerar placeringen av hemostat användes för att bukta ut ögat och förhindra dess rörelse. Den vita pilen indikerar den lokalisering av den injicerade venen. Den svarta pilen visar blodet tillbaka strömmar in mikronålen spetsen indikerar framgångsrik venpunktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Blanche Effekten av hyperton koksaltlösning Injection. Bild av råtta öga som injiceras med hyperton saltlösning. Pilspetsen visar den karakteristiska blanche effekten av saltlösning i episklerala venösa plexus. Pilen visar en del av den episklerala venösa plexus som ännu inte har blanche. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

31 / 53831fig5.jpg "/>
Figur 5. Platt-mount i Rat Retina. Bild av hela montera näthinnan bort från råtta ögat och fästs lägenhet i en sylgard skål med kaktus nålar. Den svarta pilen visar synnerven huvudet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Skador på näthinneganglieceller efter Glaukom framkallande kirurgi. Jämförelse av kontroll obehandlade ögat (A) till experimentell ögat (B) en månad efter att ha fått glaukom inducera saltlösning injektion. Näthinnor märktes med en antikropp mot RGC markör, Thy 1,1 (CD90). Tunna pilar indikerar individuella RGC i både kontroll- och experimentbetingelser. Proceduren leder till en minskning av antalet av RGC, defascikulation av axoner utanför huvud axonet buntar, och snedvridning av cirkel återstående RGC. Block Pilarna anger de karakteristiska defasciculating axoner till följd av saltlösning injektion. Pilspetsen visar ett blodkärl i retina. Tvåsocklad pilar etikett Axon buntar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en metod för att inducera glaukom liknande förhållanden i en in vivo råttmodell. Denna procedur använder en injektion av hyperton saltlösning för att inducera ärrbildning i det trabekulära nätverket 29, 32. Utveckling av ärrvävnad ockluderar utflödet av kammarvatten, vilket ökar trycket i den främre kammaren. Med minskad utflöde och tryck bygga upp, linsen upphängd med elastiska ligament skjuter tillbaka in i glaskroppen kammaren. Glaskroppen gäller sedan tryck på näthinnan skada de ömtåliga näthinnans nervceller. Våra resultat med hjälp av detta förfarande visar att retinala ganglioncellantal börjar krympa på 2 veckor med betydande förlust av gangliecell förlust på en månad efter ingreppet.

Detta protokoll är endast ett förfarande för inducering av glaukom hos gnagare. Det finns många andra experimentella modeller i vilka skada på retinala ganglionceller åstadkommes antingen genom en ökning av det intraokulära trycket eller genom direkt damage på synnerven 30. Ofta har dessa metoder utvecklats i större djur och ändras för tillämpning på möss och råttor 33. Intraokulära injektioner av toxiner såsom staurosporin 34 och NMDA, den icke-hydrolyserbara glutamatanalog 35 inducerar snabba retinal ganglion celldöd. Studier har emellertid visat att sådana gifter följer en dos-responskurva hos möss och andra än de mål ganglioncellerna 35 effektceller. Dessutom är skador på retinala ganglionceller i denna modell mycket mer direkt än den gradvisa utvecklingen av human glaukom.

Direkta skador på synnerven kan också åsamkas. Laser axotomy är ett vanligt sätt för att avskilja de axoner som bildar synnerven i möss 36. Men presenterar denna metod vissa komplikationer. Den lilla storleken på gnagare banor gör det svårt att exakt skada synnerven utan att påverka blodflödet genom central retinal arteryoch ven. För att lösa detta, vissa forskare använder en mer invasiv metod innebär avlägsnande av en liten del av hjärnan för att ge bättre tillgång till synnerven 37. Synnerven krossa modeller tillgång synnerven intraorbitalt också. I denna modell är nerven kläms av självstängande pincett och okulär blodflödet inte äventyras. Detta förfarande resulterar i en omedelbar förolämpning och synkron död retinal ganglion cell. Studier som använder denna modell visar betydande förlust av RGC 38. Men vissa hävdar att det kan inducera mer skada än den som orsakas av förhöjt lOP enbart 39. Dessutom är glaukom kännetecknas av långsam, kronisk, asynkron förlust av retinala ganglionceller 33, 39-42 .Därför, tidsförloppet och den underliggande mekanismen för skadorna med synnerven krossa kan vara helt annorlunda än den som förekommer i mänsklig glaukom. I motsats, den modell som diskuteras i detta dokument undviker behovet av direkt access på synnerven, eliminerar dissektion av hjärnvävnad, och gör det möjligt att gradvis retinal ganglion cellskador.

Mikrokornet ocklusion modeller av glaukom använda polystyren eller magnetiska pärlor injiceras i främre kammare hos råttor eller möss för att höja IOP. Merparten av detta arbete har gjorts på möss och de visar endast en låg till måttlig nivå av skador i synnerven med stor variation i resultaten och inkonsekventa uppgifter 43-50. Vid användning av råttor, varaktigheten av förhöjt IOP var för kort för att få tillräckligt med skador på cellerna 48. Även med ändringar av förfarandet, fortfarande orsakade modell allvarliga skador i kort varaktighet motsvarar en akut neuropatisk modell snarare än en kronisk glaukom modell 51. Smedowski et al 43 har nyligen utvecklat en ytterligare modifierad mikrokorn förfarandet med en extra inledande "högtrycks skada" för att uppnå längre livslängd IOP höjd med kroniska skador som does utställning löfte. Fler studier som använder denna teknik är nödvändiga för att ytterligare bekräfta denna modell.

Modeller av kronisk okulär hypertension som mål att hindra ögonkammarvatten utflöde. Laserfotokoagulation av episklerala och limbala vener 52 och episklerala venocklusion 53 är två sådana metoder. Det har emellertid också visat sig att laserablation tekniker producerar endast övergående IOP höjd och en måttlig nivå av själva cellförlust 36, 54-55.

Glaukom är en kronisk sjukdom till följd av skador och förlust av retinala ganglieceller vars axoner utgör synnerven. Mekanismen för denna förlust är okänd. Medan en ökning av det intraokulära trycket är kännetecknande riskfaktor, vissa har föreslagit inblandningen av andra faktorer. Sådana faktorer inkluderar inflammatoriska processer, oxidativ stress, metaboliska oegentligheter eller blodflödesstörningar 56-58. För att avslöja den exakta mekanismen för cell död i denna sjukdom, forskare behöver enkla, repeterbara och funktionella sätt att noggrant efterlikna förhållanden som förekommer i human glaukom. Först då kan hoppas forskarna att finna ett sätt att skydda retinala ganglieceller från att dö. Det förfarande som beskrivs i detta dokument använder ett artificiellt förhöjning av lOP för att producera en gradvis, irreversibel förlust av retinala ganglionceller liknande den som ses i glaukompatienter 31. Proceduren är minimalt invasiv. Betydande retinal ganglioncellförlust mäts inom en månad efter operationen. Denna metod är ett viktigt verktyg för studier av glaukom. En potentiell begränsning av denna metod är det manuella injektion av hyperton koksaltlösning. På grund av detta manuella metoden är det möjligt att förvänta sig stor variation i resultaten. Emellertid har vi identifierat den blanche effekt i venen för att vara ett kritiskt steg. Om blekning inträffar är retinal ganglion cellförlust alltid mellan 18 och 29%. För att stödja detta kunde alla framtida studier Modify förfarandet till att omfatta rutinmätningar IOP att säkerställa att dessa injektioner leder till en mätbar ökning av IOP. 29,31. Kanske denna modell av RGC död kommer att leda till utvecklingen av en mer fullständig nervskyddande behandling som bekämpar den förödande synförlust drabbar miljontals människor världen över.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Tags

Medicin råtta glaukom injektion, näthinna hela-mount platt-mount neurovetenskap retinala ganglionceller okulär hypertension ögonsjukdomar
Glaukom framkallande ordningen i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Råttmodell och Hela montering Retina Förberedelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter