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Medicine

ग्लूकोमा उत्प्रेरण एक के ि Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

मोतियाबिंद रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने की एक बीमारी है। RGC ऑप्टिक तंत्रिका को बनाने एक्सोन दृश्य धारणा के लिए मस्तिष्क को दृश्य इनपुट ले। RGCs और उनके एक्सोन को नुकसान दृष्टि हानि और / या अंधापन की ओर जाता है। हालांकि मोतियाबिंद के विशिष्ट कारण अज्ञात है, रोग के लिए प्राथमिक जोखिम कारक एक ऊंचा intraocular दबाव है। पशु मॉडल में ग्लूकोमा उत्प्रेरण प्रक्रियाओं RGC मौत की व्यवस्था का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं। इस तरह की जानकारी के लिए प्रभावी उपचार है कि न्यूरोप्रोटेक्टिव दृष्टि हानि की रोकथाम में सहायता कर सकता है के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एक विवो चूहे मॉडल की स्थिति में जहां 2 एम अतितनावी खारा के 50 μl अधिश्वेतपटल सम्बन्धी शिरापरक जाल में इंजेक्ट किया जाता है, जैसे - इस पत्र में प्रोटोकॉल मोतियाबिंद उत्प्रेरण की एक विधि का वर्णन है। जहाजों की blanching सफल इंजेक्शन इंगित करता है। यह प्रक्रिया मोतियाबिंद अनुकरण करने के लिए RGCs की हानि का कारण बनता है। एक महीने के बादइंजेक्शन, जानवरों की बलि दी जाती है और आंखों को हटा रहे हैं। इसके बाद, कॉर्निया, लेंस, और कांच का एक eyecup बनाने के लिए निकाल रहे हैं। रेटिना तो आँख के पीछे से खुली और कैक्टस सुइयों का उपयोग Sylgard व्यंजन पर टिकी है। इस बिंदु पर, रेटिना में न्यूरॉन्स के विश्लेषण के लिए कलंकित किया जा सकता। इस प्रयोगशाला के परिणाम से पता चलता है कि RGCs के लगभग 25% की प्रक्रिया एक महीने के भीतर खो रहे हैं जब आंतरिक नियंत्रण की तुलना में। यह प्रक्रिया एक विवो चूहे मोतियाबिंद मॉडल में रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल मौत के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

Introduction

ग्लूकोमा विशेष रूप से, रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 1-2 रेटिना में न्यूरॉन्स को प्रभावित करने, नेत्र रोगों का एक समूह है। इन कोशिकाओं के एक्सोन ऑप्टिक मस्तिष्क जहां दृष्टि में माना जाता है के लिए दृश्य जानकारी ले जाने तंत्रिका बनने के लिए एकाग्र। RGCs और उनके एक्सोन को नुकसान इसलिए दृश्य दोष का कारण बनता है।

प्राथमिक मोतियाबिंद विकारों के साथ जुड़े विशेषताओं RGC अध: पतन और मौत, वृद्धि हुई intraocular दबाव (आईओपी), और ऑप्टिक डिस्क cupping और शोष हैं। इन सुविधाओं के दृश्य क्षेत्र हानि या पूर्ण, अपरिवर्तनीय अंधापन हो। वर्तमान में, मोतियाबिंद दुनिया भर में 70 लाख लोगों को 3 में अंधापन का कारण है। जैसे, यह दुनिया का अंधापन 4 का तीसरा सबसे बड़ा कारण है।

मोतियाबिंद में RGC मौत की सटीक व्यवस्था अज्ञात है। अधिक से अधिक शोध रहस्य अनलॉक करने के लिए किया गया है। यह जाना जाता है, तथापि, कि मोतियाबिंद के प्राथमिक जोखिम कारक वृद्धि रहा हैजलीय हास्य (एएच) आँखों के पूर्वकाल कक्ष में की अनियमित परिसंचरण के कारण n intraocular दबाव। एएच आंख की avascular पूर्वकाल कक्ष में रक्त के लिए एक पारदर्शी और रंगहीन स्थानापन्न के रूप में कार्य करता है। यह आसपास की कोशिकाओं का पोषण होता है, चयापचय की प्रक्रिया से स्रावित अपशिष्ट उत्पादों को हटा, न्यूरोट्रांसमीटर परिवहन, और रोग राज्यों 1 के दौरान ड्रग्स और आंख के भीतर भड़काऊ कोशिकाओं के संचलन परमिट।

जलीय हास्य संचलन के रखरखाव सिलिअरी शरीर और घरनदार meshwork शामिल है। जलीय हास्य सिलिअरी शरीर द्वारा निर्मित है। यह तो पूर्वकाल कक्ष में बहती नेत्र ऊतक के समग्र स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए। 75 - जब तरल पदार्थ सिलिअरी मांसपेशियों में स्पंजी ऊतक के तीन परतों के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है जलीय हास्य बहिर्वाह के 80% के लिए सक्रिय रूप से गैर-रंगदार सिलिअरी उपकला के माध्यम से स्रावित होता है। घरनदार meshwork के माध्यम से और Schlemm की नहर जो कार्रवाई के माध्यम से तरल पदार्थ बाहर निकालता हैरक्त प्रणाली 5 व्याप्ति शेष 20 में एँ - बहिर्वाह के 25% घरनदार meshwork नजरअंदाज और निष्क्रिय uveo-scleral मार्ग के माध्यम से ultrafiltration और प्रसार द्वारा स्रावित होता है। इस मार्ग में intraocular दबाव 1 की अपेक्षाकृत स्वतंत्र होने के लिए प्रकट होता है।

जलीय हास्य उत्पादन और बहिर्वाह संतुलन से बाहर हैं, आंख के भीतर दबाव बनाता है। कहा गया है, intraocular दबाव में इस वृद्धि के मोतियाबिंद के विकास में प्राथमिक जोखिम कारक है। इस तरह के दबाव आंख के पीछे रेटिना में न्यूरॉन्स की जटिल परतों के लिए नुकसान का कारण बनता है। ऑप्टिक तंत्रिका के रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल एक्सोन मस्तिष्क को नुकसान नहीं रह सटीक दृश्य जानकारी प्राप्त करने के लिए कारण बनता है। नतीजतन, दृष्टि की धारणा को खो दिया है और पूरा अंधापन हो सकता है।

तिथि करने के लिए, वहाँ मोतियाबिंद के लिए कोई इलाज नहीं है। विभिन्न उपचार विधियों मौजूद है कि मुख्य रूप से intraocular दबाव को कम करना है। इन सामयिक शामिलऐसे beta1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर ब्लॉकर्स, या सामयिक प्रोस्टाग्लैंडीन analogues के रूप में दवा वर्गों। बीटा ब्लॉकर्स जलीय हास्य 7 के उत्पादन को कम करके intraocular दबाव को कम। Prostaglandins जलीय हास्य 8-14 का बहिर्वाह में वृद्धि से IOP कम करने के लिए कार्य करते हैं। अल्फा एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट और कार्बोनिक anhydrase अवरोधकों को भी उपचार के तरीके के रूप में माध्यमिक किया जाता है। अल्फा एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट uveoscleral मार्ग के माध्यम से 15-17 बहिर्वाह वृद्धि हुई है। कार्बोनिक anhydrase अवरोधकों एंजाइमी निषेध 18 से आह का उत्पादन कम। बहुत अधिक आक्रामक प्रक्रियाओं भी मोतियाबिंद के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। लेजर trabeculoplasty जलीय हास्य 19 का बहिर्वाह बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक अन्य शल्य चिकित्सा, trabeculectomy कहा जाता है, फिल्टर करने के लिए एएच जब पारंपरिक trabecular मार्ग 20-21 अवरुद्ध है एक वैकल्पिक जल निकासी साइट बनाता है।

इन उपचार के विकल्प eff ज्ञात किया गया हैectively IOP कम। हालांकि, मोतियाबिंद रोगियों का 40% तक अधिक पूर्ण चिकित्सकीय तरीके की आवश्यकता दर्शाते सामान्य IOP स्तरों इसके अतिरिक्त दिखा। 22,23, रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल मौत मोतियाबिंद में देखा अपरिवर्तनीय है एक बार यह शुरू होता है और वर्तमान उपचार रोग की प्रगति को रोक नहीं है 24-28। यह प्रभावी न्यूरोप्रोटेक्टिव चिकित्सा कि न्यूरॉन्स को खुद के अस्तित्व के लक्ष्य के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है। मोतियाबिंद मॉडल का विकास इस विकास के लिए महत्वपूर्ण है।

इस अध्ययन में हम एक संशोधित प्रक्रिया के मूल मॉरिसन 29 द्वारा उल्लिखित का उपयोग कर वयस्क लांग इवांस चूहों में मोतियाबिंद की तरह प्रभाव उत्प्रेरण की एक विधि प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रक्रिया में, अधिश्वेतपटल सम्बन्धी शिरापरक जाल में 2 एम अतितनावी खारा के इंजेक्शन ऊतक scarring द्वारा मोतियाबिंद जैसी स्थिति लाती घरनदार meshwork intraocular दबाव में वृद्धि हुई है और w RGCs का एक महत्वपूर्ण नुकसान के लिए अग्रणी में जलीय हास्य बहिर्वाह कम करने के लिएप्रक्रिया 30-31 के एक माह के Ithin। ऐसे में यहाँ वर्णित एक के रूप में मोतियाबिंद उत्प्रेरण प्रक्रियाओं, मोतियाबिंद के उपचार में नए घटनाक्रम का ताला खोलने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है।

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Protocol

पशु विषयों का उपयोग कर सभी प्रक्रियाओं पश्चिमी मिशिगन विश्वविद्यालय में पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के संस्थान के मानकों के अनुसार किया गया है।

1. पशु

  1. इस अध्ययन में उम्र के 3 महीने का उपयोग नर और मादा चूहों।
  2. भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र में जानवरों रखें।

2. पशु संज्ञाहरण के लिए KAX कॉकटेल की तैयारी

  1. 1 मिलीलीटर acepromazine (10 मिलीग्राम / एमएल) और आसुत जल के 3 मिलीलीटर के साथ 5 मिलीलीटर ketamine (100 मिलीग्राम / एमएल) में xylazine (20 मिलीग्राम / एमएल) के 50 मिलीग्राम भंग। अच्छी तरह से मिश्रण।
  2. एक सिरिंज फिल्टर के साथ बाँझ और एक 10 मिलीलीटर की बोतल में सीरम इस समाधान की दुकान।

3. KAX इंजेक्शन

  1. जानवर (G) वजन और इंजेक्शन के लिए तैयार है जब तक पिंजरे में लौटने।
  2. 0.1 मिलीलीटर KAX / 100 ग्राम पशु शरीर के वजन intraperitoneally इंजेक्षन, एक 28 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर।
  3. अनुमति देंजानवर के लिए बेहोश हो जाते हैं। पैर और पूंछ pinching द्वारा सजगता की जाँच करें।
  4. सर्जरी की अवधि के लिए सुरक्षित रूप से प्रयोगशाला में सभी जानवरों रखें।
  5. सर्जरी के बाद, उनके पिंजरों में जानवरों की जगह है और आरटी में आराम से रख जब तक होश आ गया है। केवल जानवरों की सुविधा के लिए जानवरों वापसी जब जानवरों को जगाने और सामान्य व्यवहार को फिर से शुरू।

4. सर्जरी और Microneedle विधानसभा के लिए तैयारी

  1. एक बाँझ 2 एम NaCl समाधान करें।
  2. दो पतले पतला कांच microneedles (चित्रा -1, चित्रा 1E) में एक 0.86 मिमी भीतरी व्यास भारी पॉलिश मानक और पतली दीवारों ट्यूब borosilicate खींचने के लिए एक microelectrode खींचने (चित्रा 1 सी) का प्रयोग करें।
  3. 2 एम खारा एक backfilling सिरिंज सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर के साथ पिछले चरण से एक Microneedle backfill। इलेक्ट्रोड की नोक से हवा के बुलबुले बाहर नल।
  4. 2 एम के साथ एक दूसरे 1 मिलीलीटर सिरिंज भरेंNaCl। एक 18 जी सुई कनेक्ट और फिर पॉलीथीन ट्यूबिंग (चित्रा 1 ए) की लंबाई (लगभग 10 इंच) देते हैं। सिरिंज सवार का प्रयोग सुई के माध्यम से नमक के साथ पॉलीथीन ट्यूबिंग भरने के लिए।
  5. दोनों Microneedle और ट्यूबिंग नमक के साथ भर रहे हैं, ध्यान से दो कनेक्ट। (चित्रा 2) उन दोनों के बीच संबंध में किसी भी हवा को हटा दें।
  6. पतले एक कोर्स कागज तौलिया के अनाज के खिलाफ बहुत हल्के ढंग से यह scraping द्वारा Microneedle की नोक बेवल।
  7. धीरे जब तक तरल का जुर्माना धारा कागज तौलिया पर देखा जा सकता है सिरिंज पर सवार धक्का द्वारा Microneedle के प्रतिरोध की जाँच करें। तरल की धारा 0.5 मिमी की तुलना में कोई व्यापक होना चाहिए।

5. पशु की तैयारी

  1. लागू करें 1 - 2 बूँदें कॉर्निया के लिए सामयिक संवेदनाहारी (Proparacaine हाइड्रोक्लोराइड नेत्र समाधान, खासियत, 0.5%)। जब तक कोई नेत्र पलटा होता है रुको।
  2. कैंची से मूंछ ट्रिम।
  3. एसbetadine समाधान और प्रयोगात्मक आंख के आसपास झाड़ू क्षेत्र के साथ एक कपास टिप applicator aturate।
  4. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, नीचे पलक दबाना आंख उभार, अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नस बेनकाब और आंख आंदोलन को प्रतिबंधित करने के लिए एक hemostat देते हैं। (चित्रा 3, नोक)

6. ग्लूकोमा उत्प्रेरण खारा इंजेक्शन

  1. जब Microneedle विधानसभा और पशुओं के लिए तैयार हैं, इंजेक्शन लगते हैं।
  2. पशु पैर / पूंछ चुटकी करने के लिए अनुत्तरदायी होने की पुष्टि की जाती है, ध्यान से नस (चित्रा 3, सफेद तीर) के लिए 10 और 20 डिग्री के बीच एक कम कोण पर आने से Microneedle साथ अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नस घुसाना। नस में एक सफल पंचर स्पष्ट जब रक्त Microneedle (चित्रा 3, काला तीर) की नोक में प्रवेश करती है।
  3. धीरे धीरे और मैन्युअल लगभग 50 नस में μl खारा इंजेक्षन। यह लगभग 10 सेकंड के लिए ले जाना चाहिए। नसों होगा चूनी सफेद के रूप में नमक अपरोक्ष circulatesऊ वाहिका (चित्रा 4, नोक)। कुछ क्षेत्रों में एक रक्त लाल उपस्थिति (चित्रा 4, तीर) को बनाए रखने सकता है।
    1. एक दूसरे इंजेक्शन, विपरीत पहले की साइट के लिए, पूरा रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत करने के लिए पूरी तरह से रेटिना क्षति सुनिश्चित करने के लिए नस में प्रदर्शन करना।
      नोट: मिनट के भीतर, एक आंख की आईरिस के माध्यम से एक अलग से बादल छाए उपस्थिति के रूप में नमक नाड़ी तंत्र के माध्यम से circulates देखना चाहिए।
  4. विपरीत आंख के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए अनुपचारित छोड़ दें।

7. जानवरों की वसूली

  1. hemostat निकालें।
  2. साइट hemostat द्वारा और इंजेक्शन साइटों को clamped करने के लिए ट्रिपल एंटीबायोटिक मलहम (Bacitracin जस्ता, neomycin सल्फेट, polymysin बी सल्फेट) लागू करने के लिए एक कपास applicator का प्रयोग करें। आंख के आसपास के ऊतकों को नुकसान hemostat का उपयोग कर उत्पन्न नहीं होती है।
  3. > एक घूम गर्म पानी कंबल पर अपने पिंजरों में रखें anesthetized जानवरों के लिए पिछलाईएनटी हाइपोथर्मिया। निगरानी में जानवरों को रखने के लिए जब तक चेतना और सामान्य व्यवहार में आ रहे हैं। जाग जानवरों वापस जानवर कॉलोनी के लिए परिवहन। पशु बलिदान के समय तक कॉलोनी में रहते हैं।

8. पशु बलि और रेटिना को हटाने

  1. मोतियाबिंद के लिए प्रेरित करने की प्रक्रिया के बाद एक महीने, जानवरों सीओ 2 asphyxiation और माध्यमिक वक्ष पंचर द्वारा euthanized हैं।
    1. चैम्बर में पशु रखें और सुरक्षित रूप पर ढक्कन लगा।
    2. सीओ 2 और गैस नियामक वाल्व खुला 20% मात्रा / मिनट सीओ 2 के विस्थापन की अनुमति के लिए चैम्बर में ऑक्सीजन।
    3. पशु समाप्त करने के लिए चार से 5 मिनट की अनुमति दें।
    4. दोनों वाल्व बंद कर दें।
    5. चैम्बर से पशु निकालें और एक बाँझ स्केलपेल के साथ एक उच्च माध्यमिक वक्ष पंचर प्रदर्शन करते हैं।
  2. इच्छामृत्यु के बाद, एक छुरी का उपयोग आंख, बी आसपास के कक्षीय गुहा में संयोजी ऊतक में कटौती करने के लिएएनजी सावधान नेत्रगोलक ही में कटौती करने के लिए नहीं।
  3. ध्यान से ऑप्टिक तंत्रिका और किसी भी शेष ऊतक में कटौती करने के लिए बरकरार नेत्रगोलक को निकालने के लिए घुमावदार बढ़त कैंची का उपयोग करें। एक बाँझ 60 मिमी x 15 मिमी डिस्पोजेबल पेट्री डिश में ताजा पीबीएस युक्त निकाले नेत्रगोलक रखें।
  4. नेत्रगोलक से एक eyecup बनाओ। ऐसा करने के लिए, छुरी के साथ एक छोटा सा चीरा सिर्फ आईरिस और श्वेतपटल के बीच सीमा को पीछे हैं। नेत्रगोलक से कार्निया गोलार्द्ध को दूर करने के लिए छोटे वसंत कैंची के साथ आंख की परिधि के आसपास इस चीरा का पालन करें। गोलार्द्ध ऑप्टिक तंत्रिका से जुड़ा रहता है।
  5. euthanized जानवर से eyecup अंदर बहुत पतली गुलाबी / बेज रेटिना का पता लगाएं। eyecup स्थिर करने के लिए पा संदंश के साथ रेटिना के pigmented परत पकड़ो। बंद संदंश की एक और जोड़ी का प्रयोग बहुत धीरे आंखों के पीछे की बंद पूरी बरकरार रेटिना तंग करने के लिए। , बन्द रखो खींच रहा है, या सीधे रेटिना tugging से बचें।
  6. कटौती करने के लिए छोटे वसंत कैंची का प्रयोग करेंऐसा क्षेत्र है जहां ऑप्टिक तंत्रिका अभी भी रेटिना से जुड़ी है।
  7. दूर किसी भी अवशिष्ट वर्णक उपकला या रेटिना से scleral ऊतक में कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें।
  8. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, बहुत धीरे से एक साफ लेपित 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश ताजा पीबीएस युक्त Sylgard करने के लिए अलग रेटिना हस्तांतरण।

9. पूरे माउंट रेटिना तैयारी

  1. एक बार जब Sylgard डिश में, जगह में रेटिना पिन करने के लिए संदंश और एक कैक्टस सुई का उपयोग करें। रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत और रखें सामना करना पड़ रहा नीचे ऑप्टिक तंत्रिका। रेटिना के अर्धगोल आकार निर्धारण के बाद भी उल्लेखनीय है। रेटिना की वक्रता छत की ओर कर्ल जाएगा जब रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत वांछित अभिविन्यास में है।
  2. चार quadrants में रेटिना में कटौती करने के लिए, एक चार पत्ती तिपतिया घास ऑप्टिक तंत्रिका सिर से radiating की आकृति बनाने छोटे कैंची का प्रयोग करें।
  3. अतिरिक्त कैक्टस सुइयों के साथ रेटिना के quadrants पिन रेटिना के रूप में संभव witho के रूप में फ्लैट बनाने के लिएकेन्द्र शासित प्रदेशों खींच (चित्रा 5)।
  4. 4% paraformaldehyde हे / आरटी पर एन के 3 मिलीलीटर के साथ Sylgard डिश में टिकी रेटिना को ठीक करें।

रेटिना के 10 एंटीबॉडी धुंधला

नोट: प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग तय रेटिना रेटिना में न्यूरॉन्स देखने (चित्रा 6) के लिए।

  1. प्रत्येक 2 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला तय, फ्लैट पर चढ़कर रेटिना पीबीएस में।
  2. 60 मिनट के लिए पीबीएस में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ 1% ट्राइटन X-100 के साथ रेटिना Permeabilize।
  3. कुल्ला पीबीएस में तीन बार, 2 मिनट प्रत्येक, Retinas।
  4. पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100, धोने प्रति 5 मिनट के साथ दो बार कुल्ला।
  5. पीबीएस, धोने प्रति 5 मिनट के साथ दो बार कुल्ला।
  6. 45 मिनट के लिए आरटी पर 1% ट्राइटन X-100 और पीबीएस में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ सेते हैं।
  7. पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100, धोने प्रति 5 मिनट के साथ दो बार कुल्ला।
  8. पीबीएस, धोने प्रति 5 मिनट के साथ दो बार कुल्ला।
  9. पीबीएस में 3 मिलीग्राम 1% भ्रूण गोजातीय सीरम में प्रत्येक रेटिना सेतेशुद्ध माउस विरोधी CD90 चूहे / माउस के साथ CD90.1 (1: 300 कमजोर पड़ने) हे / आरटी पर एन।
  10. रेटिना 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ एक बार कुल्ला।
  11. पीबीएस, धोने प्रति 5 मिनट के साथ दो बार कुल्ला।
  12. माध्यमिक एलेक्सा स्त्राव 594 बकरी विरोधी माउस आईजीजी के साथ 3 मिलीलीटर पीबीएस (कोई एफबीएस) में प्रत्येक रेटिना सेते हैं (1: 300) हे / आरटी पर एन।
  13. उदारतापूर्वक पीबीएस के साथ रेटिना को धो लें।
  14. एक विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग, ध्यान रेटिना से कैक्टस सुइयों को हटा दें।
  15. धीरे से एक हस्तांतरण विंदुक के साथ खुर्दबीन स्लाइड पर रेटिना हस्तांतरण। रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत छत का सामना करना पड़ के साथ उन्मुखीकरण बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें। रेटिना के अर्धगोल आकार निर्धारण के बाद भी उल्लेखनीय है। रेटिना की वक्रता छत की ओर कर्ल जाएगा जब रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत वांछित अभिविन्यास में है।
  16. KimWipe या अन्य ऐसे शोषक सामग्री के साथ किसी भी अतिरिक्त पीबीएस अवशोषित। रेटिना को अवशोषित करने के लिए सावधान रहें।
  17. आधा ग्लिसरॉल के 5 बूँदें जोड़ें और AM रूप में वजन द्वारा पीबीएस आधाounting मीडिया।
  18. coverslip साथ रेटिना को कवर, हवा के बुलबुले से परहेज।
  19. सुरक्षित coverslip स्पष्ट नेल पॉलिश, गोंद, या अन्य चिपकने का उपयोग।

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Representative Results

यह खंड तंत्र घटकों और प्रक्रिया एक विवो चूहे मोतियाबिंद मॉडल में मोतियाबिंद जैसी स्थितियों को प्रेरित किया जाता दिखाता है। हम व्यक्तिगत उपकरण और उपकरणों एक अतितनावी खारा इंजेक्शन जो intraocular दबाव में वृद्धि का कारण बनता प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया दिखा। हम इसकी विशेषता blanching प्रभाव और पूर्वकाल चैम्बर कि परिणामों की उपस्थिति के साथ बादल छाए रहेंगे अधिश्वेतपटल सम्बन्धी शिरापरक जाल में इंजेक्शन दिखा। हम यह भी रेटिना को हटाने और खो RGCs के विश्लेषण के लिए फ्लैट बढ़ते करने की प्रक्रिया का वर्णन है। अन्त में, हम रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल अस्तित्व पर इंजेक्शन के प्रभाव को दिखाने के लिए। के रूप में RGCs के वितरण चूहे रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों में असमान है, छवियों प्रत्येक रेटिना, 4 मिमी ऑप्टिक तंत्रिका सिर के केंद्र से दूर में चार 200 माइक्रोन 2 क्षेत्रों से प्राप्त कर रहे हैं। प्रत्येक अनुभाग में तेरा 1.1 लेबल RGCs की कुल संख्या की गणना की जाती औसत और प्रयोगात्मक और contr में तुलना राजभाषा 31 Retinas। इस विधि का प्रयोग, RGC मायने रखता है 225 की औसत से नियंत्रण इलाज की स्थिति की एक छवि में 168 एक महीने के लिए प्रक्रिया के बाद मोतियाबिंद जैसी स्थितियों के लिए प्रेरित करने के लिए (एन = 30) बदल दिया है। साथ में ले ली, प्रक्रियाओं यहाँ रेखांकित रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल निकायों और axons की मौत का विश्लेषण करने के लिए कदम से कदम का पालन किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. Microneedle अवयव। पहले और इलेक्ट्रोड में खींचा जा रहा है के बाद (ए) पॉलीथीन खारा इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया ट्यूबिंग साथ सिरिंज। (बी) बैकफ़िल borosilicate Microneedle backfill के लिए इस्तेमाल किया सिरिंज। (सी) Narishige इलेक्ट्रोड borosilicate microneedles बनाने के लिए इस्तेमाल डांड़ी। (डी) borosilicate ग्लास इलेक्ट्रोड डांड़ी। (ई) खींचा जा रहा है के बाद microelectrode सुई की नोक के मद्देनजर बढ़ाया।ftp_upload / 53,831 / 53831fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पूरा Microneedle विधानसभा। Microneedle पॉलीथीन अतितनावी नमक के साथ सिरिंज से जुड़ी ट्यूबिंग से जुड़ी है। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ग्लूकोमा उत्प्रेरण में खारा इंजेक्शन अधिश्वेतपटल सम्बन्धी शिरापरक जाल। एक लाइव की अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नस में इंजेक्शन खारा की छवि, anesthetized लांग इवांस चूहा। नोक आंख उभार और अपने आंदोलन को रोकने के लिए इस्तेमाल hemostat के स्थान को इंगित करता है। सफेद तीर को इंगित करता है इंजेक्शन नस का स्थान। काला तीर रक्त वापस microneedle टिप सफल नस पंचर का संकेत में बहने से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. hypertonic खारा की blanching प्रभाव इंजेक्शन। चूहा आंख की छवि अतितनावी खारा के साथ इंजेक्शन जा रहा है। नोक अधिश्वेतपटल सम्बन्धी शिरापरक जाल में खारा की विशेषता blanching प्रभाव दिखाता है। तीर अधिश्वेतपटल सम्बन्धी शिरापरक जाल है कि अभी तक नहीं किया गया है blanched के एक हिस्से को इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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पूरे रेटिना माउंट की चित्रा 5. के फ्लैट माउंट चूहा रेटिना। Image चूहे आँख से हटा दिया है और कैक्टस सुइयों का उपयोग कर एक Sylgard डिश में फ्लैट टिकी। काला तीर ऑप्टिक तंत्रिका सिर इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. ग्लूकोमा उत्प्रेरण सर्जरी के बाद रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को नुकसान। प्रयोगात्मक आंख (बी) के एक महीने के लिए नियंत्रण इलाज आंख (ए) की तुलना खारा इंजेक्शन उत्प्रेरण मोतियाबिंद प्राप्त करने के बाद। Retinas RGC मार्कर, तेरा 1.1 (CD90) के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे। पतला तीर दोनों नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों में अलग-अलग RGCs संकेत मिलता है। प्रक्रिया RGCs की संख्या में कमी आती है, डीमुख्य अक्षतंतु बंडलों बंद axons की स्फुरण, और शेष RGCs के लिए घेरा विरूपण। ब्लॉक तीर खारा इंजेक्शन से उत्पन्न विशेषता defasciculating एक्सोन संकेत मिलता है। नोक रेटिना के भीतर एक रक्त वाहिका से पता चलता है। डबल समाप्त तीर लेबल अक्षतंतु बंडलों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक विवो चूहे मॉडल में मोतियाबिंद जैसी स्थिति उत्प्रेरण की एक विधि का वर्णन है। यह प्रक्रिया घरनदार meshwork 29, 32। निशान ऊतक विकास जलीय हास्य का बहिर्वाह जो पूर्वकाल कक्ष में दबाव बढ़ता occludes में scarring प्रेरित करने के लिए अतितनावी खारा का एक इंजेक्शन का उपयोग करता है। साथ कम बहिर्वाह और दबाव का निर्माण, लेंस लोचदार स्नायुबंधन द्वारा निलंबित कांच के चेंबर में वापस धक्का। कांच का हास्य तो रेटिना नाजुक रेटिना न्यूरॉन्स को नुकसान पहुँचाए पर दबाव लागू होता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि इस प्रक्रिया का उपयोग रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल नंबर 1 महीने के बाद प्रक्रिया में नाड़ीग्रन्थि सेल नुकसान के महत्वपूर्ण नुकसान के साथ 2 सप्ताह में सूखना शुरू करते हैं।

इस प्रोटोकॉल कृन्तकों में मोतियाबिंद उत्प्रेरण का केवल एक ही तरीका है। वहाँ कई अन्य प्रयोगात्मक मॉडल जिसमें रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को नुकसान या तो intraocular दबाव में वृद्धि के द्वारा या सीधे दा के द्वारा पूरा किया जाता हैऑप्टिक तंत्रिका से 30 दाना। अक्सर, इन तरीकों में बड़े जानवरों में विकसित और चूहों और चूहों 33 को आवेदन के लिए संशोधित किया गया है। ऐसे staurosporine 34 और NMDA के रूप में विषाक्त पदार्थों के intraocular इंजेक्शन, गैर hydrolyzable ग्लूटामेट अनुरूप 35 तेजी से रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल मौत प्रेरित। अध्ययनों से पता चला है, तथापि, कि इस तरह के विषाक्त पदार्थों को चूहों और लक्ष्य नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 35 के अलावा अन्य प्रभाव कोशिकाओं में एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र का पालन करें। साथ ही, इस मॉडल में रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को नुकसान ज्यादा मानव मोतियाबिंद की क्रमिक प्रगति की तुलना में अधिक प्रत्यक्ष है।

ऑप्टिक तंत्रिका प्रत्यक्ष नुकसान भी दिए जा सकते हैं। लेजर axotomy एक आम तरीका चूहों 36 में ऑप्टिक तंत्रिका को बनाने एक्सोन तोड़ने के लिए है। हालांकि, इस विधि कुछ जटिलताओं प्रस्तुत करता है। कृंतक कक्षाओं के छोटे आकार यह कठिन बना देता है सही केंद्रीय रेटिना धमनी के माध्यम से रक्त के प्रवाह को प्रभावित किए बिना ऑप्टिक तंत्रिका क्षति के लिएऔर नस। इस पर काबू पाने के लिए, कुछ शोधकर्ताओं ने एक और अधिक आक्रामक आदेश ऑप्टिक तंत्रिका 37 के लिए बेहतर पहुँच प्रदान करने के लिए मस्तिष्क के एक छोटे से हिस्से को हटाने के शामिल दृष्टिकोण का उपयोग। ऑप्टिक तंत्रिका क्रश मॉडल ऑप्टिक तंत्रिका intraorbitally के रूप में अच्छी तरह से उपयोग। इस मॉडल में, तंत्रिका खुद बंद संदंश और आंख का रक्त प्रवाह द्वारा pinched है समझौता नहीं किया है। यह प्रक्रिया एक तत्काल अपमान और रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल के तुल्यकालिक मौत में परिणाम है। इस मॉडल का उपयोग अध्ययन RGCs 38 की महत्वपूर्ण नुकसान दिखा। हालांकि, कुछ लोगों का तर्क है कि यह अकेले 39 बुलंद IOP की वजह से है कि अधिक से अधिक नुकसान उत्पन्न हो सकता है। इसके अतिरिक्त, मोतियाबिंद रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 33, 39-42 .Therefore, समय पाठ्यक्रम और ऑप्टिक तंत्रिका क्रश के साथ दिए गए नुकसान की अंतर्निहित तंत्र की धीमी गति, पुरानी, ​​अतुल्यकालिक नुकसान की विशेषता मानव मोतियाबिंद में होने वाली है कि अधिक से काफी अलग हो सकता है। इसके विपरीत, मॉडल इस पत्र में चर्चा प्रत्यक्ष acce के लिए जरूरत से बचा जाता हैऑप्टिक तंत्रिका एस एस, मस्तिष्क के ऊतकों के किसी भी विच्छेदन समाप्त, और धीरे-धीरे रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल क्षति के लिए अनुमति देता है।

मोतियाबिंद उपयोग polystyrene या चुंबकीय मोतियों की Microbead रोड़ा मॉडल चूहों या चूहों के पूर्वकाल कक्षों में इंजेक्शन IOP तरक्की के लिए। इस काम का सबसे चूहों में किया गया है और वे केवल परिणामों में व्यापक बदलाव और असंगत डेटा 43-50 के साथ ऑप्टिक तंत्रिका में क्षति के मध्यम स्तर के लिए एक कम दिखा। चूहों का उपयोग करते हैं, बुलंद IOP की अवधि भी 48 कोशिकाओं के लिए काफी नुकसान पैदा करने के लिए कम था। प्रक्रिया को संशोधनों के साथ भी, मॉडल अभी भी एक पुरानी मोतियाबिंद मॉडल 51 के बजाय एक तीव्र न्यूरोपैथिक मॉडल का प्रतिनिधित्व कम अवधि में गंभीर क्षति के कारण होता है। Smedowski एट अल 43 हाल ही में एक और संशोधित microbead प्रक्रिया विकसित की है लंबे समय तक टिकाऊ पुरानी क्षति है कि डो के साथ IOP ऊंचाई को प्राप्त करने के लिए एक अतिरिक्त प्रारंभिक 'उच्च दबाव चोट' का उपयोगशो वादा। इस तकनीक का उपयोग अधिक अध्ययन आगे इस मॉडल को मान्य करने के लिए आवश्यक हैं।

पुरानी आंख का उच्च रक्तचाप के मॉडल जलीय हास्य बहिर्वाह में बाधा डालती करने का लक्ष्य है। अधिश्वेतपटल सम्बन्धी और limbal नसों 52 और अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नस रोड़ा 53 की लेजर फोटोकोगुलेशन इस तरह के दो तरीके हैं। हालांकि, यह भी दिखाया गया है कि लेजर पृथक तकनीक केवल क्षणिक IOP ऊंचाई और वास्तविक सेल नुकसान 36, 54-55 के एक मध्यम स्तर का उत्पादन।

ग्लूकोमा एक पुरानी नुकसान और रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं जिसका एक्सोन ऑप्टिक तंत्रिका बनाने के नुकसान से उत्पन्न रोग है। इस नुकसान की व्यवस्था अज्ञात है। जबकि intraocular दबाव में वृद्धि बानगी जोखिम कारक है, कुछ अन्य कारकों की भागीदारी का सुझाव दिया है। इस तरह के कारकों सूजन प्रक्रियाओं, oxidative तनाव, चयापचय अनियमितताओं, या रक्त के प्रवाह में गड़बड़ी 56-58 शामिल हैं। सेल की सटीक व्यवस्था को उजागर करने के लिएइस रोग में एल मौत, शोधकर्ताओं सही नकल मानव मोतियाबिंद में प्रदर्शित होने की स्थिति के लिए सरल, repeatable, और कार्यात्मक तरीके की जरूरत है। तभी तो शोधकर्ताओं ने मरने से रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए एक तरीका ईजाद करने की उम्मीद कर सकते हैं। प्रक्रिया इस पत्र में वर्णित IOP के एक कृत्रिम रूप से प्रेरित ऊंचाई का उपयोग करता मोतियाबिंद रोगियों 31 में देखा है कि इसी तरह रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के एक क्रमिक, अपरिवर्तनीय नुकसान का उत्पादन करने के लिए। प्रक्रिया न्यूनतम इनवेसिव है। उल्लेखनीय रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल घटाने सर्जरी के एक महीने के भीतर मापा जाता है। इस विधि को मोतियाबिंद के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इस पद्धति का एक संभावित सीमा अतितनावी खारा के मैनुअल इंजेक्शन है। इस मैनुअल विधि के कारण, यह महान परिणामों में परिवर्तनशीलता उम्मीद करने के लिए संभव है। हालांकि, हम नस में blanching प्रभाव की पहचान की है एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है। blanching होता है, रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल नुकसान 18 और 29% के बीच हमेशा होता है। इस का समर्थन करने के लिए, सभी भविष्य के अध्ययनों modi कर सकता हैवित्तीय वर्ष प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए कि इन इंजेक्शनों IOP। 29,31 में एक औसत दर्जे वृद्धि को बढ़ावा दिनचर्या IOP माप शामिल करने के लिए। शायद RGC मौत के इस मॉडल एक और पूरी न्यूरोप्रोटेक्टिव इलाज है कि दुनिया भर के लाखों लोगों को प्रभावित करने वाले विनाशकारी दृश्य हानि combats के विकास को बढ़ावा मिलेगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

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Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

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